ISOLASI DNA

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF DNA

LAPORAN PRAKTIKUM
disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Genetika
Dosen Pengampu:
Dr. Hj. Diah Kusumawaty, M.Si.
Dr. Hj. Sri Anggraeni, M.S.
Dr. Riandi, M.Si.
Drs. Suhara, M.Pd.

Oleh:
Kelompok 6
Pendidikan Biologi A 2016

Annisa Syafigha Putri (1600374)

Husnul Khotimah (1604420)
Muhamad Erawan Dwi Arta (1604914)
Pelita Sukma Febrina (1607647)
Salma Nur Fauziyyah (1600746)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

2019
A. Judul
Isolasi DNA (Analisis Kualitatif dan Kuantitatif DNA)
B. Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Hari, tanggal : Kamis, 11 April 2019
Waktu : 07.00- 09.30 WIB
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi FPMIPA A UPI
C. Tujuan
1. Melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman;
2. Memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi
DNA.
3. Menguji kualitas DNA dari hasil isolasi DNA tanaman.
4. Menguji kuantitas DNA dari hasil isolasi DNA tanaman.
D. Landasan Teori
Struktur DNA pertaman kali diungkap oleh James Watson dan Franson Crick
pada tahun1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind
Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data yang diperoleh Watson dan
Crick membuat struktur DNA yang disebut untai ganda (double helix). Untai
ganda DNA tersusun atas dua rantai polinukleotida yang terpilin. Kedua rantai
tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin dengan
timin sebanyak dua ikatan dan antara guanin dan sitosin tiga ikatan (Triwibowo,
2005).
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dan tempanya berada (ekstraksi
atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi
atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2006). Isolasi DNA
diperlukan analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medias, atau
forensik. Para ilmuan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan
DNA ke dalam sel binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat
plikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu
memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi
 pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), Penentuan
ayah dan pabrik atau identifikasi hewan (Sadikin, 2002).
Adapun manfaat dari isolasi DNA adalah sebagai beikut.
1. Visualisasi DNA dengan elektroforsis gel.
2. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui
teknik Hibridasi Southern.
3. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
4. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.
Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan dalam prosedur
perbanyakan DNA secara in-vitro melalui teknik PCR (Sadikin, 2002).
Elektroforesis merupakan proses migrasi molekul bermuatan dalam
medium yang dialiri arus listrik (Holme dan Hazel, 1998). Westermeier (2005)
menjelaskan bahwa prinsip dasar elektroforesis adalah molekul dan partikel
bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di
bawah pengaruh medan listrik. Laju migrasi molekul bermuatan tersebut menuju
elektrode yang bermuatan negatif disebut elektromobilitas.
E. Alat dan Bahan
Tabel E.1. Alat yang digunakan pada praktikum Isolasi DNA
No. Nama Alat Jumlah
1 Mikropiper berbagai ukuran 1 Unit
2 Pipet berukuran 1 Unit
3 Tabung 1,5 ml 1 Unit
4 Tips mikropipet berbagai ukuran 1 Set
5 Saringan 1 Unit
6 Gelas kimia 1 Unit
7 Sendok 1 Unit
8 Penangas 1 Unit
9 Vorteks 1 Unit
10 Mini sentrifuga 1 Unit
11 Blender/lumpang 1 Unit
 Tabel E.2. Bahan yang digunakan dalam praktikum Isolasi DNA
No. Nama Alat Jumlah
1. Buffer ekstraksi (100 mM Tris-HCl, 1200 μl
pH 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl,
CTAB 2 %)
2. Isopropanol Secukupnya
3. Ethanol 70 % 500 μl
4. ddH2O 100 μl
5. Daun tanaman Secukupnya

Tabel E.3 Alat yang digunakan pada praktikum analisis kualitatif DNA
No. Nama Alat Jumlah
1 Elektroforesis unit 1 Unit
2 Power suply 1 Unit
3 Mikropipet digital 1 Unit
4 Transilluminator UV 1 Unit

Tabel E.4. Bahan yang digunakan dalam praktikum analisis kuantitatif

DNA
No. Nama Alat Jumlah
1 Buffer TAE 10 x (400 mM Tris Secukupnya
asetat, 10 mM EDTA pH 8)
2 Etidium Bromida 2 μl
3 Loading buffer Secukupnya
4 DNA marker Secukupnya
5 Agarose Secukupnya
F. Langkah Kerja

Diagram F. 1. Langkah Kerja Isolasi DNA.

 1. 2.
Setelah didiamankan pada suhu - Hasil isolasi DNA dimasukan ke
20°C, dianalisis menggunakan tube khusus dengan ditambahkan
alat spektrofotometer ddH2O hingga 500 mikrolit

3.
Tube dimasukkan ke mesin
spektrofotometer, sistem
dijalankan, tunggu beberapa saat
dan dilakukan tiga pengulangan
4.
Diamati dan didokumentasikan
hasil spektrofotometernya yang
tertera pada layar bagian atas
mesin

Diagram F. 2. Langkah Kerja Analasis Kantitatif

Diagram F.3 Langkah Kerja Analisis Kualitatif DNA

menggunakan Elektroforesis
G. Hasil Pengamatan
Tabel G.1 Hasil Pengamatan Analisis Kualitatif dan Kuantitatif DNA
No. Kegiatan Dokumentasi

1. Isolasi DNA

Gambar 1. Proses Isolasi DNA

(Dok. Kelompok 6A, 2019)
2. Hasil Analisis Kualitatif
DNA (Elektroforesis)
Setelah disinari UV

Gambar 2. Hasil Elektroforesis DNA

(Dok. Kelompok 6A, 2019)
3. Hasil Analisis Kuantitatif
DNA (Spektrofotometer)

Gambar 3. Hasi Spektrofotometer DNA

(Dok. Kelompok 6A, 2019)
H. Pembahasan
Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap tanaman sirih. Isolasi
DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu
mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan mengambil daun sirih yang
dihancurkan didalam tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan
membran sel dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi.
Untuk mengisolasi jaringan daun sirih, maka jaringan tanaman tersebut yang
masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya
sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung diberikan
larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas yang
merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi
hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)
yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam,
seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut
juga terdapat larutan NaCl yang berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga
mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya.
Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang
terisolasi tadi, diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi
untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada saat proses
destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan
adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi
yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS.
Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan
mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang
dapat menghambat aktivitas enzim nuclease. Kemudian sampel tersebut
dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah dihomogenkan warna larutan
berubah menjadi merah.
Sampel yang telah homogen kemudian diinkubasikan, setelah itu diberi
larutan Potassium asetat dan dihomogenkan, setelah homogeny sampel disimpan
dalam wadah berisi es. Potassium asetat adalah senyawa yang berikatan dengan
debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-
potassium aesta-protein- debris sel. Setelah itu sampel disentrifuga pada
kecepatan 13.500 rpm selam 4 menit.
Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak
dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna coklat.
Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap
ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan
sel tanaman dari zat-zat lainnya.
Kemudian, pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1)
yang berperan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom,
sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alcohol 100%.
Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-
pengotornya. DNA dalam alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan
DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap
tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan
untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi
menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan
DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang
endapan DNA pada dasar tabung.
Kemudian dilakukan uji kemurnian DNA dengan menggunakan alat
spektrofotometri. Hasil yang ditunjukkan berdasarkan uji yang dilakukan dengan
tiga kali pengulangan diperoleh rata-rata yaitu 1.172. dari hasil tersebut
menunjukkan bahwa DNA tanaman terkena kontaminasi fenol atau DNA yang
digunakan terlalu sedikit.
I. Hasil Diskusi
1. Buatlah tahapan kerja isolasi DNA dalam bentuk gambar pada buku
praktikum anda sebelum praktikum dilaksanakan.
Jawaban:

Gambar 3. Langkah Kerja Isolasi DNA

2. Hitunglah jumlah senyawa yang dimasukkan pada tahapan kerja no 5, 14, dan
18.
Jawaban: Tahapan no 5 yaitu buffer ekstraksi sebanyak 1200 µL, no 14 yaitu
Isoamil alkohol atau yang kami lakukan menggunakan isopropanol sebanyak
volume supernatan yang diambil, dan no 18 yaitu ethanol 70 % sebanyak 500
µL.
3. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam proses isolasi
DNA!
Jawaban: Fungsi dari senyawa-senyawa yang digunakan pada saat isolasi DNA
yaitu untuk menjawa agar DNA tidak rusak atau lisis pada saat proses
pengamatan dan mempercepat reaksi untuk didapatkan hasil yang maksimal
pada pengamatan DNA.
J. Kesimpulan
1. Setelah melalui praktkum, dapat melakukan isolasi DNA dengan
menggunakan daun sirih muda, sehingga dapat juga mengetahui prinsip dari
isolasi DNA yaitu menghasilkan suatu DNA tanpa adanya suatu protein atau
RNA dari sumber DNA.
2. Langkah atau tahapan yang dilakukan pada isolasi DNA yaitu dengan
menghaluskan daun, kemudian dilakukan penambahan buffer ekstraksi (1%
 SDS, 0,5 M NaCl) lalu dihomogenkan, kemudian diberikan supernatan dan
isopropanol lalu diletakkan dalam es, dimasukkan kedalam sentrifuge, DNA
dicuci menggunakan ethanol 70% kemudian di resuspensi dengan ddH2O dan
disimpan pada suhu -20°C.
3. Uji kualitas DNA dilakukan dengan menggunakan prinsip elektroforesis dan
alat elektroforesis yang telah dilakukan berhasil ditandai dengan tidak
terdapatnya smear berupa kontaminasi dari protein mapun RNA.
4. Uji kuantitas DNA dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer,
didapatkan hasil berdasarkan uji menunjukkan tingkat kemurnian yang
rendah.
 DAFTAR PUSTAKA
Holme, D. J. and Hazel P. (1998). Analytical biochemistry. Inggris.
Sadikin. (2002). Seri Biokimia: Biokimia Enzim. Jakarta: Widya Medika.
Triwibowo. (2005). Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga,
Yuwono. (2006). Teori Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Andi
YS.
Westermeier. (2004). Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice. New
Jersey: John Wiley & Sons inc.