BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna
dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu
cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah
dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangkaian pengecatan (Pratiwi,S. 2008).
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu
berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang
terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari
berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose,
Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia
gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat
menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga akan
digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan oleh bakteri
Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok
Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut
bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin)
sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat
berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan
pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat,
sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang
sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin
dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin
dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol
warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur
dan mengambil warna biru dari methylen blue (Dwidjoseputro, 2005).
Sebagai tenaga analis kesehatan dibutuhkan keterampilan dalam membuat
spesimen yang berguna dalam pemeriksaan spesimen di laboratorium. Bakteri
umumnya memiliki warna yang transparan maka dari itu diperlukan pewarnaan bakteri
agar bentuk dan struktur bakteri dapat terlihat lebih jelas jika diamati dengan
 mikroskop cahaya. Hal tersebut yang melatarbelakangi penulis untuk mengangkat
permasalahan ini sebagai masalah yang akan dibahas dalam laporan praktikum
dengan judul “Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) ”.

B. Tujuan
Untuk dapat Melihat bentuk (morfologi) dan sifat tahan asam pada dari bakteri.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hamper tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan. Salah satu cara unutk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di identifikasi adalah dengan cara metode
pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya
yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan
(Dwidjoseputro, 2005).
Bakteri juga merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain
mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air.
Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi
hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk
mempernudah dalam proses identifikasi bakteri (Pratiwi,S. 2008).
Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni.
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya
dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993).
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam
identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel
bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai
mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan.
Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi
enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi
tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang
mana menghasilkan perubahan warna reagen (Pratiwi, S. 2008).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk
tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000
X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat
berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk
hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu
elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan
suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran,
bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat
berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).

Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri
itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara
keseluruhan mungkin berwarna (Volk dan Whleer, 1998).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna
pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna
pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-
bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural
hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan
kapsul ( Pelczar, 2007 ).

Prinsip dasar dari teknik pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion
dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan
diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal,
pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram
merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri
(Volk & Wheeler, 1984).
Pewarnaan diferensial artinya pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam zat
warna, seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Sedangkan pewarnaan khusus
artinya pewarnaan yang dipakai untuk mewarnai bagian-bagian sel atau bakteri tertentu yang
sukar diwarnai dengan menggunakan pewarnaan biasa. Pewarnaan khusus dipakai untuk
mewarnai bagian-bagian sel kuman atau kuman tertentu yang sukar diwarnai (Fardiaz, 1992).

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga
tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan
asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan
zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya
bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri
Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil
pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia
juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang
masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988).

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan
anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki
dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri
ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan
impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika
proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga
bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filament.

Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan
bakteri gram positif. Namun, sekali mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka
warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria
disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga
memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan
protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan
dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan
permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik.

Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria,

berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat
bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8
dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga
lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida (Thomas, 1999).

Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau

pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu
optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan
tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan,
basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media
buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain.
Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh
alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat
diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen.

Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif.
Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi
yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media
nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media
telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001).

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi

beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada
aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada
sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk
saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk
menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada
bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada
bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten
terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum
kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang
optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).

Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun
Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk analisis
tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum:

Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.
Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.
Collection sputum : sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam
Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol

fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama,
yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin
basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada
sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke
dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori
lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan
pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri
kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan.
BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan
melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah
penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna
biru (Lay, 1994).
 Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-
Neelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :

1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan
asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak
tahan asam (non acid fast).

Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai

sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi
sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang
kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga
bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop
fluorescens (Kurniawati et al., 2005).

Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol fuchsin 0,3%, serta
methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam alkohol
digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin agar
menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis.
Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri
akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980).

 Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.

 Positif: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 100 lapang pandang.
 Positif 1: apabila terdapat 10 – 90 BTA / 100 lapang pandang.
 Positif 2: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 1 lapang pandang.
 Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang
 BAB III

METODE PRAKTIKUM

A. Hari dan Tanggal

Praktikum pemeriksaan sputum dilakukan pada hari Kamis, 14 Februari 2019 pukul
08.00 s/d selesai di Laboratorium B Stikes Wiyata Husada Samarinda
B. Alat dan Bahan
Alat:
a. Kaca Preparat hapus dari sputum penderita 1 yang sudah difiksasi.
b. Satu obor kecil yang terdiri dari kapas yang dipintal pada ujung kawat.
c. Pipet Tetes 3 buah.
d. Mikroskop.
e. Korek api.
f. Pensil warna (merah,biru, dan ungu).
Bahan:
a. Satu set pewarnaa Ziehl-Neelsen, yang terdiri dari :
1. Larutan karbol fuchsin
2. Alkohol asam
3. Larutan methylen blue
b. Spiritus.
c. Kertas saring atau tissue.
C. Prinsip
Adapun prinsip dasar dari pewarnaan ini yaitu berdasarkan pada Dinding
bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat.
Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat
ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka
akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak
dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna
biru dari methylen blue.
D. Prosedur Pemeriksaan
- Letakkan kaca benda tersebut mendatar pada rak pewarnaan dan tuangi dengn
larutan krbol fuchsin sampai seluruh kaca benda tergenang dengan zat warna.
- Panasi zat warna tersebut sampai menguap, dinginkan dan panasi lagi. Hal tersebut
diulangi sebanyak 3 kalu dalam 10 menit.
- Cuci dengan air mengalir.
- Lunturkan dengan alcohol asam 3 %. Pelunturan dilakukan sampai preparat Nampak
berwarna merah muda.
- Segera cuci dengan air mengalir.
- Beri zat warna kontras, yaitu larutan methylen blue 0,5%, selama 1 menit.
- Cuci dengan air mengalir.
- Keringkan dengan kertas isap dan lihat dibawah mikroskop dengan penambahan oil
emersi.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Tabel 1. Lapang pandang pada pengamatan preparat BTA
Lensa objektif pembesaran
Lensa objektif pembesaran 100X
10X

Ditemukan BTA
BTA belum terlihat
dengan warna merah bentuk basil

Tabel 2. BTA yang terlihat pada setiap lapang pandang hasil pengamatan dengan lensa
objektif pembesaran 100X
Lapang pandang Lensa objektif Jumlah BTA
ke- pembesaran 100X yang ditemukan

1 4

2 2
Lapang pandang Lensa objektif Jumlah BTA
ke- pembesaran 100X yang ditemukan

3 7

4 20

5 13
B. Pembahasan
1.2.1. Pembuatan dan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)
Pada praktikum kali ini dilakukan pengecetan Bakteri Tahan Asam (BTA)
yang menggunakan tiga jenis cat Ziehl Neelson (ZN) yaitu carbol fuchsin 0,3 %,
asalm alcohol 3 % dan methylene blue 3 %. Dalam pengecatan ini digunakan
sample sputum.
Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak
yang menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain
yang ada pada objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar
bakteri tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri
menjadi lebih mudah, tetapi apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis.
Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna,
kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Akan
tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya bakteri-bakteri TBC
dan basil-basil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa itu adalah bakteri tahan
asam. Untuk menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam dan
bakteri tidak tahan asam harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Pada
umumnya, bakteri tahan asam merupakan bakteri yang lapisan paling luar selnya
terdiri dari lapisan lilin, sehingga menyebabkan zat warna sukar masuk ke dalam
sel bakteri.
Hal inilah yang mendasari dilakukannya percobaan pewarnaan bakteri
tahan asam (BTA). Pewarnaan BTA merupakan pewarnaan yang dilakukan untuk
mengidentifikasi Bakteri Tahan Asam. Pewarnaan ini tidak spesifik untuk
Mycobacterium tuberculosis karena hasil pewarnaan BTA juga akan positif
terhadap genus Mycobacterium lain. Bakteri BTA berwarna merah dan bakteri non
BTA berwarna biru atau ungu.
Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak
yang menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain
yang ada pada objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar
bakteri tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri
menjadi lebih mudah, tetapi apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis.
Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson
yng menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :
Pada Pewarnaan pertama ini dengan menggunakan zat warna Carbol
Fuchsin. Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol
untuk membantu melarutkan dinding sel. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk
membantu pemasukan zat warna kedalam sel bakteri sewaktu proses
pemanasan. Tujuan memberikan pewarna karbol fuksin adalah untuk mewarnai
seluruh sel bakteri. Setelah memberikan pewarna karbol fuksin kemudian di
panaskan di atas penangas air, tetapi jangan sampai terlalu panas, mendidih atau
kering. Tujuan dari memanaskan sampel di atas penangas air yaitu supaya
pewarna karbol fuksin masuk menembus dinding sel bakteri, karena dinding
bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar di tembus
pewarna bakteri. Karena pengaruh fenol dari pewarna karbol fuksin dan juga
pemanasan maka lapisan lilin dan lemak dapat ditembus pewarna karbol fuksin.
Dengan pemanasan menyebabkan pelebaran pori – pori lemak bakteri
tahan asam sehingga pewarna karbol fuksin dapat masuk sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat, dan zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Menunggu
selama 10 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan dilakukan
pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna pada
dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula setelah dilakukan
pemanasan. Setelah 10 menit dibilas dengan aquades. Pencucian dengan
menggunakan aquades mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya.
Kemudian sampel di tetesi asam alkohol 3 % dan didiamkan selama 30
detik. Penambahan alkohol ini berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat
warna (decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri
sudah mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan
kembali tertutup dalam pada suhu semula. Sehingga sebelum dilakukan
penambahan asam alcohol ditunggu sampai 10 menit. Saat penambahan asam
alcohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan dilunturkan kembali warna carbol
fuchsin tersebut karena tidak mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA.
Bakteri tahan asam pada saat dicuci dengan asam alkohol warna karbol
fuksin tidak lepas atau hilang, sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan
lepas atau hilang. Menunggu selama ½ menit setelah penambahan larutan asam
alkohol bertujuan agar zat warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada
yang tersisa. Dan setelah 30 detik dicuci kembali dengan air mengalir atau
aquadest.
Setelah itu, sampel di tetesi atau di genangi dengan pewarna tandingan
metilen biru dan didiamkan selama 1 menit. Methylene Blue merupakan pewarna
tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-
sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam
alkohol. Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang
permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA
terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA
 tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat
masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Menunggu selama 1 menit
setelah penambahan pewarna methylene blue bertujuan agar cat ini dapat diserap
sempurna pada dinding bakteri non BTA sehingga ada perbedaan warna antara
bakteri BTA dan Non BTA.
Kemudian, setelah didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan air
mengalir atau aquadest. Objek yang telah dibasuh aquades kemudian dikeringkan
dengan menggunakan kertas saring atau tissue, tidak ditiup-tiup karena
dikhawatirkan ada kontaminasi bakteri lain yang menempel pada objek glass.
Waktu yang dipelukan untuk menunggu setiap warna juga berbeda. Hal ini
dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan pada saat pembacaan preparat
pada mikroskop.
1. Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin
dan dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat
sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula
setelah dilakukan pemanasan.
2. Menunggu selama ½ menit setelah penambahan larutan asam alkohol
bertujuan agar zat warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang
tersisa.
3. Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene blue
bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BTA
sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan

terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.
Sampel yang sudah di keringkan, di tetesi dengan emersi oil. Minyak emersi
adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk
memperjelas objek, dan melindungi mikroskop dari debu atau kotoran. Minyak
emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air, sehingga
objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak
emersi. Lalu diamati dengan mikroskop, dengan pembesaran 10X dan 100X.

1.2.2. Hal yang perlu diperhatikan

 Fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna
yang tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol
jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization
sehingga sel BTA hampir sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit
membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol
(underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna
sehingga sel Non BTA bisa saja berwrna ungu mendekati warna sel BTA.
Kaca obyek harus selalu dicuci dengan aquades diantara penambahan
pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna
berikutnya.

1.2.3. Faktor yang membedakan BTA dan Non BTA

Perbedaan mendasar antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada
komponen dinding selnya. Dinding sel BTA mengandung lapisan lilin (lapisan
lemak) yang sangat banyak sehingga dalam proses penyrapan warna perlu
dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel tersebut sehingga
pewarna dapat diserap. Namun dalam dinding sel bakteri non BTA lapisan
lemaknya tidak banyak sehingga untuk melakuka penyerapan warna tidak
perlu dilakukan pemanasan dan pelunturan warna pun sangat mudah
dilakukan saat penambahan asam alkohol.

1.2.4. Pengamatan preparat pewarnaan BTA

Pada pengamatan dengan mikroskop lensa objektif pembesaran 10X
terlihat lapang pandang berwarna ungu, ditemukan sel epitel tenggorokan yang
terkelupas saat pasien mengeluarkan sputum, dan sel bakteri belum terlihat.
Pada pengamatan dengan mikroskop lensa objektif pembesaran 100X
terlihat sel epitel yang ukurannya semakin besar, dan ditemukan bakteri BTA
berwarna merah dan bakteri non BTA berwarna biru. Pada preparat sputum
ditemukan :
1. Bakteri BTA berbentuk streptobasil.
2. Bakteri BTA berbentuk basil.
3. Bakteri BTA berbentuk coccus.
Dari hasil tersebut dapat didiagnosa bahwa sputum tersebut 2+.
 BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan pada percobaan kali ini, maka dapat kami
dapat tarik kesimpulan bahwa pada preparat sputum yang diuji cobakan telah
ditemukan bakteri tahan asam (BTA) berbentuk Basil berwarna merah. Dengan latar
belakang berwarna biru. Dari hasil tersebut dapat di diagnosa bahwa sputum tersebut
2+.
B. Saran
DAFTAR PUSTAKA

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons, New York.
Dwidjoseputro,D. 2005. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan dan Sekolah
Tenaga Kesehatan Yang Sederajat. Bandung : Citra Aditya Bakti.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.
Jawetz, Melnick, Adelberg’s. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba Medika.
Jutono, dkk. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi.
Yogyakarta: Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM.
Kurniawati et al., 2005.Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen, dan fluorokrom sebagai
Metode Pewarnaan Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopis Sputum.
Makara Kesehatan. Vol 9, June 2005 : 29-33.
Lay, Bibiana.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Rajawali.
Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.
Pelczar, and Chan M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Thomas Dormandy (1999). The White Death: A History of Tuberculosis. ISBN 0-8147-1927-
9 HB - ISBN 1-85285-332-8 PB
Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta :
Erlangga.