ACARA II

DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

A. TUJUAN
1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media
untuk pertumbuhan mikroba
2. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi
3. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis
4. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba
5. Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan atau pewarnaan bakteri
6. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam.

B. TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri adalah organisme bersel tunggal dengan bentuk bulat, batang, atau spiral, tapi
beberapa jenis membentuk filamen. Kebanyakan begitu kecil bakteri dapat dilihat dengan
mikroskop cahaya hanya di bawah perbesaran tertinggi (Black,2015).
Escherichia coli termasuk dalam family Enterobacteriaceae. Bakteri ini merupakan bakteri
Gram-negatif, berbentuk batang pendek (kokobasil), mempunyai flagel, berukuran 0,4-0,7 um x
1,4 um, dan mempunyai simpai. Escherichia coli tumbuh dengan baik di hampir semua media
perbenihan, dapat meragi laktosa, dan bersifat mikroaerofilik. Escherichia coli mempunyai
antigen O, H, dan K. Saat ini telah ditemukan sekitar 150 tipe antigen O, 90 tipe antigen K, dan
50 tipe antigen H (Radji, 2009).
Jenis-jenis mikroba di alam
1. Bakteri Proteus
Termasuk family : Enterobacteriaceae, Proteus Vulgaris, Proteus Morgani
(Morganella), Proteus Mirabilis, Proteus Rettgeri (providensia). Kuman yang termasuk
genus proteus berbentuk batang, pleomorph, bergerak aktif dengan flagella peritrika dan
gram (-) tumbuh aerobe. Terdapat di alam bebas seperti air, tanah, sampah, dan tinja
(proteus vulgaris). Proteus morgani dan proteus rettgeri dapat menyebabkan infeksi
nosocomial (hospital-acquired) dan proteus morgani menyebabkan diarrhea pada anak-
anak terutam pada musim panas (Misnadiarly, Djajaningrat, 2014).
2. Bakteri Klebsiella
Termasuk family : Enterobebecteriaceae. Spesiesnya: Klebsiella pneumonia, Klebsiella
ozaenae, Klebsialla rhinoscleromatis
Mudah dibiakan dimedia sederhana (bouillon agar). Pada media padat tumbuh dengan
koloni mucoid (24 jam), putih keabuan dan permukaannya mengkilat. Ph, untuk hidup
6,0 – 7,8 dan suhu 350C. Antigen –K terdiri dari polisakarida, bersifat spesifik dan
menimbulkan immunitas yang cukup baik (Misnadiarly, Djajaningrat, 2014).
3. Bakteri Psudomonas
Termasuk family: Pseudomonadacceae. Kuman Pseudomona berbentuk batang bergerak
dan menghasilkan pigmen yang mudah larut dalam air dan berdifusi di dalam medium
pertumbuhan. Kuman ini banyak terdapat di tanah, sampah, air dan udara. Diantara 30
spesies dari Pseudomonas yang diketahui, hanya satu yang pathogen terhadap hewan
dan manusia yaitu Pseudomonas seruginosa (Misnadiarly, Djajaningrat, 2014).
4. Bakteri Vibrio
 Genus Vibrio termasuk family spirilaceae dan genus vibrio dibagi menjadi 2 tipe ialah
Vibrio coma dan Vibrio el tor. Menurut bergey’s mengenal 33 strain jenis pathogen dan
non patogen, ada yang hidupnya sapfrofit di air, air laut dan tanah. Vibrio fetus patogen
bagi manusia dan hewan, Vibrio apiseum patogen bagi ikan Vibrio coli patogen bagi
babi dan menyebabkan dysentri dan Vibrio jejani menyebabkan disenteri bagi hewan
dan keluarganya. Vibrio fetus, Vibrio coli dan Vibrio jejani hidupnya bersifat mikrofilik
(Misnadiarly, Djajaningrat, 2014).
5. Bakteri Escherichia coli
Escherich (1886) dapat mengisolasi kuman ini dari feses manusia dan hewan dan distal
jumlahnya makin menurun. Sebagai habitatnya adalah tractus digestifus dari manusia/
binatang, tanah, sampah dan air. Bayi yang baru lahir, setelah 24 jam dapat kemasukan
kuman ini dari ibunya atau perawat, dan E. coli merupakan salah satu normal flora. E.
coli mati pada pemanasan pada suhu 600C, selama 30 menit, tetapi ada juga yang
resisten. Dalam media pada suhu kamar, kuman dapat bertahan selama 1 minggu.
Beberapa strain E. coli dapat bertahan hidup dalam es selama 6 bulan. Dan sangat peka
terhadap desinfektan dan kepekaannya sama dengan streptococcus dan staphylococcus
(Misnadiarly, Djajaningrat, 2014).
6. Bakteri Shigella
Shigella merupakan kuman pathogen pada manusia dan genus Shigella termasuk dalam
tribe Escherichiae bersama genus Escherichia. Kuman ini berbentuk bataang, tidak
bergerak, tidak berspora, tidak berselubung dan gram (-), penyebab penyakit desentri
pada manusia.
Shigella yang menyebabkan disentri adalah: Shigella shiga (dysenteriae), Shigella
flexneri, Shigella boydii dan Shigella sonnei. Untuk memisahkan keempatnya
berdasarkan serologi dan reaksi biokimia (Misnadiarly, Djajaningrat, 2014).

Sterilisasi adalah proses menjadikan bahan dan media bebas dari segala bentuk kehidupan.
Teknik-teknik Sterilisasi:

a. Panas:
• Kering (udara panas): 1600Csampai 1800C selama 1 ½ sampai 3 jam; untuk alat
gelas kosong, pipet gelas, dan spuit gelas
• Lembap (panas basah): Uap yang mengalir bebas pada suhu 100 0C (sterilisasi
intermiten); untuk larutan-larutan yang termolabil (seperti gula dan susu) Autoklaf,
uap bertekanan, suhu diatas 1000C; untuk media biakan, spuit, larutan termostabil,
dan lain-lain (Cappuccino, Sherman, 2013).
b. Filtrasi (penyaringan):
• Penyaring membran selulosa-asetat dengan ukuran pori 8,0 um sampai kurang dari
0,05 um : Menghilangkan organisme dari larutan termolabil dengan melewatkan
melalui penyarig yang dapat menahan bakteri; catatan, virus tidak dihilangkan
dengan prosedur ini (Cappuccino, Sherman, 20013).
c. Kimia:
• Etilen oksida: Cawan dan pipet plastic
• Beta-propiolakton: Jaringan hidup (Cappuccino, Sherman, 2013).
d. Radiasi:
• Ionisasi: Pipet dan cawan Petri plastic (Cappuccino, Sherman, 2013).
 Teknik-teknik isolasi mikroorganisme yaitu Streak Plate, teknik ini digunakan untuk
mengisolasi kultur murni bakteri. Jarum ose yang penuh sel bakteri di goreskan di permukaan steril
pada padatan agar media nutrisi yang terkandung dalam piring petri (Atlas, 1997).

Spread Plate, dalam metode ini setetes cairan yang mengandung suspensi mikroorganisme
ditempatkan di tengah cawan petri yang berisi agar dan disebarkan di permukaan agar
menggunakan batang bengkok atau batang gelas berbentuk L (Atlas, 1997).

Pour Plate, dalam teknik ini suspensi mikroorganisme ditambahkan ke tabung yang berisi
agar meleleh didinginkan dengan sekitar 420C sampai 450C. Bakteri dan agar yang di tengah
dicampur dengan baik dan suspensi dituang ke dalam cawan petri steril menggunakan teknik
aseptik (Atlas, 1997).

Cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis adalah dengan menghindari kontak salah satu
kultur murni, media steril, dan permukaan steril dari tempat pertumbuhan dengan mencemari
mikroorganisme.Langkah-langkah untuk mentransfer kultur dari satu tempat ke yang lain yaitu:
Flame inokulasi atau transfer loop, buka dan bakar mulut tabung kultur, ambil beberapa
pertumbuhan kultur dan transfer ke media segar, bakar mulut tempat kultur dan kembali disegel ,
pijar kembali Inoklasi tersebut. Dasarnya teknik yang sama digunakan untuk mentransfer
mikroorganisme dari tempat kultur ke kaca mikroskop dan inokulasi cawan petri, kecuali cawan
tidak dipijarkan (Atlas, 1997).

Teknik-teknik pewarnaan. Jenis teknik pewarnaan: Pewarnaan sederhana menggunakan

pewarna tunggal: Untuk visualisasi bentuk morfologis (kokus, basil, dan spiral) dan susunannya
(rantai, berkelompok, berpasangan, dan tetrad). Pewarnaan diferensial mengunakan dua pewarna
yang berlawanan yaitu pemisahan ke dalam kelompok-kelompok: Pewarnaan gram, pewarnaan
tahan-asam. Visualisasi struktur: Pewarnaan flagella, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora,
pewarnaan inti (Cappuccino, Sherman, 2013).

C. ALAT DAN BAHAN

Alat :

1. Cawan petri
2. Tabung reaksi
3. Batang pengaduk, pipet volum, erlenmeyer, elemen pemanas
4. Jarum ose
5. Jarum inokulasi
6. Lampu bunsen
7. Vortex mixer
8. Spreader
9. Penjepit gelas benda
10. Gelas benda
11. Label preparat
12. Tissue
 Bahan:

1. Media Nutrien Agar (NA)

2. Media Nutrien Broth (NB)
3. Aquadest
4. Kultur murni bakteri
5. Larutan pengencer (BPW)
6. Aquadest steril
7. Alkhohol

D. SKEMA KERJA
1. Media dan Cara Pembuatan Media

Media NA (Okoid) dan NB (Okoid) di timbang. Catatan: (Buatlah 50 ml media NA untuk setiap
kelompok kecil praktikum dan 50 ml media NB untuk satu golongan praktikum). Penimbangan
media dilakukan secara teliti dan cepat. Kemudian, serbuk media dimasukkan secara hati-hati
dan cepat. Kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam Erlenmeyer.

aquadest ditambahkan dan diaduk sampai merata dengan batang pengaduk.

Dipanaskan dengan hati-hati menggunakan penangas sampai merata

dengan batang pengaduk

Sebelum diautoklaf media NA dituang dengan volume tertentu

menggunakan pipet volume.

Sebelum diautoklaf, NB dituangkan kedalam tabung reaksi untuk 6

kelompok praktikum dalam satu golongan. Masing –masing tabung
reaksi 8 ml, tabung reaksi ditutup dengan kapas atau penutup tabung.

Seluruh media disterilkan dalam tabung reaksi dengan menggunakan

autoklaf selama 15 menit.

Media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung dan
dibiarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan dibiarkan memadat,
media sisa NA dituangkan dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Media
NA 15 ml dibiarkan sampai suhu 45-500C.
 Media NB dalam tabung reaksi dibiarkan dingin. Media NA dan NB
digunakan untuk percobaan selanjutnya

2. Teknik - Teknik Pemindahan Kultur Mikroba

Media NA dan NB hasil percobaan 1 (media NA miring, media NA

tegak dan media NB/cair). Pemindahan kultur mikroba dilakukan satu
persatu untuk masing-masing media.

Tutup dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media dilonggarkan

Tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri dipegang di

tangan kiri.

Jarum ose dipegang pada tangan kanan dan dibakar di atas nyala
lampu bunsen hingga kawat memijar.

Jarum ose dipegang menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, jari
Kelingking digunakan untuk membuka (tutup tabung reaksi tetap
dipegang seperti posisi semula).

Mulut tabung reaksi dibakar, dimasukkan jarum ose dan diambil 1 ose
biakan bakteri.

Mulut tabung reaksi dibakar kembali dan ditutup kembali.

Tabung reaksi yang akan diinokulasi diambil dengan tangan kiri,

dengan cara yang sama buka tutup tabung reaksi, dan bakar mulut
tabung reaksi.

biakan bakteri diinokulasikan pada tabung reaksi inokulasi dengan

cara goresan zigzag pada permukaan NA miring.
 Mulut tabung reaksi dibakar dan tabung reaksi ditutup kembali,
kemudian bakar ose.

Diberi label : tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan

dan nama kelompok.

Dilakukan dengan cara yang sama untuk media nutrien cair/NB

menggunakan jarum ose dan media agar tegak secara tusukan tegak
lurus menggunakan jarum inokulasi.

Dinkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan amati

pertumbuhannya.

3. Teknik-teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba

a. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)

Dibuat pengenceran 10-1 – 10-6 dari kultur murni bakteri dengan

larutan pengencer.

tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri diambil, buka

dan bakar leher tabung.

0,1 ml kultur bakteri dipindahkan secara aseptis ke permukaan media

NA dalam cawan petri.

spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol dibakar,

biarkan dingin.

Ditebarkan/disebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata

dan biarkan sampai permukaan agar mongering.

Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya diinkubasi secara

terbalik selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
 Dibandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran dan
bandingkan pertumbuhannya dengan hasil teknik spread plate pada
percobaan 2 (sterilisasi secara filtrasi).
b. Pour Plate Method (Cara Tabur)

Media NA dalam tabung reaksi didinginkan sampai suhu ± 45 - 500C

(cirinya : terasa hangat di kulit/tidak ‘kemranyas’).

Tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri dibuka, dan

dibakar leher botol.

1 ml kultur murni bakteri dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang

mengandung NA secara aseptis.

Leher tabung dibakar di atas bunsen, dan dituangkan media NA yang

telah mengandung kultur murni bakteri ke dalam cawan petri.

Digoyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan

NA sampai homogen.Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada
saat penuangan media, petri bisa diletakkan dalam radius maksimal
20 cm dari sumber api.

Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24

jam. Inkubasi terbalik dilakukan setelah agar memadat. Diamati
pertumbuhannya.

c. Streak Plate Method (Cara Gores)

Jarum ose dipanaskan hingga memijar di atas bunsen, kemudian

didinginkan. Digunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada
permukaan media agar dalam cawan petri.
 Diambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan
media agar dimulai pada satu ujung. Jarum Ose disentuhkan pada
permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose
dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.

Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, ose

dipijarkan terlebih dahulu dan biarkan dingin.

Diinkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan

amati pertumbuhannya.

4. Pembuatan Pulasan Bakteri

gelas benda yang kering dan bersih dilabel. jarum ose disterilkan
dengan memijarkannya pada nyala bunsen dan dinginkan.

Jika kultur dalam bentuk cair (suspensi), diambil 1 ose penuh dan
diletakkan di tengah-tengah gelas benda dan diratakan seluas ± 1 cm2

Jika kultur dalam medium padat, diambil dengan jarum ose satu
bagian kecil kultur dan letakkan di tengah gelas benda yang
sebelumnya telah diberi aquadest steril dan ratakan

Biarkan kering dengan mengangin-anginkan gelas benda

Fiksasi pulasan bakteri dengan melewatkan di atas nyala bunsen (hati-

hati, jangan sampai terlalu kering/gosong), tergantung jenis
pengecatannya.

Pulasan bakteri siap untuk diwarnai

E. HASIL PENGAMATAN
No. Hasil Percobaan Keterangan
1. Metode streak
Keterangan
1. Media
(percobaan
gagal)
1

2. Mikroba alam
Keterangan :
1
1. Koloni
mikroba dari
2 gagang pintu
2. Koloni
mikroba dari
tempat
4 sampah
3. Koloni
5
mikroba dari
keringat
4. Media
3 5. Koloni
mikroba dari
keringat
3. Metode pour plate
Keterangan:
1. Media yang
bercampur
dengan
koloni bakteri
E.coli
1
4. Spread 10-1
Keterangan:
1. Koloni
bakteri E.coli
2. Media

5. Spread 10-2
Keterangan:
1. Media
1
2. Koloni
bakteri E.coli

2
6. Spread 10-3
Keterangan:
1. Media
2. Koloni
bakteri E.coli

7. Spread 10-4
Keterangan:
1. Media
1
2. Koloni
bakteri E.coli

2
8. Spread 10-5
Keterangan:
1. Media
2. Koloni
bakteri E.coli
1

9. Spread 10-6
Keterangan:
1. Media
2. Koloni
1 bakteri E.coli
2
10. NA tegak
Keterangan:
1. Koloni
bakteri E.coli
berbentuk
beaded
1
2. Media

11. NB tidak steril

Keterangan:
1. Koloni
bakteri E.coli
2. Media

2
12. NA miring
Keterangan:
1. Media
(gagal)

13. NB steril
Keterangan:
1. Media
(gagal)

1
F. PEMBAHASAN
Dalam praktikum dasar-dasar teknik mikrobiologi ini bertujuan untuk mempelajari cara
pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media untuk pertumbuhan
mikroba., mempelajari macam-macam teknik sterilisasi, mempelajari cara-cara pemindahan
mikroba secara aseptis, mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba, mempelajari
teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan/pewarnaan bakteri, serta mengenal
bermacam-macam mikroba alam.
Media (medium pertumbuhan) merupakan suatu bahan yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroba yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan
mikroorganisme sebagai tempat untuk pertumbuhannya dan juga sebagai kultur medium dalam
bentuk cair atau padat yang mengandung bahan alami atau sintesis yang bertujuan untuk
mendukung perkembangbiakan dan perbanyakan, identifikasi sifat-sifat fisiologis atau
pemeliharaan mikroorganisme serta perhitungan jumlah mikroba yang merupakan tujuan dalam
bidang mikrobiologi.
Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah media harus mengandung air
untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolisme. Mikroba memerlukan suplai
nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebit adalah
karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi, dan sejumlah kecil logam lainnya.
Media juga perlu mengandung garam-garam anorganik seperti protein, pepton, asam-asam
amino, dan vitamin. Suatu tekanan osmosis akan sangat mempengaruhi bakteri, tekanan osmosis
harus isotonik serta pH dan temperatur harus sesuai dan steril. Ketiadaan atau kekurangan
sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya
dapat menyebabkan kematian.
Berdasarkan komposisi kimianya terdapat media sintetik dan media nonsintetik. Media
sintetik adalah media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti dan digunakan untuk
mempelajari kebutuhan makanan mikroba, contohnya NA dan NB. Sedangkan media non
sintetik adalah media yang susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan pasti dan digunakan
untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba, contohnya air kaldu.
Media yang digunakan pada praktikum ini adalah media Nutrien Agar (NA) yang berbentuk
padat, kandungan dalam media NA adalah agar, ekstrak daging, dan pepton yang berfungsi
sebagai sumber nutrisi dan sumber nitrogen untuk bakteri, sedangkan agar berfungsi untuk
memadatkan media. Media NA pada praktikum ini digunakan pada streak plate method, spread
plate method, pour plate method, NA tegak dan NA miring. untuk bakteri E. Coli dan NA juga
digunakan untuk media dari mikroba alam. Media yang lain adalah media Nutrien Broth (NB)
yang berbentuk cair, mengandung pepton dan ekstrak daging namun tidak mengandung agar
sehingga berbentuk cair. NB pada praktikum ini digunakan pada perlakuan steril dan tidak
steril.
Aseptis adalah suatu teknik yang dilakukan pada saat pemindahan bakteri agar mencegah
kontaminasi dari udara, biasanya menggunakan lampu bunsen. Sedangkan steril adalah
pemusnahan atau pembebasan semua mikroorganisme, dengan kata lain suatu perlakuan dimana
suatu media terbebas dari kontaminan. Sterilisasi dilakukan dengan memasukkan media yang
telah jadi dan yang akan ditanam mikroba ke dalam autoklaf.
Sterilisasi secara umum memilik tiga cara seperti sterilisasi secara mekanik, fisik, dan kimia.
Pada praktikum ini sterilisasi dilakukan dengan cara sterilisasi secara fisik yaitu dengan
pemanasan ataupun penyinaran seperti pemijaran dengan cara membakar alat pada api secara
langsung, dan menggunakan uap panas bertekanan dengan menggunakan autoklaf yang bersuhu
121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Dan sterilisasi kimia dengan menggunakan bahan
kimia yaitu senyawa desinfektan seperti alkohol.
Mikroorganisme yang mengalami tekanan pada lingkungan mungkin bisa mengalami
kerusakan pada sel, mikroorganisme ini tidak akan bisa mengalami duplikasi atau penggandaan
pada lingkungan selektif media mikrobiologi yang kita buat. Untuk itu pertumbuhan
mikroorganisme ini perlu dibantu dengan menggunakan media pre enrichment , dalam hal ini
bisa digunakan Buffered Peptone Water. Komposisi dari BPW adalah gelatin yang didigesti
enzim pankreas, natrium klorida,dinatrium hidrogen fosfat, kalium hidrogen fosfat. (Copernicus,
2013)
Pada praktikum ini, jenis mikroba yang digunakan adalah Escherichia coli, bakteri pada
tempat sampah, bakteri pada gagang pintu, bakteri pada keringat, bakteri pada kaos kaki.
Escherichia coli termasuk dalam famili Entherobacteriaceae. Bakteri ini merupakan bakteri
gram negatif, berbentu batang pendek atau kokobasil, memiliki flagel berukuran 0,4-0,7 µm x
1,4 µm dan memiliki simpai. E.coli tumbuh baik di hampir semua media perbenihan, dapat
meragi laktosa dan bersifat mikroaerofilik. (Radji, 2010)
Pemindahan kultur mikroba pada NA miring dilakukan dengan cara goresan zig-zag dengan
jarum ose untuk pembuatan stok bakteri. Media NA dibuat miring agar dapat memperluas
daerah pertumbuhan bakteri sehingga bakteri dapat tumbuh secara maksimal. Perlakuan ini
dilakukan dengan tujuan untuk melihat bentuk koloni bakteri. Percobaan NA miring yang
dilakukan gagal karena pada saat mengaplikasikan jarum ose, media tergores sehingga hancur
dan bakteri susah untuk terlihat. Pada media NA tegak dilakukan dengan cara tusukan dengan
jarum inokulasi untuk melihat bentuk pertumbuhan mikroba/morfologinya. Pada praktikum
yang telah dilakukan, bakteri yang didapat pada NA tegak berbentuk beaded, yaitu berbentuk
seperti rantai-rantai mutiara, butiran sepanjang bekas inokulasi.
Pada praktikum ini NB menggunakan dua perlakuan yaitu steril dan tidak steril. Pada NB
steril mengalami proses sterilisasi dengan autoklaf sedangkan NB tidak steril, tidak mengalami
proses sterilisasi. Pada percobaan NB jika bakteri yang berkembang berada di bagian atas,
berarti bakteri butuh O2 atau dapat dikatakan bakteri merupakan jenis bakteri aerob. Apabila
bakteri berada di bagian bawah, berarti bakteri tidak membutuhkan O 2 untuk hidup, sehingga
disebut anaerob. Apabila sebagian besar bakteri berada di bagian atas, tetapi ada sedikit di
bagian bawah dan tengah, berarti bakteri tersebut membutuhkan O 2 untuk respirasi, namun tidak
sebanyak aerob sehingga disebut anaerob fakultatif. Pada praktikum ini, pada media NB tidak
steril muncul bakteri pada permukaan atas yang berarti bakteri berupa bakteri aerob karena
memerlukan O2 untuk bertahan hidup. Pada NB steril tidak ditemukan bakteri yang tumbuh
pada media.
Pengamatan pada media cawan petri dengan metode spread plate, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,
10-6 semakin banyak pengenceran yang dilakukan, maka semakin sedikit bakteri yang tumbuh
pada media tersebut. Secara teoritis, hasil percobaan yang dilakukan sudah sesuai karena
semakin besar pengenceran, konsentrasi bakteri yang tumbuh dalam media menjadi semakin
sedikit.
Teknik isolasi mikroba memiliki berbagai cara, yaitu metode spread plate, streak plate, dan
pour plate. Teknik spread plate merupakan teknik isolasi dengan cara menginokulasi kultur
mikroba secara pulasan atau sebaran di media (permukaan) agar yang telah memadat.
Tujuannya adalah untuk melihat pertumbuhan koloni bakteri pada media. Metode ini dilakukan
dengan cara mengencerkan biakan kultur mikroba karena konsentrasi sel-sel mikroba pada
umumnya tidak diketaui, maka pengenceran perlu dilakukan dengan cara memasukkan sejumlah
kultur murni bakteri ke dalam tabung yang berisi BPW. Pengenceran dilakukan dari 10 -1 sampai
10-6. Koloni diharapkan akan tumbuh di permukaan agar dengan menyerap nutrisi dari medium
pertumbuhan di bawahnya. Kelebihan teknik spread plate adalah didapatkan biakan murni
koloni bakteri yang terpisah serta memudahkan untuk pengamatan morfologi koloni yang jelas.
Kelemahan dari metode ini adalah bakteri terlalu banyak sehingga susah untuk mengidentifikasi
bakteri majemuk. Perlakuan metode spread plate dengan konsentrasi bakteri 10-2 pada praktikum
didapatkan hasil yaitu pertumbuhan bakteri yang hampir memenuhi permukaan media agar.
Teknik streak plate adalah teknik isolasi dengan cara menggoreskan suspense bahan yang
mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petr. Tujuannya
adalah untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan sehingga didapatkan koloni terpisah dan
merupakan biakan murni. Keuntungan dari metode ini adalah lebih mudah didapatkan koloni
terpisah sehingga dapat diisolasi lebih lanjut untuk mendapatkan biakan murni. Kelemahannya
adalah dibutuhkan keterampilan untuk mendapatkan hasil baik sehingga koloni terpisah.
Perlakuan metode streak plate pada praktikum didapatkan hasil yaitu tidak ada pertumbuhan
bakteri pada permukaan media agar. Hal ini tejadi karena kesalahan praktikan yang belum
memasukan bakteri ke media di cawan petri.
Teknik pour plate adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme dengan cara
mencampurkan media agar dengan kultur bakteri. Metode ini dilakukan dengan
menginokulasikan suspensi bahan yang mengandung bakteri yang telah dihomogenkan ke
dalam medium agar yang sedang mencair dan menuangkannya pada cawan petri. Perlakuan
metode pour plate pada praktikum didapatkan hasil yaitu pertumbuhan bakteri pada permukaan
media agar tumbuh secara merata.
Selain pengujian terhadap bakteri E. Coli, pada praktikum ini juga dilakukan pengujian ada
tidaknya mikroba alam pada beberapa benda. Mikroba alam diambil dari tempat sampah, bakteri
pada gagang pintu, bakteri pada keringat, bakteri pada kaos kaki. Pada praktikum ini didapatkan
hasil yaitu pada media yang ditanami dengan bakteri dari tempat sampah, gagang pintu,
keringat, dan kaos kaki terdapat mikroba yang tumbuh pada media agar. Pertumbuhan mikroba
paling banyak terdapat pada media agar yang ditanami oleh mikroba yang diambil dari gagang
pintu.
Berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya, bakteri dibedakan menjadi bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif jika dilakukan pengecatan makan akan
berwarna merah atau pink, memiliki dinding peptidoglikan yang tipis, memiliki resistensi larut
dalam alkali 1% KOH, kurang peka terhadap iodium, membentuk endotoksin, tidak ada yang
tahan asam, kurang peka terhadap penisilin, peka terhadap streptonisin, kebutuhan nutrien relatif
sederhana, lebih tahan terhadap antibiotik. Bakteri gram positif akan berwarna violet atau ungu
jika dilakukan pengecatan, memilki dinding peptidoglikan tebal, tidak larutlarut dalam alkali
1% KOH, peka terhadap iodium, membentuk eksotoksin, ada yang tahan asam, lebih peka
terhadap penisilin, tidak peka terhadap streptonisin, kebutuhan nutrien relatif kompleks (Diffen,
2015).
G. KESIMPULAN
1. Pembuatan media dalam praktikum ini yaitu media NA dan NB. NA yaitu media padat
berupa agar yang harus ditambahkan aquadest lalu dipanaskan dan dihomogenkan
menggunakan vortex. NA dan NB disterilisasi di autoklaf. Syarat media yang baik adalah
harus mengandung air, nutrisi berupa karbon, mineral, vitamin, gas serta sumber energy,
sumber nitrogen, tekanan osmose yang isotonic serta suhu dan pH netral yang sesuai.
2. Teknik-teknik sterilisasi pada praktikum mikrobiologi secara umum memiliki tiga cara
seperti sterilisasi secara mekanik yaitu filtrasi/penyaringan. Sterilisasi secara kimia dengan
menggunakan bahan kimia yaitu senyawa desinfektan seperti alcohol.
3. Pemindahan mikroba harus dilakukan secara aseptis agar mencegah adanya kontaminasi
mikroorganisme yang tidak dikehendaki. Hal ini dilakukan dengan cara meminimalisir
adanya kontaminan dengan mendekatkan media pada lampu Bunsen saat pemindahan
bakteri.
4. Teknik-teknik isolasi mikroba yang digunakan adalah spread plate, pour plate, dan streak
plate.
5. Pada percobaan ini, mikroba alam yang digunakan adalah mikroba yang terdapat pada
gagang pintu, tempat sampah, keringat orang, dan kaos kaki.
H. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2015, Petunjuk Pembuatan dan Penggunaan Buffered Peptone Water,
http://alatalatlaboratorium.com/LaboratoriumMikrobiologi/petunjuk-pembuatan-dan-
penggunaan-buffered-peptone-water , diakses pada 16 maret 2017

th
Atlas, R.M., 1997, Principles Of Microbiology, 2 ed, Wm.C. Brown Publishers, London,
pp.57, 66-68.

Black, J.G., 2015, Microbiology Principles and Explorations, 9 th ed., United States Of
America, Amerika, pp.4.

Cappuccino, J.G. dan Sherman N., 2013, Manual Laboratorium Mikrobiologi, 8 th ed, Buku
Kedokteran, State University Of New York,New York, pp.2-3.

Diffen, 2015, Gram-negative Bacteria vs Gram-positive Bacteria,

http://www.diffen.com/difference/Gram-negative_Bacteria_vs_Gram-positive_Bacteria ,
diakses tanggal 16 Maret 2017

Misnadiarly dan Djajaningrat H., 2014, Mikrobiologi Untuk Klinik Dan Laboratorium, Rineka
Cipta, Jakatra, hal.53,55,57,59,63.

Radji, Maksum., 2010, Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi & Kedokteran,
Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, hal 125.
JAWABAN PERTANYAAN:

1. Apa fungsi agar pada media pertumbuhan?

Jawab: Fungsi agar pada media pertumbuhan adalah tempat penyedia nutrisi-nutrisi yang
dibutuhkan oleh bakteri untuk tumbuh dan menumbuhkan bakteri.
2. Mengapa pada waktu inkubasi cawan petri harus diletakkan terbalik?
Jawab: karena bakteri yang tumbuh akan mengeluarkan oksigen. Oksigen yang dihasilkan akan
mengembun, sehingga jika tidak dibalik, uap air dapat jatuh diatas media dan dapat
mempengaruhi pertumbuhan bakteri.
3. Jelaskan prinsip dasar dan tujuan teknik isolasi mikroba secara streak plate, pour plate dan
spread plate!
Jawab:
a) Streak Plate
Prinsip dasar: teknik isolasi dengan cara menggoreskan suspensi bahan yang mengandung
mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri.
Tujuan: untuk mendapatkan koloni yang terpisah dan merupakan biakan murni.
b) Pour Plate
Prinsip dasar: menginokulasikan medium agar yang mencair pada temperature 45-500C
dengan suspense bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan
petri steril.
Tujuan: untuk membedakan bakteri aerob dan anaerob.
c) Stread Plate
Prinsip dasar: merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba
secara pulasan, sebaran di permukaan media agar yang telah memadat
Tujuan: untuk mendapatkan koloni yang terpisah.
4. Apa yang dimaksud dengan kultur murni/biakan murni?
Jawab: kultur murni/biakan murni adalah kultur atau biakan bakteri yang hanya terdiri dari satu
spesies mikroba, tidak ada kontaminan.
5. Bagaimana teknik penggoresan yang benar pada teknik isolasi secara streak plate agar supaya
didapatkan koloni bakteri terpisah?
Jawab: penggoresan pertama dilakukan dengan tidak ditekan dan jarak yang rapat. Ose
dipanaskan agar steril, agak didinginkan, lalu dilanjutkan goresan kedua dari goresan pertama
dengan goresan agak renggang. Jarum dipanaskan lagi, dilanjutkan goresan ketiga dengan jarak
goresan sangat renggang dan tidak mengenai goresan pertama. Pemanasan ose bertujuan untuk
mengurangi jumlah bakteri pada jarum ose, sehingga goresan lebih tipis.
6. Kapan fiksasi dilakukan dalam pengecatan bakteri? Apa tujuan dilakukannya fiksasi dalam
tahapan pengecatan bakteri?
Jawab: Fiksasi dilakukan sebelum melakukan pengecatan. Tujuan dilakukannya fiksasi dalam
tahapan pengecatan bakteri adalah agar sel-sel bakteri merenggang karena panas sehingga
mudah untuk diwarnai.
Tujuan fiksasi adalah untuk mematikan bakteri dan meletakkan sel bakteri pada objek gelas
tanpa merusak struktur selnya.