TUGAS

Nama : Kharida Zainatus Salamah

NPM : 1743050004

1 Jelaskan Apa yang dimaksud teknik PCR (Poly Chain Reaction) !

 Teknik PCR adalah teknik untuk memperbanyak DNA secara in vitro.

PCR atau yang sering disebut juga dengan reaksi berantai polymerase termasuk
salah satu metode in vitro yang digunakan dalam mensintesis sekuens tertentu
DNA menggunakan 2 primer oligonukleotida yang selanjutnya akan
menghibridisasi pita yang berlawanan dan juga akan mengapit 2 target DNA

2 Gambarkan tahapan apa saja yang terjadi dalam proses PCR !

3 Bagaimana cara menganalisis hasil PCR ?

 Hasil PCR di analisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) yang
ditambahkan larutan etidium Bromida (EtBr)
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan
suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan
ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini
dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara
rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada
berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang
menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein
bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan
penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan
listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G.,
2010)

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan
negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-
molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif
(katoda) (Klug and Cummings, 1994).

Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran,

konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala
besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat
digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap
individu (Fairbanks & Andersen, 1999).

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya

melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel
memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-
masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk,
2002).

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Davis dkk. 1994).

Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih
besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil
(kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat
ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA
relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa
dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan
konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori
kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang
lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil
karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda
positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih
baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara
band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih
tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang
sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA
kecil (Lee & Bahaman, 2010).

Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada
fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu,
DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran
molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui
matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat
meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan
resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi
terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak
lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:

1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
(Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang

bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida
dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas,
sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau
kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA
dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda
ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain
membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan
sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-
gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan
jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama
perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah
diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui
variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi
berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa
fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan
perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang
diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen,
1999).

Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada
deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan
kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang
dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita
yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak
sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).