PENGUJIAN MIKROBIOLOGI “VERIFIKASI METODE ANALISIS MOST

PROBABLE NUMBER (MPN) COLIFORM PADA PRODUK SWEETENER

CAIR”
 BAB III
TINJAUAN PUSTAKA
3.1. Bakteri Coliform
Bakteri Coliform merupakan golongan mikroorganisme yang lazim digunakan sebagai
indikator dimana bakteri ini dapat menjadi sinyal untuk menentukan suatu sumber air telah
terkontaminasi oleh patogen atau tidak. Berdasarkan penelitian, bakteri Coliform ini menghasilkan
zat etionin yang dapat menyebabkan kanker. Selain itu, bakteri pembusuk ini juga memproduksi
bermacam-macam racun seperti indol dan skatol yang dapat menimbulkan penyakit bila jumlahnya
berlebih di dalam tubuh (Pracoyo NE et al. 2006).
Ciri-ciri bakteri Coliform antara lain bersifat aerob atau anaerob fakultatif, termasuk ke dalam
bakteri gram negatif, tidak membentuk spora, dan dapat memfermentasi laktosa untuk
menghasilkan asam dan gas pada suhu 35 °C-37 °C. Contoh bakteri Coliform antara lain
Escherichia coli, Salmonella spp., Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, dll. (Astuti 2014).

3.2. Sweetener cair

Sweetener substitute atau pemanis pengganti adalah bahan yang digunakan untuk memberikan
rasa manis pengganti gula (sucrose) pada produk pangan. Penggunaan Sweetener substitute
bertujuan untuk mengurangi konsumsi gula alami (sukrosa) yang sering kali menyebabkan
masalah kesehatan apabila dikonsumsi terlalu banyak. Salah satu Sweetener substitute adalah
kelompok High Intense Sweetener (HIS). Penggunaan HIS lebih sedikit dibandingkan dengan
penggunaan gula alami (sukrosa) karena memiliki tingkat kemanisan yang lebih tinggi dari gula.
Sweetener substitute dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok besar yaitu alami dan buatan
(Anonim 2012).
3.3. Lauryl Sulphat Tryptose Broth (LSTB)
Lauryl Sulphat Tryptose Broth adalah sebuah media untuk mendeteksi organism Coliform
dalam air dan air buangan.
Lauryl merupakan media selektif yang digunakan untuk mendeteksi Coliform dalam air,
produk dairy dan beberapa makanan. American Public Health Association menyarankan lauryl
digunakan dalam uji pendugaan Coliform yang dapat mendeteksi fermentasi laktos sehingga
memproduksi gas. Lauryl Tryptose broth didisain sebagai media pengkaya dan penghasilan gas
 berlimpah dari inokulasi Coliform. Pertumbuhan bakteri sporing aerobik dengan sepenuhnya
terhambat (Anonim 1980).
3.4. Definisi MPN
Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi
(confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan
Coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah dan masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi
sifat fermentatif Coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain Coliform juga
memiliki sifat fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya
Coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil
tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-
ciri Coliform yaitu berbentuk batang, Gram negatif, tidak berspora (Krisna 2005).
Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi
oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat
dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil
(tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik yang membentuk
gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih
banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung
reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005).
 BAB IV
ALAT DAN METODOLOGI
4.1. Alat
4.1.1. Biological Safety Cabinet (BSC)
4.1.2. Autoclave
4.1.3. Oven
4.1.4. Inkubator
4.1.5. Tabung reaksi
4.1.6. Tabung durham
4.1.7. Lemari pendingin (refrigerator)
4.1.8. Vortex
4.1.9. Hotplate Stirrer
4.1.10. Mikro Pipet dan Mikro Tips
4.1.11. Colony Counter
4.1.12. Cawan Petri
4.1.13. Botol Schott atau Erlenmeyer
4.1.14. Stirrer
4.1.15. Alat timbang
4.2. Bahan
4.2.1. Sampel
4.2.2. Kultur Murni Bakteri E. coli ATCC 25922
4.2.3. VRB
4.2.4. Media Lauryl Sulphat Tryptose Broth (LSTB)
4.2.5. Media Brillian Green Lactose Bile Broth (BGLBB)
4.2.6. Alkohol 70%
4.2.7. Buffered Pepton Water (BPW)
4.3. Analisa
4.3.1. Pemilihan mikroba uji
4.3.2. Penyegaran kultur
a. Mengambil bakteri yang telah ditentukan.
b. Mengambil 1 loop bakteri dari biakan murni dalam NA.
 c. Menginkubasi pada suhu 35oC selama 1 hari (± 24 jam).
d. Mengambil 1-2 ose bakteri ke dalam BPW 45 ml.
e. Menghomogenkan dengan magnetic stirrer.
f. Menginkubasi pada suhu 35oC selama 1 hari (± 24 jam).
Pertumbuhan yang terjadi ditandai dengan perubahan penampakan larutan pengencer yang
akan tampak keruh bila mikroba di dalamnya tumbuh, dan akan tetap jernih bila mikroba
tersebut tidak tumbuh.
4.3.3. Screening
a. Menghomogenkan kultur yang telah disegarkan. Kultur yang digunakan pada screening ini
adalah kultur yang sebelumnya telah dilakukan penyegaran.
b. Membuat kontrol awal negative dengan cara memipet 1 ml pengencer kemudian di-platting
menggunakan media SPC.
c. Membuat kontrol media SPC dan VRB.
d. Mengambil 1 ml kultur untuk dimasukkan ke dalam larutan pengencer BPW 9 ml untuk
memperoleh tingkat pengenceran 10-1.
e. Menghomogenkan di atas vortex.
f. Mengambil 1 ml untuk di-platting ke dalam cawan petri secara duplo.
g. Dari tingkat pengenceran 10-1 diambil 1 ml untuk dimasukkan ke dalam larutan pengencer BPW
9 ml untuk memperoleh pengenceran 10-2. (Pengenceran dilakukan sampai tingkat pengenceran
10-10).
h. Menghomogenkan di atas vortex.
i. Mengambil masing-masing 1 ml untuk dimasukkan ke dalam 4 buah cawan petri.
j. Membuat kontrol akhir negative.
k. Menambahkan media PCA dan VRB sebanyak 12-15 ml pada masing-masing cawan petri.
l. Membiarkan beberapa saat hingga membeku.
m. Menginkubasi pada suhu 35oC selama 2 hari (± 48 jam) untuk media SPC dan 24 jam untuk
media VRB.
Hasil dari perhitungan TPC inilah yang kemudian digunakan untuk melakukan spiking pada
tingkat pengenceran yang dikehendaki yang sebelumnya telah dihitung terlebih dahulu. Hasil
screening E. coli menunjukkan jumlah mikroba yang masuk ke dalam range 25-250 cfu adalah
pada tingkat pengenceran 10-6. Sehingga tingkat pengenceran yang digunakan untuk melakukan
 spiking E. coli adalah pada tingkat pengenceran 10-5 untuk spike tinggi dan pada tingkat
pengenceran 10-6 untuk spike rendah.

4.3.4. Spiking
Timbang 10 gram sampel ke dalam Erlenmeyer atau Schott duran yang berisi 90 ml
Buffered Peptone Water (BPW) lalu dihomogenkan di atas magnetic stirrer dengan kecepatan
500-700 rpm selama ± 5 menit, masukkan 1 ml suspensi bakteri (spike) Escherichia coli yang
telah diketahui jumlahnya (pengenceran 10-6) ke dalam sampel kemudian dihomogenisasi
kembali dan dilakukan sebanyak 15 kali pengulangan. Kemudian timbang 1 kali sampel tanpa
dilakukan penambahan spike yang digunakan sebagai blanko. Sebagai pembanding dilakukan
juga penambahan spike ke dalam BPW 100 ml tanpa sampel yang digunakan sebagai spike only.
a. Uji Pendugaan
1) Pipet 1 ml suspensi ke dalam 3 tabung lauryl yang berisi tabung durham sebagai pengenceran
10-1.
2) Pipet 1 ml suspensi ke dalam BPW 9 ml sebagai pengenceran 10-2 kemudian pipet 1 ml ke
dalam 3 tabung lauryl yang berisi tabung durham.
3) Pipet 1 ml suspensi pengenceran 10-2 ke dalam BPW 9 ml sebagai pengenceran 10-3 kemudian
pipet 1 ml ke dalam 3 tabung lauryl yang berisi tabung durham.
4) Menghomogenkan secara perlahan pada seluruh tabung agar sampel menyebar rata keseluruh
media.
5) Menginkubasikan seluruh tabung pada suhu 350C selama 48 jam.
6) Mengamati adanya gelembung udara di dalam tabung durham dan mencatat kode tabung yang
positif mengeluarkan gas. Hasil positif dinyatakan apabila timbul kekeruhan dan terbentuknya
gelembung minimal 10% dari volume atau tinggi tabung durham.
b. Uji Penegasan
1) Mengambil sampel dari tabung Lauryl yang positif kemudian memasukkan sebanyak 0,1 ml
sampel ke dalam tabung BGLBB untuk pemeriksaan total Coliform.
2) Menginkubasi media BGLBB pada suhu 35oC selama 48 jam.
3) Mencatat jumlah tabung yang menunjukkan tes penegasan positif.
4) Menentukan nilai MPN Coliform berdasarkan tabel MPN yang terdapat pada lampiran.
4.3.5. Perhitungan
Tabel 1.Perhitungan Parameter Kualitatif
 Konfirmasi Dugaan
Positif Negatif
Positif A (positif) B (false negatif)

Sensitifitas Negatif C (false D (negatif) : A/ (A + B) x

positif)
100%
Spesifisitas : D/ (C+ D) x 100%
False Positive Rate : C/ (A + C) x 100%
False Negative Rate : B/ (B + D) x 100%
Efisiensi : (A + D) /n x 100%
n : jumlah sampel
 BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Hasil Pengamatan

5.1.1. Hasil data Screening Kultur Bakteri Coliform
Tabel 2. Hasil screening
No PENGENCERAN SPC VRB
Simplo Duplo rata- Simplo Duplo rata-
rata rata
1 0 TBUD TBUD TBUD TBUD
2 -1 TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD
3 -2 TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD
4 -3 TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD
5 -4 TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD
6 -5 TBUD TBUD TBUD 1256 1280 1268
7 -6 174 224 199 157 133 145
8 -7 50 29 39.5 78 77 77,5
9 -8 2 7 4,5 3 4 3,5
10 -9 0 0 0 0 0 0
11 -10 0 0 0 0 0 0
12 kontrol media 0 0
13 kontrol awal 0
14 kontrol akhir 0

Dari tabel di atas dapat diketahui bahwa pengenceran 10-6 adalah data yang masuk ke dalam
standar yaitu 25-250 koloni. Dari hasil tersebut kemudian dilakukan pendekatan untuk mengetahui
perkiraan jumlah koloni dalam kultur murni (pengenceran nol).
Tabel 3. Perkiraan pengenceran
Pengenceran Perkiraan Pendekatan
Koloni
0 199000000 1990000
-1 19900000 199000
-2 1990000 19900
-3 199000 1990 spike tinggi
-4 19900 199 spike sedang
-5 1990 19,9 spike rendah
-6 199 1,99
 Dan dari perhitungan di atas diketahui bahwa spike yang masuk dalam standar (25-250) dan
dapat digunakan dalam 100 ml pengenceran ada pada spike 10-4. Dengan jumlah 199 koloni dalam
1 ml spike. 199 koloni per ml dihitung dengan rumus:

Jumlah koloni/1ml =

Misal, jumlah koloni dari pengenceran 10-4

= 199 koloni/ml
5.1.2. Hasil Pra Verifikasi dengan 3 kali pengulangan dan Verifikasi metode sebanyak 15 kali
pengulangan.
Tabel 4. Hasil spike tiga kali pengulangan
Kode Pengenceran LSTB MPN/g
Sampel 1 2 3
-1
only 10 - - - <3
sampel 10-2 - - -
10-3 - - -
-1
only spike 10 + + + >1100
-3 10-2
+ + +
10-3 + + +
only spike 10-1 + + + >1100
-4 10-2 + + +
10-3 + + +
-1
only spike 10 + + + 460
-5 10-2 + + +
10-3 + - -
sampel & 10-1 + + + 1100
spike -3 A 10-2 + + +
-3
10 + + -
-1
sampel & 10 + + + 460
spike -3 B 10-2 + + +
10-3 + - -
sampel & 10-1 + + + 240
spike -3 C 10-2
+ + +
 10-3 - - -
sampel & 10-1 + + + >1100
spike -4 A 10-2 + + +
10-3 + + +
-1
sampel & 10 + + + >1100
spike -4 B 10-2
+ + +
10-3 + + +
sampel & 10-1 + + + 1100
spike -4 C 10-2 + + +
10-3 + + -
-1
sampel & 10 + + + 1100
spike -5 A 10-2 + + +
10-3 + + -
sampel & 10-1 + + + 460
spike -5 B 10-2 + + +
-3
10 + - -
-1
sampel & 10 + + + 240
spike -5 C 10-2 + + +
10-3 - - -
Tabel 5. Hasil 15 kali pengulangan

Kode Pengenceran LSTB BGLBB MPN/g

Sampel 1 2 3 1 2 3
only 10-1 - - - <3
sampel 10-2 - - -
10-3 - - -
-1
only 10 + + + + + + 150
spike 10-2 + + - + + -
10-3 + - - + - -
B1 10-1 + + + + + + 23
10-2 + - - + - -
-3
10 - - - - - -
-1
B2 10 + + + + + + 23
10-2 + - - + - -
 10-3 - - - - - -
B3 10-1 + + + + + + 23
10-2 + - - + - -
10-3 - - - - - -
-1
B4 10 + + + + + + 43
-2
10 - - - - - -
10-3 - - - - - -
B5 10-1 + + + + + + 150
10-2 + - - + - -
10-3 - - - - - -
-1
B6 10 + + + + + + 43
10-2 - - - - - -
10-3 - - - - - -
B7 10-1 + + + + + + 43
10-2 - - - - - -
-3
10 - - - - - -
-1
B8 10 + + + + + + 75
10-2 - - - - - -
10-3 - - - - - -
B9 10-1 + + + + + + 75
-2
10 - - - - - -
-3
10 - - - - - -
B10 10-1 + + + + + + 93
10-2 + - - + - -
10-3 - - - - - -
B11 10-1 + + + + + + 75
-2
10 - - - - - -
10-3 - - - - - -
B12 10-1 + + + + + - 23
10-2 + - - - - -
10-3 - - - - - -
-1
B13 10 + + + + + + 23
-2
10 - - - - - -
 10-3 - - - - - -
B14 10-1 + + - + - - 9
10-2 + - - + - -
10-3 - - - - - -
-1
B15 10 + + + + + + 23
-2
10 - - - - - -
10-3 - - - - - -
5.1.3 Hasil Perhitungan Sensitifitas, Spesifisitas, False Positive Rate, False Negative Rate dan
Efisiensi Data Pengujian Coliform pada pengenceran (10-6)

Tabel 6. Data hasil presumtif tes pada konsentrasi pengenceran (10-6)

Konfirmasi Dugaan
Positif Negatif
Positif A. Positif B. False Negative
51 tabung 0 tabung

Negatif C. False Positive D. Negatif

3 tabung 84 tabung

Sensitifitas : 51/ (51 + 0) x 100% = 100%

Spesifisitas : 84/ (3+ 84) x 100% = 96.55%
False Positive Rate : 3/ (51 + 3) x 100% = 5.5%
False Negative Rate : 0/ (0 + 84) x 100% = 0%
Efisiensi : (51 + 84) /135 x 100% = 100%
Jumlah tabung : 135 tabung
5.2. Pembahasan
Pada pengujian verifikasi metode analisis Most Probable Number (MPN) Coliform pada
produk sweetener cair ini ada beberapa tahap yang dilakukan yaitu pemilihan mikroba uji,
penyegaran kultur, screening, spiking, dan perhitungan data. Tahap pertama yaitu pemilihan
mikroba uji yang termasuk dalam golongan bakteri Coliform. Digunakan bakteri Escherichia coli
karena termasuk dalam bakteri Coliform fecal keluarga Enterobacteriaceae dengan nomor ATCC
25922. Sedangkan sampel yang digunakan adalah sweetener cair.
Dari sediaan kultur selanjutnya dilakukan penyegaran kultur. Penyegaran kultur disini
dilakukan dengan cara mengambil 1 loop bakteri dari biakan murni dalam NA (diinkubasi pada
suhu 35oC selama 1 hari (±24 jam)). Kemudian dimasukkan dalam BPW 45 ml dan diinkubasi
pada suhu 35oC selama 1 hari (±24 jam). Hal ini bertujuan agar bakteri yang ditumbuhkan mampu
tumbuh optimal sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa family Enterobacteriaceae tumbuh
optimum pada suhu 35oC.
 Selanjutnya adalah screening yang dilakukan dengan cara membuat deret pengenceran dari
10-1 sampai 10-10 yang kemudian dipipet 1 ml dari masing-masing pengenceran kemudian di-
platting secara duplo menggunakan media SPC dan VRB kemudian diinkubasi pada suhu 35 oC
selama 1 hari (±24 jam) untuk media VRB dan selama 2 hari (±48 jam) untuk media SPC. Dari
jumlah koloni yang didapat dari masing-masing pengenceran kemudian diambil data jumlah koloni
antara 25-250 cfu.
Dari tabel 6 (hasil screening) dapat dilihat jumlah koloni yang masih masuk dalam range 25-
250 cfu pada tingkat pengenceran 10-7. Kemudian dilakukan perhitungan untuk dimasukkan dalam
tahap spiking. Perhitungan disini dilakukan dengan cara menghitung rata-rata dari jumlah kedua
plate tersebut, kemudian dilakukan pendekatan jumlah koloni. Misalnya, bila pada pengenceran
10-7 didapatkan jumlah koloni 199 koloni per 1 ml, maka diperkirakan jumlah koloni pada 10-6
adalah 1990 koloni per 1 ml, dan seterusnya.
Pada tahap spiking ini dilakukan dengan memasukkan bakteri ke dalam matriks produk.
Setelah diketahui perkiraan jumlah koloni per 1 ml dari tiap pengenceran perlu dilakukan
perhitungan untuk mendapatkan jumlah koloni yang diharapkan. Berdasarkan hasil perhitungan,
spike bakteri yang dimasukkan pada tingkat pengenceran 10 -4 dengan perkiraan jumlah koloni
yang akan tumbuh adalah sekitar 199 koloni bila pada matriks produk ditambahkan spike sebanyak
1 ml.
Pada pengujian MPN terdapat 3 teknik pengujian yaitu uji penduga, uji penguat, dan uji
pelengkap. Pada uji pendugaan dilakukan dengan menginkubasi sampel yang telah dimasukkan ke
dalam tabung reaksi yang berisi medium Lauryl dan tabung durham. Lauryl digunakan sebagai
media untuk mendeteksi kehadiran Coliform dalam sampel dan mempelajari fermentasi laktosa
oleh bakteri pada umumnya, karena dalam Lauryl terdapat laktosa yang menyediakan sumber
karbohidrat yang dapat difermentasi oleh organisme Coliform. Pada tabung reaksi diletakkan
tabung durham secara terbalik, fungsi dari tabung durham adalah untuk mengetahui terbentuknya
gas gelembung atau untuk menangkap gas yang ditimbulkan akibat adanya fermentasi laktosa
menjadi asam dan gas. Hasil dari uji ini menunjukkan bahwa sebagian besar media Lauryl
menghasilkan hasil positif yaitu terdapat gelembung ≥ 10% dari timggi tabung durham.
Uji penegas berfungsi untuk meyakinkan hasil positif yang ada pada uji pendugaan. Medium
yang digunakan dalam uji penegasan ini adalah medium Brilliant Green Lactase Bile Broth
(BGLBB) yaitu media yang akan berwarna hijau metalik jika terdapat reaksi fermentasi dengan
sampel. Warna ini berasal dari adanya koloni Coliform yang bereaksi dengan BGLBB. E. coli
merupakan bakteri fermentasi, seringkali menghasilkan warna hijau metalik mengkilap.
Penggunaan BGLBB berfungsi sebagai penghambat pertumbuhan flora mikroba yang tidak
diharapkandan untuk mendeteksi bakteri Coliform yang ada pada sampel. Pada uji ini terdapat
beberapa tabung yang menghasilkan hasil negative, hal ini diperkirakan karena sampel tidak
sepenuhnya masuk ke dalam media BGLBB sehingga hanya sedikit bakteri yang memfermentasi
laktosa dan gelembung yang dihasilkan kurang dari 10% tinggi tabung durham. Pada verifikasi ini
tidak dilakukan uji penegasan karena pengujian yang dilakukan dalam laboratorium hanya sampai
uji penguat Coliform saja.
Dari tahap spiking yang dilakukan, telah diperoleh sehingga dapat dihitung nilai Sensitifitas,
Spesifisitas, False Positive Rate, False Negative Rate, dan Efisiensinya.
Berdasarkan hasil pengujian verifikasi sampel sweetener cair pada pengenceran 10-6 diperoleh
hasil bahwa nilai Sensitifitas sebesar 100%, spesifitas sebesar 96.55%, False Positive Rate
sebanyak 5.5%, False Negative Rate sebesar 0%, Efisiensi sebesar 100%.
Didapat nilai spesifitas sebesar 96,5% karena nilai negatif palsu ada 3, yaitu jumlah sampel
yang negatif pada uji penguat. Hal ini terjadi kemungkinan karena sampel tidak sepenuhnya masuk
ke dalam media BGLBB, sehingga fermentasi yang dilakukan bakteri Coliform tidak
menghasilkan gelembung minimal 10% dari tinggi tabung durham. Namun data ini masih
memenuhi syarat karena minimal nilai spesifisitas yang diperbolehkan yaitu minimal sebesar 95%.
Begitu pula dengan False Positive Rate yang merupakan persentase jumlah sampel yang salah
identifikasi sebagai positif menghasilkan nilai sebesar 5,5 % juga masih memenuhi syarat.
Sedangkan nilai Sensitifitas yang mendekati 100% menandakan bahwa hasil analisa bagus karena
merupakan prosentase kebenaran hasil analisa yang positif. Dan nilai False negative rate yang
mendekati 0% juga memberikan hasil yang bagus karena menandakan bahwa hasil analisa tidak
ada yang salah.
Sehingga dapat dikatakan bahwa verifikasi metode pengujian Coliform pada sampel
sweetener cair secara kualitatif ini telah baik. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa
metode ini valid dan dapat digunakan di laboartorium PT NUTRIFOOD Indonesia karena
memenuhi persyaratan pada setiap parametern