ABSTRAK

Efek terapi oksigen hiperbarik dalam meningkatkan ekspresi e-NOS,

TNF-α dan VEGF pada penyembuhan luka

Imam Susilo*, Anita Devi, Azham Purwandhono and Sunaryo Hadi Warsito
1Department of Pathology, Faculty of Medicine, Airlangga University,
Surabaya, Indonesia
2Hyperbaric Division of Sanglah Hospital, Denpasar, Bali, Indonesia
3Department of Pathology, Faculty of Medicine, Jember University, Jember,
Indonesia
4Department of Animal Husbandry, Faculty of Veterinary Medicine, Airlangga
University, Surabaya, Indonesia

Penyembuhan luka adalah proses fisiologis yang terjadi secara progresif

dengan fase yang tumpang tindih. Oksigenasi jaringan adalah bagian penting
dari regulasi kompleks penyembuhan luka. Terapi Hyperbaric Oxygen (HBO)
adalah metode untuk meningkatkan pengiriman oksigen ke jaringan. Terapi
meningkatkan oksigenasi jaringan dan merangsang pembentukan H2O2
sebagai messenger sekunder untuk Tumor Necrosis Factor alpha (TNF α), e-
NOS, VEGF, dan Faktor Nuklir Kappa Beta fosforilasi (NF-Kb) yang
memainkan peran penting dalam transkripsi cepat berbagai gen sebagai
respons terhadap rangsangan ekstraseluler. Penelitian ini bertujuan untuk
menentukan efek terapi Oksigen Hiperbarik dalam meningkatkan ekspresi e-
NOS, TNF-α, VEGF dan penyembuhan luka. Penelitian ini adalah penelitian
hewan dengan ‘kontrol acak kelompok dengan desain pre-test dan post test'
pada 28 tikus wistar. Secara acak, tikus dibagi menjadi 4 kelompok dengan 7
tikus di setiap kelompok. Kelompok perlakuan HBO 1 menerima 5 sesi HBO
2,4 ATA dalam 3x30 menit; kelompok perlakuan HBO 2 menerima 10 sesi HBO
2.4 ATA dalam 3x30 menit; dan masing-masing kelompok kontrol tanpa HBO.
Masing-masing dari 28 tikus jantan diberi luka eksisi ketebalan penuh 1x1cm.
Pemeriksaan e-NOS, TNF-α, ekspresi VEGF dan penyembuhan luka
dilakukan pada hari-0 (pra-HBO) dan hari-5 HBO atau pada hari-0 (pra-HBO)
dan hari-10 HBO. Hasilnya menunjukkan bahwa terapi Oksigen Hiperbarik
dapat meningkatkan e-NOS (p = 0,02), TNF-α (p = 0,02), ekspresi VEGF (p =
0,02) dan penyembuhan luka (p = 0,002) secara signifikan dalam penyediaan
HBO 2.4 ATA selama 3x30 menit dalam 5 sesi selama 5 hari berturut – turut.
Sedangkan 10 sesi HBO 2.4 ATA selama 3x30 menit lebih dari 10 hari berturut-
turut hanya meningkatkan e-NOS (p = 0,02), TNF-α (p = 0,04), ekspresi VEGF
secara signifikan (p = 0,03) tetapi tidak meningkatkan penyembuhan luka
secara signifikan (p = 0,3) dibandingkan dengan tidak ada HBO. Studi ini
menyimpulkan bahwa HBO dapat meningkatkan ekspresi e-NOS, TNF-α,
VEGF dan penyembuhan luka dalam pemberian HBO 2.4 ATA selama 3x30
menit dalam 5 sesi, sedangkan 10 sesi HBO 2.4 ATA selama 3x30 menit hanya
meningkatkan e-NOS, TNF-α, ekspresi VEGF tetapi tidak meningkatkan
penyembuhan luka.
1. Pendahuluan

Penyembuhan luka adalah proses normal melalui mekanisme yang

sangat kompleks. Prosesnya terjadi secara progresif melalui fase yang
tumpang tindih; hemostasis, inflamasi, proliferasi, kontraksi dan renovasi
jaringan. Proses penyembuhan bisa diakhiri dengan fibrosis atau parut
bahkan secara kondisi optimal, yang mengakibatkan beragam kecacatan,
cedera akut hingga dapat menjadi luka kronis. Masalah luka kronis
sekarang menjadi tantangan bagi masyarakat modern yang menghasilkan
dampak medis secara ekonomi dan social yang signifikan. Luka kronis
adalah salah satu penyebab morbiditas yang paling sering terjadi di negara
berkembang.

Perkiraan 1,5% dari populasi menderita luka-luka di setiap titik waktu.

Laserasi atau luka sering ditemui setiap hari (diperkirakan 20 juta kasus
setiap tahun) sebagai akibat dari terpotong. Luka post operasi adalah
penyebab terbesar dari trauma kulit. Ada lebih dari 110 juta bedah insisi
setiap tahun, beberapa yang tidak dapat pulih sepenuhnya karena berbagai
sebab. Luka berkembang menjadi luka kronis. Sejumlah besar populasi dan
beban biaya membutuhkan perhatian serius pada deteksi dini,
pencegahan, diagnosis dan pengobatan luka kronis.

Terapi Oksigen Hiperbarik, sebagai terapi tambahan dalam

penyembuhan luka, menghasilkan peningkatan RNS terutama pada NO
melalui iNOS dan e-NOS, serta peningkatan ROS, terutama H2O2. Dosis
berlebihan RNS dan ROS merupakan ancaman bagi kelangsungan hidup
sel, sedangkan dosis terapeutik (2,4 ATA) dari HBO memberikan manfaat
positif untuk penyembuhan luka. Dalam penggunaan klinis, dosis HBO
dibatasi dari 2-2.5 ATA hingga maksimum 3 ATA selama 60-120 menit.
Terapi HBO bervariasi antara 5-30 kali. Pemberian oksigen 100% pada
tekanan 2 ATA meningkatkan oksigenasi jaringan pada 30-40 mmHg dalam
keadaan normal hingga 250-300 mmHg, sedangkan tekanan 3 ATA
memungkinkan peningkatan oksigenasi jaringan hingga 10-15 kali. Terapi
Oksigen Hiperbarik meningkatkan oksigenasi jaringan dan merangsang
pembentukan H2O2 sebagai messenger sekunder untuk fosforilasi Faktor
Nuklir Kappa Beta (NF-kB). Faktor Nuklir Kappa Beta / Rel transkripsi
protein memainkan peran penting dan cepat pada beragam gen sebagai
respons rangsangan ekstraseluler. Banyak aspek dari respon inflamasi
juga diatur oleh NF-kB, termasuk faktor-faktor produksi kaskade
komplemen dan induksi proinflamasi sitokin seperti IL1 dan TNF α.

Kelompok Tumor Necrosis Factor (TNF) terdiri dari 19 sitokin yang

memiliki peran penting dalam mengatur perkembangan dan fungsi sistem
kekebalan tubuh. Sitokin dari kelompok Tumor Necrosis Factor (TNF)
mengatur proses inflamasi dan kekebalan tubuh. Kurangnya TNF dapat
memicu kematian sel. Meskipun sitotoksisitas TNF-α mempengaruhi
beberapa sel tumor, TNF α hanya akan memicu apoptosis jika pensinyalan
NFkB terhambat. TNF α adalah aktivator NFkB, transkripsi proinflamasi
merupakan faktor-faktor yang membantu kelangsungan hidup sel melalui
aktivasi gen pro-survival dan supresi proapoptotic gen.

Neovaskularisasi memegang fungsi sentral dalam penyembuhan luka.

Studi in vitro menunjukkan bahwa VEGF, merupakan protein angiogenik
yang paling kuat, diinduksi oleh NO. Barier akan mengganggu sintesis NO
dari ekspresi VEGF dan angiogenesis, sehingga memperlambat proses
penyembuhan luka.

Terapi Oksigen Hiperbarik menekan respon inflamasi untuk mencegah

luka kronis Oksigen tambahan melalui aliran darah mempercepat proses
angiogenesis pada luka iskemik. Karena itu, untuk percepat waktu
penyembuhan. Sejumlah penelitian telah membuktikan manfaat ATA 2.4
pada HBO dengan lima sesi dan sepuluh sesi.
 Penelitian kami sebelumnya menghasilkan bahwa HBO meningkatkan
ekspresi iNOS (p = 0,001), sedangkan penyembuhan luka (p = 0,002)
signifikan pada pemberian ATA HBO 2,4 selama 3x30 menit dalam 5 sesi.
Selain itu, penyediaan 2,4 ATA HBO selama 3x340 menit dalam 10 sesi
hanya meningkatkan ekspresi iNOS secara signifikan (p = 0,002) tetapi
tidak meningkatkan penyembuhan luka secara signifikan (p = 0,3)
dibandingkan tanpa penggunaan HBO.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh terapi Oksigen

Hiperbarik (HBO) terhadap peningkatan ekspresi TNF-α dan hubungannya
dengan peningkatan ekspresi e-NOS, TNF-α dan VEGF dalam
penyembuhan luka. Penelitian ini menguji pengaruh terapi oksigen
hiperbarik (HBO) terhadap peningkatan ekspresi eNOS, TNFα dan VEGF
dengan pemeriksaan imunohistokimia dan proses penyembuhan luka
dengan mengukur area penutupan luka pada Rattus norvegicus Wistar
gallus. Hasilnya diharapkan dapat menjadi referensi untuk penyusunan
prosedur operasional standar (SOP) dari penggunaan terapi oksigen
hiperbarik (HBO) untuk penyembuhan luka di pusat perawatan kesehatan.

2. Metode

Penelitian ini merupakan penelitian acak dengan kelompok kontrol dari

tes pre dan post yang dirancang pada 28 tikus Wistar. Sampel dibagi
menjadi 4 kelompok dengan alokasi acak, masing-masing terdiri dari 7
tikus. Kelompok perlakuan 1 diberikan HBO 2.4 ATA selama 3x30 menit
dalam 5 sesi; kelompok perlakuan 2 diberi HBO 2.4 ATA selama 3x30 menit
dalam 10 sesi, dan masing-masing kelompok kontrol tanpa HBO.
Semuanya 28 tikus diberi luka irisan tebal 1x1cm. Pemeriksaan
imunohistokimiawi ekspresi eNOS, TNFα, VEGF dan pengukuran ukuran
luka dilakukan untuk menentukan penyembuhan luka. Pemeriksaan
imunohistokimia dan pengukuran ukuran luka untuk kelompok perlakuan 1
dan kelompok kontrol 1 dilakukan pada hari 0 (pra-HBO) dan hari ke 5 terapi
HBO. Pemeriksaan imunohistokimia dan pengukuran ukuran luka pada
kelompok perlakuan 2 dan kelompok kontrol 2 dilakukan pada hari ke 0 dan
hari ke 10 dari terapi HBO.

3. Hasil dan Diskusi

Penelitian ini dilakukan setelah hewan percobaan telah diaklimatisasi

selama 7 hari. Pengambilan sampel jaringan kulit dilakukan dengan
membuat luka eksisi 1x1 cm dengan ketebalan penuh pada bagian
punggung hewan percobaan. Pengambilan sampel jaringan kulit pada hari
ke 0 dilakukan pada semua hewan (total 28 sampel) pada kelompok
perlakuan dan kelompok kontrol. Perawatan kelompok diberi perlakuan
Oksigen Hiperbarik dalam 5 sesi dan 10 sesi. Luas pengukuran penutupan
luka dan pengambilan sampel jaringan dilakukan setelah perawatan
Oksigen Hiperbarik pada hari ke 5 (total 14 sampel) dan pada hari ke 10
(total 14 sampel). Slide dibuat dan pewarnaan imunohistokimia dilakukan.

Pemeriksaan imunohistokimia untuk ekspresi e-NOS, TNF-α dan VEGF

dilakukan di bawah mikroskop. Pemeriksaan ini dimaksudkan untuk
menghitung jumlah sel imunoreaktif terhadap e-NOS, TNF-α dan VEGF.
Data kuantitatif diperoleh dengan menghitung jumlah sel dalam 10 bidang
tampilan berbeda pada perbesaran 40x.

3.1 Hari 0 (Pra HBO) kondisi variabel ekspresi e-NOS, TNF-α, VEGF,
dan penyembuhan luka

Pemeriksaan e-NOS, TNF-α, ekspresi VEGF dan penyembuhan

luka dilakukan dalam kelompok dengan dan tanpa HBO sementara
luasnya luka pra HBO menerima pengobatan yang sama, yaitu
ketebalan luka eksisi penuh 1x1cm (100 mm2). Pada hari 0 ekspresi e-
NOS, TNF-α dan VEGF dalam sel-sel inflamasi dengan intensitas
rendah telah diamati.

Gambar 1. Rata-rata HBO pada Hari 0; Variabel ekspresi eNOS,

TNFα, VEGF dan ukuran luka.

3.2 Kondisi HBO dari variabel ekspresi e-NOS, TNF-α, VEGF dan
penyembuhan luka pada hari ke 5

Administrasi HBO 2.4 ATA selama 3x30 menit dalam 5 sesi

dilakukan pada kelompok perlakuan, diikuti dengan pemeriksaan e-
NOS, TNF-α, ekspresi VEGF dan ukuran luka pada kelompok perlakuan
dan kelompok kontrol. Gambar 2 menunjukkan hasil rata-rata dari
variabel ekspresi e-NOS, TNFα, VEGF dan ukuran luka. Pada hari ke 5
terdapat peningkatan ekspresi e-NOS, TNF-α, VEGF dengan intensitas
tinggi pada kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Peningkatan
ekspresi e-NOS, TNF-α, VEGF pada kelompok perlakuan lebih tinggi
dari pada kelompok kontrol. Sementara itu, penyembuhan luka di HBO
kelompok perlakuan lebih tinggi daripada kelompok kontrol (ukuran luka
lebih kecil dan penyembuhan lebih baik).
Gambar 2. Rata-rata HBO pada hari ke 5; Variabel Ekspresi dari e-

NOS, TNF-α, VEGF, dan ukuran luka.

3.3 Kondisi HBO pada hari ke 10; variabel ekspresi e-NOS, TNF-α,
VEGF, dan ukuran luka

Administrasi HBO 2,4 ATA dalam 3x30 menit setiap sesi dilakukan
10 kali dalam kelompok perlakuan dan diikuti oleh pemeriksaan ekspresi
e-NOS, TNF-α, VEGF dan ukuran luka pada kelompok perlakuan dan
kelompok kontrol dengan administrasi HBO pada hari 10. Gambar 3
menunjukkan bahwa intensitas ekspresi e-NOS, TNFα, VEGF masih
tinggi tetapi lebih rendah dari pada hari ke 5. Tidak ada yang signifikan
perbedaan variabel penyembuhan luka antara kelompok perlakuan dan
kelompok kontrol.
 Gambar 3. Rata-rata HBO pada Hari ke 10; e-NOS, TNF-α,
Ekspresi VEGF dan Ukuran Luka

Gambar 4. Ekspresi TNFα menggunakan objektif mikroskop cahaya

Olympus CX31 dengan perbesaran 40x. A: kelompok kontrol hari ke 0,
B: kelompok kontrol hari ke-5, C: kelompok kontrol hari ke 10, D:
kelompok perlakuan hari 0, E: kelompok perlakuan hari ke-5, F:
pengobatan grup hari 10. Intensitas ekspresi TNF-α masih rendah pada
kelompok control hari ke 0 tetapi intensitas hari ke-5 meningkatkan
ekspresi TNF-α, kemudian Intensitas ekspresi TNFα hari ke-10
menurun lagi.
Gambar 5. Ekspresi e-NOS di bawah mikroskop cahaya Olympus CX31
dengan objektif perbesaran 40x. A: kelompok kontrol hari ke 0, B:
kelompok kontrol hari ke 5, C: kelompok control hari ke 10, D: kelompok
pengobatan hari ke 0, E: kelompok perlakuan hari ke 5, F: kelompok
perlakuan hari ke 10. Pada kelompok kontrol hari ke 0, ekspresi e-NOS
tetap dalam intensitas rendah; Intensitas ekspresi e-NOS meningkat
pada hari ke 5 tetapi menurun lagi pada hari ke 10

Gambar 6. Ekspresi VEGF di bawah mikroskop cahaya Olympus CX31

dengan perbesaran objective 40x. A: kelompok kontrol hari ke 0, B:
kelompok kontrol hari ke 5, C: kelompok kontrol hari ke 10, D: kelompok
perlakuan hari ke 0, E: kelompok perlakuan hari ke 5, F: kelompok
 perlakuan hari ke 10. Intensitas ekspresi VEGF rendah pada kelompok
kontrol hari ke 0; Intensitas ekspresi VEGF meningkat pada hari ke 5
tetapi menurun lagi pada tanggal hari ke 10.

Hasil pemeriksaan pada ekspresi e-NOS, TNFα dan VEGF dalam

kelompok perlakuan dan kelompok kontrol pada hari ke 0 menunjukkan bahwa
ekspresi e-NOS, TNF-α dan VEGF Intensitas rendah (1-1). Setelah
administrasi HBO 2.4 ATA dalam lima sesi, pada hari ke 5 tampaknya ada
peningkatan ekspresi e-NOS, TNF-α dan VEGF (2-2) bersama dengan
peningkatan jumlah sel-sel inflamasi, di mana peningkatan ekspresi e-NOS,
TNF-α dan VEGF pada kelompok perlakuan secara signifikan lebih tinggi
daripada kelompok kontrol. Di hari ke 10 intensitas ekspresi e-NOS, TNF-α,
VEGF masih tinggi. Namun, jumlah sel yang mengekspresikannya berkurang
dan jumlah sel inflamasi tetap tinggi (2-1).

TNFα adalah regulator sitokin dan efektor utama, terutama disekresi

oleh monosit dan makrofag yang telah dirangsang. Administrasi HBO
meningkatkan produksi e-NOS dalam sel endotel yang dikultur. Beberapa
proses biologis dan faktor pertumbuhan distimulasi dan ditingkatkan dengan
Hypoxia dan HBO. Proses tersebut termasuk angiogenesis, sintesis kolagen,
aktivitas osteoklas, dan pelepasan VEGF dan TNF-α. Oksigen merangsang
proses biologis dalam kondisi hipoksia dan hiperoksia yang disebut paradoks
oksigen. Salah satu mekanisme untuk membentuk kolagen fibroblas
dirangsang melalui peroksida. Hal ini terjadi pada luka hipoksia HBO dan
selama terapi. Peroksida terbentuk di dalam terapi HBO menyerupai
rangsangan yang terjadi selama hipoksia. Mekanisme lainnya adalah Stimulasi
sitokin yang dimulai dengan hipoksia, dan peningkatan regulasi sitokin yang
didukung oleh adanya hiperoksia yang terjadi dalam terapi HBO. VEGF, TNF-
α TGF-β dan PDGFβ yang dilepaskan pada luka hipoksia sebagai stimulus
awal, tetapi aktivitasnya meningkat dengan kondisi hiperoksia, terutama pada
asam laktat.
 Bukti menunjukkan bahwa HBO dapat mempercepat penyembuhan
luka melalui mekanisme ekspresi e-NOS, TNFα dan VEGF dalam fase
inflamasi dan proliferatif. Pemberian HBO berpotensi dapat digunakan untuk
terapi ajuvan pasca-bedah untuk kasus-kasus tertentu, dengan demikian
diharapkan dapat mengurangi durasi pengobatan (Durasi Menginap / LOS) di
rumah sakit. Memang, hal ini diharapkan dapat mengurangi biaya dan waktu
pemulihan bagi pasien setelah operasi sehingga pasien dapat segera produktif
dan kegiatannya kembali normal. Oleh karena itu, kita perlu melakukan
penelitian lebih lanjut tentang efek terapi oksigen hiperbarik terhadap berbagai
jenis luka, termasuk luka yang secara konvensional sulit disembuhkan, luka
pasca trauma dan luka pasca operasi.

Bukti juga menunjukkan bahwa administrasi HBO terus menerus untuk

waktu yang lama tidak memberikan manfaat yang signifikan untuk
penyembuhan luka. Oleh karena itu, waktu istirahat (waktu pemulihan) perlu
diberikan setelah pemberian HBO tertentu dalam 5 sesi sebelum melanjutkan
ke yang berikutnya. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan
apakah ada atau tidak ada efek dari periode pemulihan dan kisaran kecepatan
penyembuhan luka / interval waktu pemulihan sebelum melakukan sesi terapi
HBO lanjutan berikutnya. Penelitian lebih lanjut dengan variasi dosis yang lebih
banyak (antara 1-5 sesi dan antara 5-10 sesi) diperlukan untuk mendapatkan
dosis optimal terapi oksigen hiperbarik untuk luka akut tanpa infeksi. Perlu
penelitian lebih lanjut dilakukan untuk menentukan interval waktu pengulangan
setelah pemberian terapi oksigen hiperbarik dalam 5 sesi (periode pemulihan)
serta penggunaan HBO sebagai terapi adjuvan untuk berbagai jenis cedera.

4. Kesimpulan

Studi ini menyimpulkan bahwa menerapkan 2,4 ATA HBO selama 3x30
menit dalam 5 sesi dapat meningkatkan ekspresi e-NOS, TNF-α, VEGF dan
mempercepat penyembuhan luka, sambil memberikan HBO 2.4 ATA
selama 3x30 menit dalam 10 sesi meningkatkan ekspresi e-NOS, TNF-α
dan VEGF tetapi tidak mempercepat penyembuhan luka.

Lebih lanjut, bukti menunjukkan bahwa pemberian HBO dapat

mempercepat penyembuhan luka dengan mekanisme e NOS, TNF-α dan,
ekspresi VEGF. Administrasi HBO dapat berpotensi untuk terapi adjuvan
pasca-bedah dan kasus-kasus tertentu seperti halnya administrasi
diharapkan dapat mempersingkat durasi perawatan di rumah sakit,
mengurangi biaya dan waktu pemulihan untuk pasien setelah operasi
sehingga mereka dapat kembali beraktivitas dengan normal.