protocol

Metode Untuk Isolasi Jamur Endofit Yang Berasal

Dari Laut dan Produk Bioaktif Sekunder
Julia Kjer, Abdessamad Debbab, Amal H Aly & Peter Proksch

Institut für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, Germany. Correspondence should be addressed
to P.P. (proksch@uni-duesseldorf.de).

Published online 18 February 2010; doi:10.1038/nprot.2009.233

Beberapa tahun terakhir Jamur laut telah menunjukkan hasil dari sejumlah besar metabolit sekunder bioaktif baru., beberapa
di antaranya menampilkan kerangka karbon baru yang sampai saat ini belum pernah terjadi sebelumnya di alam. Senyawa ini
http://www.nature.com/natureprotocols

terbilang menarik sebagai struktur penuntun baru untuk obat serta untuk perlindungan tanaman. Tujuan penelitian ini adalah
untuk memberikan deskripsi terperinci mengenai metode yang berguna untuk isolasi dan budidaya jamur terkait dengan
berbagai organisme laut (spons, ganggang dan tanaman bakau) untuk ekstraksi, karakterisasi dan penjelasan struktur dari
metabolit sekunder aktif secara biologis yang dihasilkan oleh jamur endofit yang berasal dari laut, dan untuk evaluasi awal
sifat-sifat farmakologisnya berdasarkan pada sistem skrining 'in-house' yang cepat. Beberapa hasil yang menunjukkan hasil
positif dari peneitian dipaparkan pada bagian akhir. Dari pengambilan sampel di lingkungan laut hingga penyelesaian
penjelasan struktur dan skrining bioaktivitas, periode minimal 3 bulan yang harus dijadwalkan

PENDAHULUAN
Jamur daratan telah lama dikenal sebagai sumber yang kaya akan
metabolit sekunder yang aktif secara biologis. Sejak ditemukannya
penisilin oleh Sir Alexander Fleming pada tahun 1928, Hal ini
© 2010 Nature Publishing Group
mikro-organisme laut termasuk bakteri, cyanobacteria, mikroalga
dan jamur telah menjadi sumber penting dari metabolit aktif
farmakologis yang baru. Ulasan terbaru menunjukkan pentingnya

menjadi terobosan dalam pengobatan infeksi bakteri dan jamur
yang telah menjadi sumber obat penting untuk pengobatan berbagai
penyakit. Selain agen antimikroba terkenal lainnya yang berasal
dari jamur seperti asam fusidic dan griseofulvin1, obat antijamur
semi sintetik baru seperti anidulafungin (Eraxis), caspafun-gin
(Cancidas) dan retapamulin (Altabax) juga berasal dari metabolit
jamur. Dengan ditemukannya siklosporin yang diisolasi dari
Tolypocladium inflatum pada tahun 1971 diambil langkah penting
dalam imunofarmakologi, dan perbaikan dalam bidang transplantasi
organ dan pengobatan penyakit autoimun yang masih dalam tahap
proses, seperti pengenalan zat seperti asam mikofenolat yang
bersumber dari jamur. (Myfortic) yang diedarkan ke pasar pada
tahun 2004 (ref. 2).
Metabolit jamur lebih lanjut secara farmakologis penting termasuk
obat antilipidemik yang secara kolektif dikenal sebagai 'statin'
dengan senyawa induknya mevastatin dan lovastatin yang diisolasi
masing-masing dari Penicillium citrinum dan Aspergillus terreus.
Statin berguna untuk mengurangi kadar kolesterol darah dan
digunakan untuk pengobatan penyakit jantung
Metabolit jamurpun, tidak hanya diperlukan untuk pengobatan
tetapi juga penting untuk perlindungan tanaman, sebagaimana
ditunjukkan oleh penemuan strobilurine yang pertama kali diisolasi
dari Strobilurus sp. Yang memiliki fungsi sebagai senyawa
penuntun untuk fungisida sintetik seperti trifloxystrobin (Flint) 5.
Namun, 'penemuan kembali sejumlah besar metabolit terdahulu
justru menghalangi studi sumber jamur tradisional. Dan baru-baru
ini, ahli kimia produk alami dan farmakolog bersama-sama telah
beralih ke habitat yang jauh lebih sedikit diselidiki dan memiliki
ekologi yang sesuai seperti Laut. Laut mencakup hampir tiga
perempat permukaan bumi dan dapat dianggap sebagai 'sup' dari
semua jenis mikroba yang dapat diteliti. Ekologi yang sesuai, mis.
ventilasi hidrotermal laut dalam, hutan bakau, ganggang dan spons,
menyediakan habitat yang berbeda untuk isolasi mikroorganisme
tertentu.
organisme ini sebagai sumber potensial penuntun farmasi.
Terutama, jamur laut yang telah menunjukkan potensi yang
menjanjikan sebagai sumber produk alami baru dan bioaktif seperti
yang disarankan oleh keanekaragaman kimia metabolit
sekundernya, meskipun pengumpulan sampel dan persiapan sebagai
langkah pertama mungkin lebih sulit untuk jamur laut daripada
jamur darat . karena kesulitan yang melekat pada pengumpulan
sampel di lingkungan laut, seperti kebutuhan untuk scuba diving.
Meskipun kelompok senyawa bioaktif yang paling terkenal yang
diperoleh dari jamur yang berasal dari laut masih sefalosporin
dengan sefalosporin C, pertama kali diisolasi oleh G. Brotzu pada
tahun 1945 dari turunan Acremonium chrysogenum, ada juga
contoh yang lebih menjanjikan. Ini termasuk halovir dan beberapa
analog yang terjadi secara alami, yang merupakan inhibitor kuat dari
virus Herpes simplex 1 dan 2. Penelitian sintetik yang dilakukan
untuk zat-zat ini memungkinkan wawasan ke dalam struktur -
hubungan aktivitas22,27. Alkaloid sorbicillactone A yang diisolasi
dari jamur yang berasal dari spons Penicillium chrysoge-num
menunjukkan aktivitas yang menjanjikan terhadap sel-sel leukemia
tanpa menunjukkan sitotoksisitas yang terkenal. Fermentasi jamur
dalam skala besar menghasilkan jumlah senyawa yang cukup untuk
penyelidikan praklinis22,28. Secara keseluruhan, penelitian tentang
jamur turunan laut telah mengarah pada penemuan lebih dari 270
produk alami baru terutama dari awal 1990-an hingga pertengahan
2002 (dengan lebih dari dua pertiga dari senyawa ini diisolasi dari
jamur yang berasal dari spons dan tumbuhan), sedangkan lebih dari
330 metabolit baru dilaporkan hanya dalam periode 5 tahun antara
tahun 2002 dan 2006 (ref. 6,12,22,29), termasuk banyak senyawa
dengan kerangka karbon baru. Peningkatan tajam dalam jumlah ini
menunjukkan minat yang tumbuh pada jamur yang berasal dari laut
sebagai sumber metabolit bioaktif baru.
Tujuan dari makalah ini adalah untuk memberikan protokol rinci
tentang pemurnian dan budidaya jamur dari berbagai makro-
t organisme laut terpilih (spons, ganggang dan tanaman bakau)

nature protocols | VOL.5 NO.3 | 2010 | 479

 protocol
Organisme Inang
1-5 : isolasi Jamur
1–5: 1
minggu
6:Pemurnian
6: 2minggu malt agar
7: 2 d Kultur murni
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols
Berdasarkan skrining/bioaktivitas kimia
hasil skala besar fermentasi dari
8: skala kecil
ketegangan yang menjanjikan
Fermentasi pada nasi
atau media cair untuk
tujuan skrining
– + n-Hexane
8: setiap 3-4
minggu
\ 8: skala besar
9–11: 1–3 d 9–11: Extraction with EtOAc
12–14: Fraksinasi dan isolaso
produk sekunder
16: Bioassays(cytotoxicity dan aktivitas antimikroba)
12–16: setidaknya
2–4 minggu
Gambar 1 | Tinjauan skematis tentang langkah-langkah penting
yang terlibat dalam isolasi jamur dari sumber laut dan dalam isolasi
dan identifikasi metabolit sekundernya.
Sperti pada isolasi, karakterisasi dan struktur elusi dari metabolit
sekunder aktif biologis yang dihasilkan oleh jamur ini ketika
ditanam dalam cairan atau pada media padat. Gambaran umum
termasuk perkiraan jadwal waktu ditunjukkan pada Gambar 1.
Dalam protokol ini kami menggambarkan isolasi jamur yang
berasal dari laut endofit dari bagian dalam jaringan hidup inverte-
brates, alga dan tanaman bakau laut. Jamur endofit disebut sebagai
jamur yang menghabiskan setidaknya sebagian dari hidupnya di
dalam jaringan organisme inang yang sehat terlepas dari apakah
inangnya adalah tanaman atau hewan30. Untuk isolasi jamur
turunan laut, terutama untuk isolasi jamur dari spons, metode
alternatif untuk yang dijelaskan dalam protokol ini tersedia. Sebagai
contoh, alih-alih memotong potongan dari sampel yang disterilkan
dengan permukaan, juga dimungkinkan untuk menjatuhkan air dari
spons pada agar agar atau untuk memotong bagian dalam jaringan
setelah membilasnya dengan air laut yang disterilkan tanpa
sterilisasi permukaan sebelumnya31-33 . Demikian juga, beberapa
media lain untuk isolasi sukses dan fermentasi jamur laut, seperti
agar kentang dekstrosa, barley dieja substrat padat atau media
ekstrak malt padat17,31 serta penambahan nutrisi spesifik atau dosis
fungisida sub-mematikan untuk membatasi jamur yang tumbuh
cepat34, telah dijelaskan dalam literatur. Banyak kondisi fermenasi,
seperti goncangan versus kultur statis, penerapan rezim suhu yang
berbeda atau penggunaan fermentor yang lebih besar yang dapat
memberikan aerasi yang bervariasi17,31,35, juga telah dilaporkan.
Namun, semua kondisi yang digunakan dalam budidaya jamur
endofit turunan laut menderita keterbatasan karena teknik budidaya
yang berbeda biasanya hanya memilih sebagian kecil dari
komunitas jamur yang ada, sehingga memberikan
480 | VOL.5 NO.3 | 2010 | nature protocols
Skala kecil fermentasi
Di media cair 3 Weeks
+EtOAc Homogenisasi
UltraTurrax Ekstraksi Several min
Suspensi sel
filter Several min
7: Identifikasi Racun
(menggunakan PCR and gen Filtrat
sequencing,diikuti oleh
pencarian BLAST)
Several hours
Fase air EtOAc
Evaporasi
Residu ~1 h per l EtOAc
90% MeOH
~1 h
90% MeOH n-Hexane
fermentasi Gambar 2 | Perkiraan waktu yang dibutuhkan untuk fermentasi
jamur dan pemeriksaan ekstrak dari medium cair dalam skala
kecil.
jendela terbatas dan selektif dari keanekaragaman aktual yang
ada dalam sampel yang diberikan36. Selain itu, harus diingat
bahwa kondisi kultur yang berbeda mungkin juga menghasilkan
pola metabolisme metabolik yang berbeda, seperti yang telah
15: Penjelasan struktur
dinyatakan, dalam konsep OSMAC ('satu strain, banyak
senyawa') yang secara sengaja menggunakan plastisitas kimia
mikroorganisme. sebagai
respons terhadap beragam kondisi budaya37. Namun, setelah
melakukan berbagai percobaan fermentasi dengan jamur endofit
menggunakan kondisi kultur yang berbeda, kami menemukan
metode yang dijelaskan dalam protokol ini yang paling cocok
untuk tujuan kami, karena mereka umumnya memberikan hasil
yang dapat direproduksi berkaitan dengan isolasi jamur endofit
dan mengenai pola. metabolit sekunder yang dihasilkan oleh
jamur ini 32,38-40. Di tangan kami, kami telah mendapatkan hasil
yang optimal ketika membudidayakan jamur pada media padat
atau cair yang berbeda pada suhu kamar (20-25 ° C), diikuti oleh
ekstraksi miselia dan media pertumbuhan dengan pelarut
organik. Diagram alir menjelaskan secara singkat prosedur
pemeriksaan masing-masing kultur jamur dan waktu yang
dibutuhkan untuk setiap langkah ditunjukkan pada Gambar 2-4.
Ekstrak kasar kemudian dipisahkan menggunakan berbagai
teknik kromatografi, dan senyawa bioaktif yang diisolasi dianalisis
oleh HPLC-DAD untuk kemurniannya diikuti oleh elusidasi
struktur oleh MS dan NMR menggunakan teknik canggih.
Senyawa kiral dapat diderivatisasi untuk menentukan konfigurasi
absolutnya. Pemisahan kromatografi ekstrak jamur biasanya
dipandu oleh bioassay, sehingga mengarahkan strategi isolasi
menuju penemuan unsur bioaktif. Setelah ekstraksi kultur,
ekstrak yang diperoleh diperlakukan dengan cara yang sama
seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk ekstrak dari makro-
organisme laut. Seperti pemisahan kromatografi, penjelasan
struktur dan penyaringan bioaktivitas untuk ekstrak yang berasal
dari makro-organisme laut telah dijelaskan secara rinci dalam
protokol sebelumnya41, hanya langkah-langkah yang berbeda
dari prosedur yang dijelaskan yang digambarkan dalam protokol
ini.
Dua contoh yang diambil dari kelompok kami yang fokus pada
polyketides yang berasal dari jamur akan digunakan untuk
menyoroti variabilitas struktural
 protocol

Skala besar Fermentation

fermentasi 3 Weeks Pada media
beras 4– 6minggu

+EtOAc Overnight + 30 min

Mycelium Medium Filter

Beberapa jam +MeOH Ekstrak EtOAc

EtOAc
hours UltraTurrax Beberapa jam
Evaporasi ~1 h per l EtOAc
Suspense sel
Residu
~1 h Filter
90% MeOH small scale, ~ 1 h
Ekstrak MeOH Fase Air EtOAc + n-Hexane Skala nesar beberapa jam

~1 h Evaporasi Evaporate ~1 h
per l MeOH per l EtOAc
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols

90% MeOH n-Hexane

Residu Residu

Several hours
90% MeOH 90% MeOH
Beberapa jam Gambar 4 | Perkiraan waktu yang dibutuhkan untuk fermentasi
+ n-Hexane + n-Hexane
dan pengerjaan ekstrak dari media beras.

90% MeOH n-Hexane 90% MeOH n-Hexane

Gambar 3 | Perkiraan waktu yang dibutuhkan untuk fermentasi jamur
dan pemeriksaan ekstrak dari medium cair dalam skala besar.
produk alami yang diperoleh dari jamur yang berasal dari laut.
Hasil lain dapat ditemukan dalam referensi. 33,38,39,42-44.
Desain eksperimental
Pengambilan sampel dan pertimbangan umum sebelum
isolasi jamur. Transportasi bahan yang dikumpulkan dalam
wadah yang sesuai (untuk spons, ganggang atau sejenisnya yang
mengandung air laut). Untuk jaringan hewan dan alga dengan
kadar air yang tinggi, isolasi jamur harus dilakukan dalam
beberapa jam ke depan untuk menghindari pertumbuhan bakteri
sekitar. Isolasi jamur dari bahan tanaman seperti daun bakau
dapat terjadi dalam 1-2 d asalkan sampel disimpan pada suhu
rendah (5–10 ° C) dan kelebihan kondensasi dilarang. Kalau
tidak, ada risiko bahwa jamur phylloplane akan berkoloni pada
bahan tanaman yang menyebabkan hasil yang salah selama
isolasi endofit.
Identifikasi jamur. Ketika kita membatasi diri pada penanaman
jamur non-patogen, setiap kultur jamur dengan patogenisitas
yang terdokumentasi terhadap manusia dibuang segera setelah
identifikasi taksonomi dan dikeluarkan dari penyelidikan lebih
lanjut. Dengan demikian, identifikasi isolat dilakukan pada
tahap awal
selama pemeriksaan. Identifikasi taksonomi dari strain jamur
dicapai dengan amplifikasi DNA dan pengurutan jamur ITS
area39 seperti yang dijelaskan dalam Kotak 1. Namun, jamur
juga dapat diidentifikasi dengan karakteristik morfologis
menggunakan misalnya, layanan yang tersedia secara komersial
seperti Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) , Utrecht,
Belanda.
Tes biologis. Aktivitas biologis ekstrak, fraksi dan senyawa
murni diuji dalam sejumlah bioassay cepat 'in-house' yang dapat
digunakan untuk isolasi yang dipandu bioaktivitas. Yang
digunakan di laboratorium kami dijelaskan secara singkat dalam
Kotak 2.
Kontrol. Kontrol negatif selama isolasi jamur endofit dari
organisme laut diperlukan untuk mendeteksi contami-bangsa
dari bagian eksternal irisan, dari phylloplane atau dari
mikroorganisme di udara. Oleh karena itu, sampel laut yang
dilapis permukaan ditekan ke cawan petri yang berisi media
isolasi sebelum pemotongan aseptik dan inokulasi pada pelat
agar kedua. Jika pertumbuhan jamur dapat diamati pada cawan
kontrol negatif, cawan positif tidak digunakan untuk prosedur
pemurnian lebih lanjut yang bertujuan untuk mengisolasi jamur
endofit sejati.
Untuk semua bioassay, kontrol negatif dan positif untuk
membandingkan efektivitas fraksi yang diuji dan senyawa murni
harus digunakan seperti yang dijelaskan (Kotak 2).

Kotak  1 | IDENTIFIKASI JAMUR

Identifikasi taksonomi dari strain jamur dicapai dengan amplifikasi DNA dan sekuensing wilayah ITS jamur39. Untuk tujuan ini, sepotong
miselium jamur (0,5 cm2) disampel dari piring agar, diliofilisasi dalam pengering beku dan bubuk di pabrik pencampur setelah
menambahkan manik tungsten karbida.
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan DNeasy Plant Mini Kit sesuai dengan protokol pabrikan. Prosedur ini termasuk lisis sel,
pencernaan RNA dengan RNAse A, menghilangkan endapan dan puing-puing sel, geser DNA, pengendapan dan pengendapan DNA. Ini
diikuti oleh amplifikasi DNA menggunakan Hot StarTaq Master Mix Kit dan pasangan primer ITS1 dan ITS4 dalam termocycler iCycler.
Produk PCR dimuat ke gel agarosa (agarosa 2% dalam 100 ml buffer TBE, 10 Syl SybrSafe). Setelah elektroforesis pada 70 V selama 60
menit, pita yang sesuai dengan produk PCR yang diinginkan (~ ukuran 550 bp) dihilangkan dari irisan gel menggunakan PerfectPrep Gel
Cleanup Kit dengan mengikuti protokol pabrikan
Produk PCR murni diajukan untuk diurutkan bersama dengan primer ITS1 ke layanan komersial (misalnya, SeqLab GmbH, Goettingen
dan BMBF, Düsseldorf, Jerman) dan urutan dasar dibandingkan dengan database yang tersedia untuk umum (GenBank C, http: // www.
ncbi.nlm. nih.gov/Genbank/, Institut Nasional Informasi Bioteknologi, Bethesda, Maryland, AS) dengan bantuan Blast-Algorithmus.

nature protocols | VOL.5 NO.3 | 2010 | 481

 protocol

Kotak  2 | UJI SKRINING BIOAKTIFITAS

Uji difusi agar
Menurut uji Bauer-Kirby (DIN 59040), cakram kerentanan diresapi dengan 250 atau 500 ug ekstrak kasar dan masing-masing
50 atau 100 μg senyawa murni, dan ditempatkan pada pelat agar yang telah diinokulasi dengan standar baik. strain bakteri
Bacillus subtilis DSM 22109 (= ATCC 11774), Escherichia coli DSM 10290 (= ATCC 15766), ragi Saccharomyces cerevisiae
DSM 1333 (= ATCC 9763) atau jamur Cladosporium herbarum DSM 63422 atau Cladosporium curcumer12 SM.
Pelat diperiksa untuk zona penghambatan setelah 24 jam inkubasi (37 ° C untuk bakteri, 27 ° C untuk ragi) atau setelah 7
hari (22 ° C untuk jamur), masing-masing.
Kontrol negatif hanya diobati dengan pelarut masing-masing, kontrol positif diperlakukan dengan penisilin G, streptomisin dan
gentamisin (untuk bakteri) atau nistatin (untuk jamur) 33,47.
TES SITOTOKSISITAS
Uji udang air garam
http://www.nature.com/natureprotocols

Telur Artemia salina menetas dalam air laut buatan pada suhu kamar dan dalam kondisi siang hari. Setelah 48 jam, 20 nauplii ditransfer ke
setiap tabung uji menggunakan binokular dan air laut ditambahkan ke 5 ml. Senyawa murni dilarutkan dalam 40 Dl DMSO untuk
memberikan konsentrasi akhir senyawa 10 atau 100 p.p.m. Percobaan disimpan di bawah pencahayaan dan kematian ditentukan setelah
24 jam dengan menghitung korban dengan bantuan kaca pembesar × 3. Botol yang mengandung 40 Dl DMSO (kontrol negatif) juga
disiapkan48. Uji microculture tetrazolium (MTT) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk makro-organisme laut41.

BAHAN
• Fase diam komatografi : berbeda bahan dari pemasok yang berbeda
• Agar Bacto (BD, cat. no. 214010) dimungkinkan, di laboratorium kami bahan yang digunakan telah
• Ekstrak Malt (Merck, cat. no. 105391) dijelaskan pada protkol sebelumnya41
• Garam Laut Buatan (Sera, cat. no. 05420) • Laminar air-flow (Herasafe HS15, Heraeus)
• Kloramfenikol (Sigma, cat. no. C0378) • pH meter (420 Aplus, Orion)
© 2010 Nature Publishing Group

• Natrium Hidroksida (‘NaOH’, Sigma, cat. no. S5881)
• Asam Hidroklorid (‘HCl’, Sigma, cat. no. 258148)
• Ekstrak Yeast(Fluka, cat. no. 70161)
• Pepton (Merck, cat. no. 111931)
• Glukosa (Caelo, cat. no. 5247)
 Nasi(parboiled, any supermarket brand)
• Gliserin (Roth, cat. no. 4043)
• Penisillin G (Sigma, cat. no. P3032)
• Streptomycin (Sigma, cat. no. S6501)
• Gentamycin (Serva, cat. no. 22185)
• Nystatin (Sigma, cat. no. N4014)
• Deterjen Antimikroba Melseft SF (B. Braun, cat. no. 18907)
• Tungsten carbide bead (Qiagen, cat. no. 69997)
• Agarosa (Sigma, cat. no. A9414)
• Penyangga TBE (Merck, cat. no. 106177)
• DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, cat. no. 69104)
• Hot StarTaq Master Mix Kit (Qiagen, cat. no. 203443)
• RNAse A (Invitrogen, cat. no. 12091-039)
• Primer: ITS1 and ITS4 (Invitrogen; individual order)
• SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen, cat. no. S33102)
• DNA loading buffer (Eppendorf, cat. no. 0032 006.850)
• PerfectPrep Gel Cleanup Kit (Eppendorf, cat. no. 0032 007.740)
Pelarut:
• Pelarut untuk ekstraksi dan pemisahan kromatografik (lihst
peraturan reagen)
• Pelarut untuk kinerja tinggi cairan,HPLC, untuk mengukur rotasi optik,
untuk spektroskopi NMR digunakan seperti yang dijelaskan dalam
protokol sebelumnya 41
• Spray reaksi digunakan seperti yang dijelaskan dalam protokol
sebelumnyal41
• Nα-(2,4-dinitro-5-fluorophenyl)-L-alaninamide (‘Marfey’s reagent’,
Fluka, cat. no. 42095)
• Asam amino standar (ICN, Sigma)
PERALATAN
• Cawan petri plastik steril, diameter 9.4 cm (Greiner, cat. no. 633161)
• Parafilm M (Marienfeld, cat. no. 74 038 10)
• Tabung steril, 15 ml, 120 mm × 17 mm (Sarstedt, cat. no. 62553)
• Kertas cakram (5 mm diameter, Oxoid)
• Semua mikroorganisme yang diperoleh dari DSMZ–Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
• Artemia salina (Dohse Aquaristik, cat. no. 21350)
• Autoclave (Varioklav, H&P)
• Mikrosentrifus (Biofuge pico, Heraeus)
• Freeze dryer (Lyovac GT2, pump Trivac D10E, Savant)
• Mesin PCR (iCycler, Bio-Rad)
• UV transluminator (GVM 20, Syngene)
• Mixer mill (MixerMill MM30 Retsch, Haan, Germany)
• Sumber daya istrik untuk elektroforesis (PowerPac 300, Bio-Rad)
• Ultra Turrax (T18 basic, IKA)
• Pompa vakum (type 4EKF 56CX-4, Greiffenberger Antriebstechnik)
• Generator Nitrogen (UHPN 3001, Nitrox)
• Deep freezer ( − 80 °C, 86-Freezer, Forma Scientific)
• Pengaduk SM 30 A (Edmund Bühler, cat. no. 6101 000)
• Penyeimbang(BL1500, Sartorius)
• HPLC, MS dan NMR: peralatan seperti yang dijelaskan dalam protokol sebelumnya
digunakan 41
PERSIAPAN BAHAN KIMIA
Pelarut organik untuk pemisahan dan pemurnian Banyak pelarut
organik dari berbagai polaritas dapat digunakan untuk pemisahan
kromatografi dan prosedur pemurnian, termasuk aseton (! PERINGATAN
mudah terbakar dan menyebabkan iritasi), asetonitril (ACN) (!
PERINGATAN mudah terbakar dan beracun), diklorometana (DCM) (!
PERINGATAN berbahaya), etanol (EtOH) (! PERINGATAN mudah
terbakar), etil asetat(EtOAc) (! PERINGATAN mudah terbakat dan
menyebabkan iritasi), n-hexane (! PERINGATAN mudah terbakar,
menyebabkan iritasi, berbahaya, berbahaya bagi lingkungan dan toksik pada
alat reproduksi), n-butanol (n-BuOH) (!PERINGATAN dapat terbakar,
berbahaya dan menyebabkan iritasi) dan metanol (MeOH) (!
PERINGATAN m,udah terbakar dan beracun).semuanya termasukpada
ingkat analitikal. ! PERINGATAN Semua pelarut organik harus ditangani
dengan hati-hati. Kenakan pakaian pelindung, kacamata keselamatan, dan
sarung tangan. Mereka harus ditangani di bawah tudung asap dan disimpan
di lemari pelarut berventilasi.
Media A untuk isolasi jamur turunan laut makroorganisme dan
tanaman mangrove
Agar Bacto 15 g
Ekstrak Malt 15 g
Garam Laut Buatan 24.4 g (Untuk isolasi Mangrove10 g)
Kloramfenikol 0.2 g
pH 7.4–7.8 (disesuaikan dengan NaOH/HCl)
Dem. Air Isi hingga 1,000 g

482 | VOL.5 NO.3 | 2010 | nature protocols


Isi digabungkan dalam labu yang cukup besar sehingga diisi tidak lebih dari
dua pertiga, ditutup dan diautoklaf pada 121 ° C selama 20 menit. Setelah
dingin hingga ~ 60 ° C, media dituangkan dalam cawan petri plastik steril, ~
25 ml media per piring, dalam kondisi aseptik. Agar-agar yang disiapkan
piring dapat disimpan dalam kondisi steril hingga 1 minggu sebelum
inokulasi. ! PERINGATAN Botol tidak boleh ditutup rapat ketika diautoklaf.
Suhu autoklaf harus di bawah 80 ° C sebelum dapat dibuka untuk mencegah
timbulnya uap panas. Gunakan sarung tangan pelindung panas dan kacamata
pengaman harus dipakai.
protocol
Semua bahan dicampur secara menyeluruh. Secara keseluruhan, 300 ml
media dituangkan dalam 1.000 ml labu Erlenmeyer. Labu ditutup
dengan tutup jaringan dan diautoklaf pada suhu 121 ° C selama 20
menit. ! PERINGATAN Tutup jaringan harus ditutup dengan aluminium
foil untuk mencegah perendaman selama autoklaf. Suhu autoklaf harus di
bawah 80 ° C sebelum dapat dibuka untuk mencegah timbulnya uap panas.
Sarung tangan pelindung panas dan kacamata pengaman harus dipakai.
Media dapat disimpan selama 1-2 hari sebelum inokulasi.
Solid rice medium

Medium B untuk pemurnian dan B for purification and short term Nasi 100 g
storage of fungal strains
Dem. air 110 g
Agar Bacto 15 g Labu Erlenmeyer 1.000 ml dengan isinya ditutup dengan tutup jaringan dan tetap
Ekstrak Malt 15 g berdiri semalaman untuk memungkinkan pembengkakan biji padi sebelum
diautoklaf pada 121 ° C selama 20 menit. ! PERINGATAN Tutup jaringan harus
2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols

Garam laut buatan 24.4 g (untuk mangrove-turunan jamur 10 g)

ditutup dengan aluminium foil untuk mencegah perendaman selama autoklaf.
pH 7.4–7.8 (disesuaikan dengan NaOH/HCl) Suhu autoklaf harus di bawah 80 ° C sebelum dapat dibuka untuk mencegah
Dem. Air ad 1,000 g timbulnya uap panas. Sarung tangan pelindung panas dan kacamata pengaman
harus dipakai. Media dapat disimpan selama 1-2 hari sebelum inokulasi.
Isi digabungkan dalam labu yang cukup besar sehingga diisi tidak lebih MexA medium for long-term storage
dari dua pertiga, ditutup dan diautoklaf pada 121 ° C selama 20 menit.
Ekstrak Malt 20 g
Setelah dingin hingga ~ 60 ° C, media dituangkan dalam cawan petri plastik
steril, ~ 25 ml media per piring, dalam kondisi aseptik. Pelat agar yang Ekstrak Yeast 0.1 g
disiapkan dapat disimpan dalam kondisi steril hingga 1 minggu sebelum Gliserin 50 g
inokulasi.
! PERINGATAN Labu tidak boleh ditutup rapat ketika diautoklaf. Suhu Garam laut buatan 24.4 g (untuk mangrove – jamur turunan10.0 g)
autoklaf harus di bawah 80 ° C sebelum dapat dibuka untuk mencegah Agar Bacto 13 g
timbulnya uap panas. Sarung tangan pelindung panas dan kacamata Dem. Air ad 1,000 g
pengaman harus dipakai.
Isi digabungkan dalam labu yang cukup besar sehingga diisi tidak lebih
Media CairWickerham dari dua pertiga, ditutup dan diautoklaf pada 121 ° C selama 20 menit.!
PERINGATAN Selama autoclaving, labu tidak boleh tertutup rapat. Suhu
Ekstrak Yeast 3g autoklaf harus di bawah 80 ° C sebelum dapat dibuka untuk mencegah
Ekstrak malt 3g timbulnya uap panas. Sarung tangan pelindung panas dan kacamata
Pepton 5g pengaman harus dipakai.Setelah dingin hingga ~ 60 ° C medium
dituangkan dalam tabung steril, masing-masingdengan ~ 6 ml dalam
Glukosa 10 g
kondisi aseptik. Labu yang disiapkan dapat disimpan dalam kondisi steril
Garam laut buatan 24.4 g (untuk mengrove-turunan fungi10 g) hingga 1 minggu sebelum inokulasi.. KRITIK Semua media yang
pH 7.2–7.4 (disesuaikan dengan NaOH/HCl) diautoklaf harus disimpan dalam kondisi aseptik untuk mencegah
kontaminasi dengan mikroba di mana-mana dari lingkungan.
Dem. air ad 1,000 g
PROSEDUR
©

Isolasi dan budidaya jamur dari organisme laut ● WAKTU 6–9 minggu
1| Potong sampel (potongan jaringan spons, biomassa alga atau daun bakau atau organ lainnya) menjadi segmen kecil
sekitar 1 cm × 1 cm dan bilas tiga kali dengan air laut steril untuk menghilangkan sisa-sisa permukaan yang
melekat.LANGKAH KRITIK Sangat penting untuk menjaga kondisi aseptik dengan bekerja di bawah aliran udara
laminar untuk isolasi, pemurnian, transfer dan pertumbuhan kultur jamur untuk mencegah kontaminasi oleh mikro-
organisme di mana-mana.

2| Benamkan sepotong sampel dalam EtOH 70% (vol / vol) selama 60-120 s untuk sterilisasi permukaan
LANGKAH KRITIK Jika perawatan dengan EtOH terlalu pendek, sterilisasi bagian luar tidak lengkap,
jika waktu sterilisasi terlalu lama, EtOH membunuh jamur di bagian dalam jaringan..

3| Keringkan tisu dengan kain katun steril (atau bilas dengan air laut buatan steril) untuk menghentikan
sterilisasi dengan EtOH.

4| Gores potongan dengan hati-hati di atas permukaan cawan petri pertama yang berisi media isolasi A dengan pinset yang
disterilkan, kemudian masukkan kembali ke kain katun steril dan potong menjadi segmen yang lebih kecil dengan pisau
cukur steril (kontrol negatif)
5| Tempatkan potongan-potongan kecil di atas cawan petri kedua yang mengandung media isolasi A sehingga
ujung-ujungnya yang baru dipotong bersentuhan langsung dengan permukaan agar-agar.Tutupi agar-agar
dengan parafilm, beri label dan simpan pada 20-25 ° C. 20 ° C dan 25 ° C di bawah siang hari. Pertumbuhan
jamur dari segmen potongan biasanya dimulai setelah 2-3 hari sampai 14 hari setelah awal percobaan.
? PEMECAHAN MASALAH

nature protocols | VOL.5 NO.3 | 2010 | 483

 protocol

6| 6| Biasanya strein jamur yang berbeda akan berkembang dari satu sampel. Isolasi masing-masing strein dengan
mentransfer ujung hifa yang tumbuh dari potongan jaringan tisu dengan loop steril kecawan petri segar yang mengandung
media B.
LANGKAH KRITIS untuk pemurnian galur jamur, langkah ini dapat diulang beberapa kali sampai koloni dianggap murni
setelah analisis mikroskopik dan mikroskopis.
Tergantung pada kondisi kultur dan strain jamur yang berbeda, pertumbuhan dapat diamati setelah 2-3 hari. Strain
murni harus tumbuh selama 1-2 minggu sebelum pemeriksaan lebih lanjut.

7| kirim strein jamur murni untuk diidentifikasiTaksonomi seperti yang dijelaskan dalam kotak 1.

8| Untuk fermentasi skala kecil dan skala besar, inokulasikan strain jamur murni dalam labu Erlenmeyer 1.000 ml yang
mengandung 300 ml medium Wickerham cair atau 210 g medium beras pada. Untuk tujuan ini, potong strain yang menutupi
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols

permukaan cawan petri yang diinokulasi menjadi potongan kecil 1,5 cm × 1,5 cm dan pindahkan potongan-potongan ini
dengan loop steril ke dalam labu Erlenmeyer yang berisi media yang disterilkan..
Kultivasi dilakukan pada suhu kamar dalam kondisi statis dan siang hari. Tergantung pada pertumbuhan jamur, kultur
pada media cair diinkubasi selama 3-4 minggu, sedangkan pada beras selama 4-6 minggu.

9| Bawalah fermentasi dengan menambahkan 250 ml EtOAc ke dalam labu kultur dan biarkan labu ditutup selama
setidaknya 24 jam. EtOAc akan meningkatkan keterbasahan spora dan mengurangi jumlah spora, yang akan mengudara
setelah labu dibuka.
! PERINGATAN Untuk mencegah penyebaran fragmen atau spora jamur, labu hanya boleh dibuka di bawah aliran udara
laminar.
10| Untuk penyimpanan jangka panjang, pindahkan strain jamur murni ke 10 ml tabung Falcon BD yang mengandung ~ 5
ml medium MexA. Ketika pertumbuhan dapat diamati (setelah ~ 3 hari, tergantung pada strain jamur), bekukan strain
jamur secara bertahap: pertama-tama masukkan ke dalam kulkas pada suhu 4 ° C selama 2 jam, kemudian dalam
freezer pada suhu - 20 ° C selama 2 jam dan akhirnya letakkan di freezer pada suhu - 80 ° C.
TITIK JEDA Strain jamur murni beku dapat disimpan pada suhu - 80 ° C.
Untuk pemulihan dari - 80 ° C, cairkan biakan beku dengan cepat dalam penangas air pada suhu 37 ° C dan pindahkan
potongan kecil dengan loop steril ke cawan petri yang berisi media B.
! PERINGATAN Untuk mencegah kontaminasi lingkungan dengan bahan yang layak, peralatan yang bersentuhan
dengan bahan jamur harus diautoklaf pada suhu 134 ° C selama 15 menit sebelum digunakan kembali atau dibuang.
Ekstrak kultur skala kecil ● WAKTU ~2 hari
11| Ekstrak bahan biakan dengan mengikuti langkah-langkah dalam opsi (A) media cair skala kecil (Gbr. 2); (B) beras skala
kecil (Gbr. 4); (C) media cair skala besar (Gbr. 3); atau (D) media beras skala besar (Gbr. 4).
(A) Media cair skala kecil (Gambar. 2)
(i)
mnt - 1 untuk penghancuran sel dan ekstraksi selama 10 mnt.
(ii) Saring campuran dalam kondisi vakum menggunakan corong Buchner dan buang residu miselium.
(iii) Pindahkan filtrat kultur ke dalam corong pemisah. Pisahkan fase EtOAc dan H2O dan ekstrak fase air dua kali dengan
masing-masing 300 ml EtOAc. Cuci fase EtOAc gabungan dengan 100 ml air deminearalized untuk menghilangkan
garam laut yang tersisa.
LANGKAH KRITIS Setiap langkah ekstraksi harus dilakukan dengan hati-hati di bawah tudung asap. Untuk ekstraksi
biomassa jamur yang optimal, biasanya tiga siklus sudah cukup. Namun, jika fase EtOAc masih diwarnai setelah
ekstraksi ketiga, ekstraksi lengkap lebih lanjut dengan EtOAc harus mengikuti sampai Untuk mencegah kontaminasi
lingkungan dengan bahan yang layak, detergen antimikroba (Melsept SF) harus ditambahkan ke medium dan ke sel-sel
jamur yang terganggu dan disimpan di dalamnya selama minimal 1 jam sebelum dibuang. Auto-claving tidak
memungkinkan pada tahap ini karena sisa jejak EtOAc dapat menyebabkan ledakan pada autoclave.
(B) Medium beras skala kesil (Gambar. 4)
(i) Potong media kultur yang mengandung miselium menjadi potongan-potongan kecil untuk memungkinkan
ekstraksi lengkap dengan EtOAc. Untuk ekstraksi yang optimal miselium dengan pelarut ekstraksi tambahan
harus disimpan pada shaker selama 1 hari.
(ii) Saring isi di bawah vakum menggunakan corong Buchner dan ulangi ekstraksi dengan EtOAc sampai habis.
(iii) Cuci fase EtOAc gabungan dengan 300 ml air untuk menghilangkan sisa gula dan pati.
LANGKAH KRITIS Fasa berair dan EtOAc harus dibiarkan dalam corong pemisah sampai tercapai pemisahan
sempurna dari dua fasa cair yang tidak bercampur.
Ununtuk ekstraksi biomassa jamur yang optimal, biasanya tiga siklus sudah cukup. Namun, jika fase EtOAc masih
diwarnai setelah ekstraksi ketiga, ekstraksi lengkap lebih lanjut dengan EtOAc harus mengikuti sampai warna memudar

484 | VOL.5 NO.3 | 2010 | nature protocols

 protocol

! PERHATIAN Untuk mencegah kontaminasi lingkungan dengan bahan yang layak, detergen antimikroba (Melsept SF) harus
ditambahkan ke medium dan ke sel-sel jamur yang terganggu dan disimpan di dalamnya selama minimal 1 jam sebelum dibuang.
Autoklav tidak memungkinkan pada tahap ini karena sisa jejak EtOAc yang dapat menyebabkan ledakan pada autoklav.
(C) Media cair skala besar (Gambar. 3)
(i) Pisahkan miselia jamur dari media kultur dan tutup miselia dengan ~ 5 liter MeOH.
! PERHATIAN Untuk mencegah distribusi fragmen atau spora jamur, labu hanya dibuka di bawah aliran udara laminar.
Miselia ditinggalkan di MeOH semalam.
(ii) Ganggu dan ekstrak sel selama 10 menit pada 4000 - 1 menggunakan Ultraturrax.
(iii) Saring campuran dalam kondisi vakum menggunakan corong Buchner.
(iv) Ulangi ekstraksi dengan cara yang sama sampai kelelahan (2–3 kali).
(v) Ekstrak media kultur dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan untuk ekstraksi kultur skala kecil untuk
mendapatkan ekstrak EtOAc.
! PERHATIAN Untuk mencegah kontaminasi lingkungan dengan bahan yang layak, deterjen antimikroba harus
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols

ditambahkan ke miselia yang diekstraksi dan media pertumbuhan dan disimpan di dalamnya selama setidaknya 1 jam
sebelum dibuang. Autoklaf residu tidak dimungkinkan karena pelarut yang tersisa.
(D) Medium beras skala besar (gambar. 4)
(i) Ekstraksi media beras skala besar dilakukan dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan untuk kultur skala kecil
menggunakan ~ 10 liter EtOAc.
? PENYELESAIAN MASALAH

Pemeriksaan ekstrak kasar yang diperoleh ● WAKTU beberapa hari-minggu

12| Pengerjaan ekstrak kasar mengikuti langkah-langkah dalam opsi (A) untuk ekstrak skala kecil dan opsi (B) untuk
ekstrak skala besar, masing-masing.
(A) Ekstrak skala kecil
(i) Keringkan ekstrak EtOAc (baik dari beras atau kultur cair) di bawah vakum (~ 200 mbar) menggunakan rotary
evaporator pada suhu 40 ° C untuk memberikan residu padat atau berminyak.
Bergantung pada jumlah EtOAc yang digunakan dan pada ukuran round-bottom flask, langkah ini memakan waktu
sekitar 40 menit liter - 1 EtOAc.
TITIK JEDA Ekstrak kering dapat disimpan dalam deep freezer sampai pemeriksaan lebih lanjut.
(ii) Partisi residu antara n-heksana dan 90% (vol / vol) berair MeOH dalam perbandingan 1: 1 (vol / vol) (~ 150 ml
masing-masing). LANGKAH KRITIS Fraksinasi pelarut harus dilakukan dengan hati-hati di bawah tudung asap
sampai tercapai pemisahan sempurna dari dua fase cairan yang tidak larut.
(iii) Keringkan setiap fraksi di bawah vakum (~ 200 mbar) menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 ° C untuk
menghasilkan residu yang berminyak atau padat.
(iv) Kirim semua fraksi ke TLC, HPLC analitik, LC-MS dan juga ke tes bioaktivitas (lihat Kotak 3, ref. 41).
(v) Penyelidikan lebih lanjut tergantung pada hasil penyaringan kimia dan biologis dan pada identitas taksonomi jamur. Jika jamur itu
bersifat non-patogenik dan jika ekstraknya menunjukkan aktivitas yang menjanjikan dalam penyaringan bioaktivitas, tumbuhkan strain
jamur tersebut dalam skala besar baik dalam 20 liter media cair Wickerham (67 Erlenmeyer flasks) atau pada media beras padat 4,2 kg
(20 termos). Dari fermentasi skala besar ini, biasanya sejumlah ekstrak kasar yang cukup untuk isolasi berikutnya dan identifikasi
struktural dari metabolit sekunder murni dapat diperoleh.
(B) Ekstrak skala besar
(i) Keringkan ekstrak EtOAc atau MeOH (baik dari beras atau kultur cair) di bawah vakum (~ 200 mbar)
menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 ° C untuk menghasilkan residu padat atau berminyak.
Bergantung pada volume EtOAc yang digunakan dan pada ukuran labu bundar, langkah ini memakan waktu
sekitar 40 menit liter - 1 pelarut.
TITIK JEDA Ekstrak kering dapat disimpan dalam deep freezer sampai pemeriksaan lebih lanjut.
(ii) Partisi setiap residu antara n-heksana dan 90% (vol / vol) MeOH dalam rasio 1: 1 (vol / vol), menggunakan pelarut
sesedikit mungkin.
LANGKAH KRITIS Fraksinasi pelarut harus dilakukan dengan hati-hati di bawah tudung asap. Pemisahan lengkap
dari dua fase cairan yang tidak bercampur harus dicapai sebelum melanjutkan.
(iii) Kirim semua fraksi ke TLC, HPLC analitik, LC-MS dan juga uji bioaktivitas seperti uji difusi agar atau uji udang
air garam yang dijelaskan dalam Kotak 2 atau uji MTT yang dijelaskan dalam ref. 41.
LANGKAH KRITIS Berdasarkan hasil yang diperoleh, keberhasilan fraksinasi pelarut dapat dimonitor dengan
mudah oleh perbedaan bioaktifitas dan profil HPLC / TLC dari fraksi yang berbeda.

13| Sesuai dengan sifat beragam komponen fraksi, dua prosedur pemurnian yang berbeda dapat diterapkan

nature protocols | VOL.5 NO.3 | 2010 | 485

 protocol

protocol

Kotak  3 | METODE DERIVATISASI

Penentuan stereokimia absolut oleh reaksi mosher telah dijelaskan secara rinci dalam protokol isolasi dan penjelasan
struktural metabolit dari invertebrata laut38,41.
Penentuan konfigurasi absolut asam amino dengan analisis marfey
Pereaksi Marfey (FDAA = Nα- (2,4-dinitro-5-fluorophenyl) -L-alaninamide) digunakan sebagai pereaksi untuk derivatisasi asam D dan L-
amino yang diperoleh setelah hidrolisis siklik atau peptida linier untuk menentukan konfigurasi absolut mereka. Diastereoisomer yang
diperoleh dapat dengan mudah dibedakan dan diidentifikasi dengan waktu retensi mereka setelah analisis HPLC pada kolom RP dan
perbandingan dengan asam D- dan L-amino yang tersedia secara komersial yang telah diperlakukan dengan cara yang sama 47,49.
1. Campurkan 50 μl dari 50 mM masing-masing asam amino standar yang tersedia secara komersial (D- atau L-bentuk) yang menarik
dalam H2O, 20 μl 1 M NaHCO3 dan 100 μl pereaksi 1% Marfey dalam aseton dan panas pada 40 ° C selama 1 jam.
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols

2. Hentikan reaksi dengan menambahkan 10 μl dari 2 M HCl.

3. Bekukan produk yang diderivatisasi hingga - 80 ° C, keringkan dalam pengering beku, lakukan peleburan kembali dalam MeOH dan
analisis dengan HPLC atau LC-MS.
4. Hidrolisis peptida Anda yang terisolasi (0,5-1 mg) dalam 1-2 ml 6 N-HCl pada 110 ° C selama 24 jam di bawah atmosfer N2 sampai
hidrolisis lengkap dan pembebasan asam amino.
5. Dinginkan hidrolisat yang mengandung campuran asam amino bebas, keringkan, dan larut kembali dalam air untuk mencapai
konsentrasi akhir ~ 50 μM. Lanjutkan dengan cara yang sama seperti yang diterapkan pada asam amino standar (lihat Langkah 1-3)).
6. Bandingkan waktu retensi (HPLC atau LC-MS) dari asam amino standar yang diderivatisasi dan dari asam amino turunan yang
diperoleh setelah hidrolisis peptida untuk membedakan asam D- dan L-amino.

Untuk senyawa polar rendah atau sedang, lihat opsi (A), untuk senyawa polar merujuk ke opsi (B).
(A) Fraksi polaritas rendah atau menengah
(i) Fraksi yang mengandung senyawa polar rendah atau sedang difraksinasi lebih lanjut dan dimurnikan menggunakan
metode MPLC seperti VLC. Kemudian, pemurnian lebih lanjut dilanjutkan dengan kromatografi kolom (CC)
menggunakan fase diam normal atau terbalik dan fase gerak yang sesuai untuk mengelusi komponen.
Lihat ref. 41 untuk saran tentang pilihan fase diam dan cara mengatur percobaan.
(B) Pecahan kutub
Fraksi yang sangat polar mengandung senyawa organik yang larut dalam air. Dalam pengalaman kami,
prosedur yang baik adalah dengan menggunakan fase CC terbalik (mis., RP-18) atau unggun resin
penukar ion seperti HP-20 dielusi secara bertahap dari air ke MeOH untuk menghilangkan garam
mineral dan gula yang tersisa yang terdapat dalam fraksi ini. Metode kromatografi
dilakukan seperti yang dijelaskan dalam protokol sebelumnya yang berhubungan dengan pemeriksaan
ekstrak yang berasal dari makro-organisme laut 41.
? PENYLESAIAN MASALAH
14| Lanjutkan prosedur pemurnian sampai senyawa dengan kemurnian yang cukup diperoleh untuk memungkinkan
penjelasan struktural.
15| Penjelasan struktur dilakukan dengan menggunakan berbagai metode spektroskopi, terutama MS dan NMR (1 d dan
2 d). Untuk penjelasan konfigurasi absolut dari produk alami kiral baru, metode derivatisasi seperti persiapan ester
Mosher (lihat Kotak 3) atau dengan menggunakan metode Marfey (lihat Kotak 3) kadang-kadang diperlukan (atau,
konfigurasi absolut dapat dijelaskan dengan Kristalografi sinar-X atau dengan spektroskopi CD diikuti oleh perhitungan
kimia kuantum32)
16|Setelah komponen individu diisolasi dalam bentuk murni dan diidentifikasi secara struktural, mereka harus menjalani
uji bioaktivitas.
17| Pelajari hubungan struktur-aktivitas untuk mengidentifikasi senyawa yang dioptimalkan yang dapat berfungsi sebagai
timbal obat dari sumber alami.
● WAKTU
Langkah 1–5: 15–30 mnt per isolat (pertumbuhan ~ 1-2 minggu)
Langkah 6: 5 mnt per strain (pertumbuhan ~ 1-2 minggu)
Langkah 7: lihat Kotak 1
Langkah 8: ~ 5 menit per strain (pertumbuhan ~ 3–5 minggu)
Langkah 9 dan 10: masing-masing ~ 5 menit (ditambah 24 jam ekstraksi
Langkah 11 A (i – iii): 45–60 menit
Langkah 11 B / D (i): 5/30 mnt (ditambah 1 d untuk ekstraksi)

486 | VOL.5 NO.3 | 2010 | nature protocols

 protocol

Langkah 11 B/D (II): ~ 10 menit (ditambah 1 D untuk ekstraksi) (dua kali)

Langkah 11 B/D (III): ~ 10 menit
Langkah 11 C (i): ~ 5 menit (ditambah ekstraksi semalam)
Langkah 11 C (i-IV): 20 – 30 mnt (2 – 3 kali)
Langkah 11 C (v): 2 – 3 h
Langkah 12 – 17: waktu dari langkah ini tergantung pada kolom yang dipilih, kompleksitas ekstrak dan jenis
senyawa terisolasi.
Lihat juga gambar 1 – 4.

? PEMECAHAN MASALAH.
Saran pemecahan masalah dapat ditemukan di Tabel 1.

Tabel 1 | Tabel pemecahan masalah.

2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols

Step Problem Possible reason Solution

Pertumbuhan jamur pada
4 kontrol negative
Jika Anda tidak yakin seberapa halus permukaan sumber Anda
Sterilisasi permukaan tidak mencukupi
organisme, kemudian mencoba waktu yang berbeda untuk sterilisasi
permukaan,
misalnya 30, 60 dan 120 s. Pelat dengan pertumbuhan pada
negatif, atau mereka yang tanpa pertumbuhan dapat
Dibuang

Tidak ada pertumbuhan Waktu sterilisasi permukaan terlalu lama,

6 sama sekali jamur yang berada dalam jaringan terbunuh Seperti yang dijelaskan diatas

Pemisahan yang tida Pembentukan emulsi karena

mencukupi Biarkan berdiri semalam dalam corong pisah; dan sentrifugasi juga
11 dari dua fase diekstrak senyawa membantu

Selalu uji pada TLC untuk memeriksa fase stasioner dan Mobile
13 No or insufficient Elution kolom terlalu cepat
separation sebelum kolom kromatografi
Kombinasikan semua pecahan lagi dan temukan pemisahan yang
lebih baik
Tidak pantas stasioner atau mobile Sistem
Fase Selalu uji pada TLC untuk memeriksa fase stasioner dan Mobile
Kolom terlalu kecil sebelum kolom kromatografi
Kombinasikan semua pecahan lagi dan temukan pemisahan yang
lebih baik
Selalu menyimpan beberapa fraksi Anda untuk dapat mengulangi
13, 14 Hilangnya zat Adsorpsi pada fase diam
langkah pemisahan
2
©

ANTICIPATED RESULTS 1

Examples taken from our group that illustrate the applica-tion of the O N
described procedures for the isolation of sponge-and mangrove-
derived fungi and the subsequent isolation and structure O O
determination of bioactive compounds will be described (Figs. 5 and H H H H
6).
Anthraquinones and betaenones
Dua derivatif betaenone baru (1, 2) dan tiga baru 1, 3, 6, 8- HO OH HO OH
tetrahidroksi kongener anthraquinone (3 – 5) Diperoleh dari jamur O OH O OH

Microsphaeropsis SP. terisolasi dari bagian dalam laut spons

Aplysina aerophoba32. EtOAc Extract dari jamur yang telah 3 OH O OH OH
4
tumbuh di media cair (termasuk 2,4% (WT/Vol) garam laut
buatan)
OH O OH O
di bawah kondisi statis pada suhu kamar untuk 41 d, menguap di HO OH

bawah tekanan berkurang. Sisanya dipartisi antara EtOAc (4 × O

400 ml) dan H2O (400 ml) untuk menghilangkan sisa garam. Fase
HO OH
organik dibawa ke kekeringan dan mengalami VLC pada Silica
5 O
Gel menggunakan gradien langkah mempekerjakan CH2Cl2 dan OH O OH O
MeOH (100:0, 98:2, 95:5, 90:10, 80:20 dan 30:70 Vol/Vol) HO
sebagai sistem pelarut.
HO OH
O

. nature protocols| VOL.5 NO.3 | 2010 | 487 Figure 5 | New betaenones and anthaquinones from the sponge-
derived fungus Microsphaeropsis sp.
 protocol

Pecahan 3 dan 4 dari sepuluh yang diperoleh pecahan yang dikumpulkan dan chromatographed atas Sephadex LH-20 kolom dengan
MeOH sebagai eluent. Dari 17 pecahan diperoleh, pecahan 6 dan 7 berisi congeners betaenone, sedangkan derivatif anthraquinone Diperoleh
dari pecahan berwarna kuning 11, 12 dan 13. Pemurnian betaenones dilakukan dengan kromatografi pada kolom RP-18. 10-hydroxy-18-
methoxybetaenone (1) Diperoleh dari pecahan 7 dengan MeOH: H2O: TFA (95:5: 0.1 Vol/Vol) sebagai eluent dan 10-hydroxy-18-N-2-
naphthyl-N-Phenyl aminobetaenone (2) dari pecahan 6 dengan MeOH: H2O: TFA (90:10:0.1 Vol/Vol) sebagai eluent.
Para kongenernya anthraquinone dimurnikan oleh HPLC semi-preparative pada kolom C18 dengan menggunakan gradien H2O dan meoh
sebagai berikut: 0 min, 80% meoh (Vol/Vol); 20 menit, 90% MeOH (Vol/Vol); 25 menit, 90% MeOH (Vol/Vol); dan 30 mnt, 100% MeOH
(Vol/Vol).
Semua senyawa yang mudah diidentifikasi oleh data spektroskopi mereka. Melalui-Bond homonuclear dan heteronukclear correla-tions
digunakan untuk menetapkan tugas dan keterikatan atom. Relatif Stereokimia dari 10-hydroxy-18-methoxy betaenone (1) ditentukan dari
eksperimen ROESY.
Sebagai metabolit serupa sebelumnya telah digambarkan sebagai inhibitor protein siklin, yang merupakan kepentingan tertentu sebagai
target untuk pengembangan obat antikanker baru, senyawa terisolasi diuji untuk penghambatan protein siklin in vitro.
Untuk penilaian pertama dari potensi penghambatan kinase, suatu isoenzim dari famili kinase protein C, kinase 4 tergantung kinase dalam
kompleks dengan aktivatornya kinase D1 dan domain tirosin kinase dari reseptor faktor pertumbuhan Epidermal yang dipilih.
Dari dua derivatif betaenone diperoleh hanya 10-hidroksi-18-methoxybetaenone (1) menghambat semua tiga siklin (dengan ED50 nilai 36,0,
11,5 dan 10,5 μM, masing-masing), sedangkan 10-hydroxy-18-N-2-naphthyl-N-phenylaminobetaenone (2) menunjukkan tidak ada efek
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols

penghambatan, sehingga menunjukkan rantai sisi enone sebagai posisi yang menjanjikan untuk optimasi lebih lanjut dari senyawa tersebut
terhadap potensi yang lebih tinggi dan selektivitas yang lebih baik.
Alternaria metabolites
Dari Alternaria endofit SP. terisolasi dari daun tanaman bakau Cina Sonneratia Alba, beberapa produk alami, beberapa
dari mereka struktural terkait dengan alternariol (6 – 11), Quinones Perylene dan senyawa baru (12 – 17), terisolasi.
Ekstrak EtOAc mentah diperoleh setelah fermentasi jamur pada media beras padat dipartisi antara n-heksana dan 90% (Vol/Vol) air
MeOH. Setelah VLC dari ekstrak MeOH menggunakan silika gel sebagai fase stasioner dan gradien langkah mempekerjakan CH2Cl2 dan
MeOH sebagai sistem pelarut, fraksi 3 (80% (Vol/Vol)

6 7 8
systems, fraksi 3 (80% (vol/vol) O O
CH2Cl2) was chromatographed over HO HOOC OH
O OH O
OH

Gel silica menggunakan CH2Cl2 and MeOH (90:10 HO HO HO

vol/vol) sebagai campuran eluen. fraksi 3
O
HO HO O
dan 4dikombinasi dan di re-komatografi
Oleh fase normal VLC menggunakan
9 10 11
step gradient of CH2Cl2dan MeOH sebagai O O O

eluen. Fraksi 5 selanjutnya dimurnikan O OH O OH

menggunakan a RP-18 column danm H2O:MeOH HO HO

HO O
(7:3 vol/vol) as eluent. Fraksi 3 OH O

Menghasilkan altenusin (6), fraksi 5 diberikan OH O

altenuene (7), 4′-epialtenuene (8) 12
dan 2,5-dimethyl-7-hydroxychromone COOH
OH OH
(9) setelah semi-preparative HPLC menggunakan 13
an RP-18 column with MeOH:H2O (25:75 OH
HO

O
vol/vol)sebagai eluen. Alternariol (10)dan O
OH O
altertoxin I (13dipoeroleh dari
fraksi 7 dan akhir pemurnian dilakukan 14 15 16 17
Oleh semi-preparative HPLC OH OH OH O OH O
Menggunakan RP-18 column with MeOH:H2O O COOH O COOH
OH
(35:65 vol/vol)sebagai eluen.
OH OH
Asam metabolite alternarienonic baru H H OH OH
HO
(12) diperoleh dari kombinasi
VLC fraksi 5 dan 6 mengikuti pemurnian
OH O OH O O OH OH O
Oeleh Sephadex LH-20 CC
dengan MeO sebagai eluen. Figure 6 | Natural products from the mangrove-derived fungus Alternaria sp.

488 | VOL.5 NO.3 | 2010 | nature protocols


Pecahan 5 dari pemisahan VLC menghasilkan produk alami baru asam xanalteric I (14) dan II (15), yang dimurnikan lebih
dari Silica Gel menggunakan CH2Cl2 dan MeOH sebagai sistem pelarut dan selanjutnya semi-preparatif HPLC dengan MeOH dan
H2O sebagai eluent. Setelah fermentasi selama 3 minggu di media cair Wickerham, senyawa 6 – 8, 10, 13, 14 dan 15 juga terdeteksi
sebagai konstituen dari ekstrak kasar menggunakan HPLC, sedangkan 9 dan 12 yang hilang. Selain itu, senyawa yang dikenal
alternariol-5-O-methylether (11) dan derivatif Perylene stemphyperylenol (16) dan alterperylenol (17) juga diperoleh setelah
fraksionasi ekstrak oleh VLC menggunakan silika gel sebagai fase stasioner diikuti oleh HPLC semi-preparatif, sehingga
mengkonfirmasikan konsep ' OSMAC ' bahwa strain mikroba yang diberikan dapat menghasilkan metabolit yang berbeda pada
berbagai kondisi fermentasi. Kedua EtOAc mentah ekstrak (diperoleh setelah fermentasi pada media padat atau dalam media cair)
menunjukkan kegiatan antiproliferative menjanjikan seperti yang terdeteksi oleh assay MTT. Alternariol (10) dan altenusin (6)
dipamerkan aktivitas antiprolifera-
1, sedangkan metabolit epialtenena baru (8), asam alternarienonic (12), xanalteric acid I (14) dan II (15), serta altenuena (7), altertoxin
I (13) dan 2, 5-Dimethyl-7-hydroxychromone (9) tidak aktif dalam bioassay38 ini.
Acknowledgments We are indebted to numerous previous coworkers and to
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols
several colleagues who were indispensable for our studies on marine-derived
fungi. Continued support by BMBF to P.P. is gratefully acknowledged.
Published online at http://www.natureprotocols.com/.
Reprints and permissions information is available online at
http://npg.nature.com/ reprintsandpermissions/.
1. Grove, J.F., MacMillan, J., Mulholland, T.P.C. & Rogers, M.A.T.
Griseofulvin part I. J. Chem. Soc. 3949–3958 (1952).
2. Butler, M.S. The role of natural product chemistry in drug
discovery. J. Nat. Prod. 67, 2141–2153 (2004).
3. Abramovits, W., Gupta, A. & Gover, M. Altabax (retapamulin
ointment), 1%. Skinmed 6, 239–240 (2007).
4. Dewick, P.M. Makrolides and polyethers. in Medicinal Natural Products. A
Biosynthetic Approach (John Wiley & Sons Ltd., Chichester, UK, 2006).
5. Balba, H. Review of strobilurine fungicide chemicals. J. Environ.
Sci. Health B. 42, 441–445 (2007).
6. Bugni, T.S. & Ireland, C.M. Marine-derived fungi: a chemically and
biologically diverse group of micro-organisms review. Nat. Prod. Rep.
21, 143–163 (2004).
7. König, G.M. et al. Natural products from marine organisms and
their associated microbes. Chembiochem 7, 229–238 (2006).
8. Kohlmeyer, J. & Kohlmeyer, E. in Marine Mycology, the higher fungi
(Academic Press, New York, San Francisco, London, 1979).
9. Schulz, B. In Bioactive Fungal Metabolites–Impact and Exploitation, 20
(British Mycological Society, International Symposium
Proceedings: University of Wales, Swansea, UK, 2001).
10. Baker, D. & Alvi, K. Small-molecule natural products: new
structures, new activities. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 576–583 (2004).
11. Pietra, F. Secondary metabolites from marine microorganisms:
bacteria, protozoa, algae and fungi. Achievements and prospects.
Nat. Prod. Rep. 14, 453–464 (1997).
12. Blunt, J.W. et al. Marine natural products. Nat. Prod. Rep. 25, 35–
94 (2008).
13. Faulkner, D.J. Highlights of marine natural products
chemistry (1972–1999). Nat. Prod. Rep. 17, 1–6 (2000a).
14. Zhang, H.W., Song, Y.C. & Tan, R.X. Biology and chemistry of
endophytes. Nat. Prod. Rep. 23, 753–771, Erratum 828–830 (2006).
15. Mayer, A. & Gustafson, K. Marine pharmacology in 2005–2006:
antitumor and cytotoxic compounds. Eur. J. Cancer (2008).
16. Bernan, V.S., Greenstein, M. & Maiese, W.M. Marine microorganisms
as a source of new natural products. Adv. Appl. Microbiol. 43, 57 (1997).
17. Höller, U. et al. Fungi from marine sponges: diversity, biological activity
and secondary metabolites. Mycol. Res. 104, 1354–1365 (2000).
18. Jensen, P.R. & Fenical, W. Marine microorganisms and drug
discovery: current status and future potential. In Drugs from the
Sea (Karger Publishers, Basel, Switzerland) 6–29 (2000).
19. Jensen, P.R. & Fenical, W. Secondary metabolites from marine
fungi. In Fungi in Marine Environments (ed. Hyde, K.D.) 293–315
(Fungal Diversity Press, Hong Kong, 2002).
20. Koenig, G.M. & Wright, A. D. trends in marine biotechnology. In
Drug Discovery from Nature (eds. Grabley, S & Thiericke, R),
(Springer-Verlag, Berlin) 180–187 (1999).
protocol
21. Verbist, J.F., Sallenave, C. & Pouchus, Y.F. Stud. Nat. Prod. Chem. 24,
979 (2000).
22. Ebel, R. Secondary metabolites from marine derived fungi. In
Frontiers in Marine Biotechnology (eds. Proksch, P. & Müller,
W.E.G.) 73–143 (Horizon Scientific Press, Norwich, UK, 2006).
23. Laatsch, H. Marine bacterial metabolites. In Frontiers in Marine
Biotechnology (eds. Proksch, P. & Müller, W.E.G.) 225–288
(Horizon Scientific Press, Norwich, UK, 2006).
24. Gerwick, W. The secondary metabolites and biosynthetic gene clusters of
marine cyanobacteria. In Frontiers in Marine Biotechnology (eds. Proksch, P.
& Müller, W.E.G.) 179–224 (Horizon Scientific Press, Norwich, UK, 2006).
25. Shimizu, Y. & Li, B. Microalgae: special problems and methology.
In Frontiers in Marine Biotechnology (eds. Proksch, P. & Müller,
W.E.G.) 145–174 (Horizon Scientific Press, Norwich, UK, 2006).
26. Newton, G.G.F. & Abraham, E.P. Cephalosporine C, a new antibiotic
containing sulphur and D-α-aminoadipic acid. Nature 175, 548 (1955).
27. Dalla Bona, A. et al. Synthesis, conformation, and bioactivity of novel
analogues of the antiviral lipopeptide halovir A. J. Pept. Sci. 12, 748–
757 (2006).
28. Bringmann, G. et al. Large-scale biotechnological production of the anti-leukemic
marine natural product sorbicillactone A. Mar. Drugs 5, 23–30 (2007).
29. Blunt, J.W. et al. Marine natural products. Nat. Prod. Rep. 24, 31–
86 (2007).
30. Jones, G.E.B., Stanley, S.J. & Pinruan, U. Marine endophyte sources of new
chemical natural products: a review. Botanica Marina 51, 163–170 (2008).
31. Schulz, B. et al. Screening strategies for obtained novel,
biologically active, fungal secondary metabolites from marine
habitats. Botanica Marina 51, 219–234 (2008).
32. Brauers, G. et al. Anthraquinones and betaenone derivatives from the
sponge-associated fungus Microsphaeropsis sp.: novel inhibitors of
protein kinases. J. Nat. Prod. 63, 739–745 (2000).
33. Lin, W. et al. Novel chromone derivatives from the fungus Aspergillus
versicolor isolated from the marine sponge Xestospongia exigua.
J. Nat. Prod. 66, 57–61 (2003).
34. Hallermann, J., Berg, G. & Schulz, B. Isolation procedures for endophytic
microorganisms. In Microbial Root Endophytes (Soil Biology)
(eds. Schulz, B., Boyle, C. and Sieber, T.N.) 299–328 (Springer-
Verlag, Berlin Heidelberg, 2006).
35. Klemke, C., Kehraus, S., Wright, A.D. & Koenig, G.M. New
secondary metabolites from the marine endophytic fungus
Apiospora montagnei. J. Nat. Prod. 67, 1058–1063 (2004).
36. Gao, Z., Li, B., Zheng, C. & Wang, G. Molecular detection of fungal
communities in the Hawaiian marine sponges Suberites zeteki and
Mycale armata. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6091–6101 (2008).
37. Bode, H.B., Bethe, B., Höfs, R. & Zeeck, A. Big effects from
small changes: possible ways to explore nature′s chemical
diversity. Chembiochem 3, 619–627 (2002).
38. Aly, A.H. et al. Cytotoxic metabolites from the fungal endophyte
Alternaria sp. and their subsequent detection in its host plant
Polygonum senegalense. J. Nat. Prod. 71, 972–980 (2008).
39. Wang, S. et al. Chaetopyranin, a benzaldehyde derivative, and other
related metabolites from Chaetomium globosum, an endophytic fungus
derived from the marine red alga Polysiphonia urceolata. J. Nat. Prod.
69, 1622–1625 (2006).
nature protocols | VOL.5 NO.3 | 2010 | 489
 protocol
40. Kjer, J. Xanalteric acids I and II and related phenolic compounds
from an endophytic Alternaria sp. isolated from the mangrove plant
Sonneratia alba. J. Nat. Prod. 72, 2053–2057 (2009).
41. Ebada, S.S., Edrada, R.A., Lin, W. & Proksch, P. Methods for isolation,
purification and structural elucidation of bioactive secondary metabolites
from marine invertebrates. Nat. Protoc. 3, 1820–1831 (2008).
42. Xu, J. et al. Cytosporones, coumarins, and an alkaloid from the
endophytic fungus Pestalotiopsis sp. isolated from the Chinese
mangrove plant Rhizophora mucronata. Bioorg. Med. Chem. 17,
7362–7367 (2009).
43. Jadulco, R. et al. New macrolides and furan carboxylic acid
derivative from the sponge-derived fungus Cladosporium herbarum. J.
Nat. Prod. 64, 527–530 (2001).
© 2010 Nature Publishing Group http://www.nature.com/natureprotocols
490 | VOL.5 NO.3 | 2010 | nature protocols
44. Proksch, P. et al. Sponge-associated fungi and their bioactive
compounds: the Suberites case. Botanica Marina 51, 209–218 (2008).
45. Technische Regeln für biologische Arbeitsstoffe. TRBA 460: Einstufung
von Pilzen in Risikogruppen. BArbBl. Heft 10, 78–84 (2002).
46. Sichere Biotechnologie. Classification of biological agents:
fungi. Merkblatt B007e (2003).
47. Ashour, M. et al. Kahalalide derivatives from the Indian sacoglossan
mollusk Elysia grandifolia. J. Nat. Prod. 69, 1547–1553 (2006).
48. Meyer, B.N. et al. Brine shrimp: a convenient general bioassay for
active plant constituents. Planta Med. 45, 31 (1982).
49. Marfey, P. Determination of D-amino acids. Part II: use of a
bifunctional reagent 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene. Carlsberg Res.
Commun. 49, 591–596 (1984).