PERCOBAAN VII

AKTIVITAS ENZIMATIK EKSTRASELULER

MIKROORGANISME (BIOKIMIA)

Tujuan:
1. Memahami fungsi enzim-enzim ekstraseluler mikroba.
2. Menetukan kemampuan mikroorganisme mengeksresikan enzim-enzim
hidrolisis ekstraseluler yang dapat menguraikan pati polisakarida, lipid
tributirin, serta protein kasein dan gelatin.
Prinsip:
Karena berukuran besar, nutrien berbobot molekul tinggi, seperti
polisakarida, lipid, dan protein tidak dapat menembus membran sel.
Makromolekul- makromolekul ini harusdi hidrolisis terlebih dahulu oleh enzim
ekstraseluler spesifik menjadi elemen-elemen dasar penyusunya. Substansi-
substansi berbobot molekul rendah ini kemudian dapat ditranspor ke dalam sel dan
digunakan untuk sintesis kebutuhan- kebutuhan protoplasmik dan produksi energi.
Prosedur berikut ini dirancang untuk menyelidiki aktivitas eksoenzimatik pada
mikroorganisme yang berbeda.

Hidrolisis pati
Pati adalah suatu polimer bercabang berbobot molekul tinggi yang tersusun
atas molekul-molekul glukosa yang saling terikat oleh ikatan glikosidik.
Pemecahan makromolekul ini mula-mula membutuhkan adanya enzim
ekstraseluler amilase untuk menghidrolisis pati menjadi polisakarida yang lebih
pendek, misalnya dekstrin, dan akhirnya menjadi molekul-molekul maltosa.
Hidrolisis akhir pada disakarida ini, yang dikatalis oleh maltase, menghasilkan
molekul-molekul glukosa yang larut dalam air dan berbobot molekul rendah;
molekul glukosa inilah yang dapat ditranspor ke dalam sel dan digunakan untuk
produksi energi melalui proses glikolisis.
Hidrolisis lipid
Lipid adalah senyawa berbobot molekul tinggi yang memiliki energo dalam
jumlah besar. Penguraian lipid seperti trigliserida dilakukan oleh enzim-enzim
penghidrolisis ekstraseluler. Ikatan- ikatan ester dalam molekul ini dengan
penambahan air untuk membentuk elemen-elemen penyusunnya, yaitu gliserol
(suatu alkohol) dan asam-asam lemak. Setelah diasimilasi ke dalam sel.
Kompone-komponen dasar ini dapa dimetabolisme lebih lanjut melalui respirasi
aerobik untuk menghasilkan energi seluler, adenosin trifosfatt (ATP). Komponen-
komponen ini juga dapat mesuk ke dalam jalur metabolisme lain untuk sintesis
kebutuhan-kebutuhan protoplasmik seluler lainnya.

Hidrolisis Kasein
Kasein, protein susu utama, adalah makromolekul yang tersusun atas
subunit asam amino yang saling terikat oleh ikatan-ikatan peptida (CO-NH).
Sebelum berasimilasi ke dalam sel. Protein-protein harus mengalami proses
penguraian yang bertahap menjadi pepton, polipeptida, dipeptida, dan akhirnya
menjadi elemen-elemen penyusunnya, yaitu asam amino. Proses ini disebut
peptonasi atau proteolisis dan diperantarai oleh enzim-enzim ekstraseluler yang
disebut protease. Fungsi protease adalah untuk memutuskan ikatan peptida CO-
NH dengan memasukkan air ke dalam molekul. Reaksi ini kemudian membebaskan
asam-asam amino.
Hidrolisis Gelatin
Meskipun manfaat gelatin sebagai sumber nutrisi di pertanyakan (gelatin
adalah protein yang tidak lengkap, yaitu tidak memiliki asam amino esensial
triptofan), manfaatnya dalam mengidenfikasi spesies bakteri telah lama dikenal.
Gelatin adalah protein yang dihasilkan oleh hidrolisis kolagen, komponen utama
jaringan ikat dan tendon pada manusia dan hewan lain. Dibawah suhu 25˚C, gelatin
akan mempertahankan sifat gelnya dan merupakan suatu padatan; pada temperatur
di atas 25˚C, gelatin berbentuk cair.
Pencairan disebabkan oleh beberapa mikroorganisme yang dapat
menghasilkan enzim ekstraseluler proteolitik yang disebut gelatinase. Yang
bekerja menghasilkan protein menjadi asam-asam amino. Setelah pengurainan
terjadi, temperatur yang sangat rendah (4 ˚C), sakalipun tidak akan mengembalikan
karakteristik gel gelatin.
Reaksi:
1. Fermentasi karbohidrat
Untuk melihat bekteri yang menghasilkan gas dan asam. Hasil
positif ditunjukkan adanya perubahan warna dari kuning ke merah,
menandakan bekteri tersebut menghasilkan asam, serta adanya gelembung
udara menandakan bekteri tersebut menghasilkan gas.
2. Reaksi katalase
Untuk melihat bakteri yang mempunyai enzim katalase. Hasil positif
ditandai dengan adanya udara setelah ditetesi H2O2.
 3. Reaksi indol
Untuk mengetahui bakteri yang menghasilkan bakteri triptofanase.
Hasil positif ditandai dengan adanya cincin merah setelah media di tetesi
reagen kovac
4. Reaksi MR
Untuk mengetahui bakteri yang bisa memfermentasi glukosa hasil
positif ditandai perubahan dari kuning menjadi merah. Ini menandakan
bakteri tersebut memfermentasik glukosa sehingga menghasilkan asam lalu
pH menjadi turun dan mempengaruhi media.
5. Reaksi VP
Sama seperti reaksi MR. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya
cincin dari merah kecoklatan menjadi ungu.
6. Reaksi sitrat
Untuk melihat bakteri yang mampu mempergunakan sitrat sebagai
sumber karbonnya.
7. TSIA
Melihat bakteri yang bisa memfermentasikan glukosa dan
menghasilkan gas.
Pembuatan reagen
1. Pembuatan media SIM
Buat suspensi media SIM dalam tabung sebanyak 3 mL. Sterilkan dalam
autoclave 121˚C selama 15 menit. Letakkan dalam posisi tegak dan simpan
dalam lemari es 2-6 ˚C
2. Pembuatan media MR-VP
Buat larutan media MR-VP ke dalam tabung sebanyak 3 mL. Sterilkan
media dalam autoclave 121 ˚C selama 15 menit
3. Pembuatan media Simon-Citrate dan TSIA
Buat larutan media SC dan TSIA ke dalam masing-masing tabung sebanyak
3 mL sterilkan media dalam autoclave 121 ˚C selama 15 menit. Miringkan
media jangan sampai menyentuh tutup tabung. Masukkan dalam lemari es
dengan suhu 2-6 ˚C.
 4. Uji gula-gula (glukosa, laktosa, sukrosa, dekstrosa, manitol)
Buat larutan air pepton sebanyak 100 mL dan masukkan ke dalam tabung
reaksi sebanyak 5 mL. Untuk mengetahui bakteri membentuk asam
tambahkan indikator fenol merah atau brom timol blue sebanyak 0,4%.
Untuk mengetahui apakah bakteri menghasilkan asam, masukkan tabung
durham dalam posisi terbalik. Untuk melihat fementasi gula-gula masukkan
larutan gula 1% ke dalam masing-masing tabung. Sterilkan media dalam
autoclave 121˚C selama 15 menit. Diamkan dalam lemari es
Alat dan bahan
Alat: tabung reaksi, tabung durham, ose, cawan petri hasil, lampu spirtus.
Bahan: media gula-gula( glukosa, lakosa, sukrosa, dekstrosa, dan manitol), air,
peptone, SIM, Simon citrate dan TSIA, suspensi bakteri, reagen kovac, alfa naftol,
dan metil red.

Prosedur kerja
1. Inokulasikan suspensi bekteri ke dalam media gula-gula, air peptone, SIM,
Simon Citrate dan TSIA.
2. Inkubasikan pada suhu 37 ˚C selama 24 jam
3. Pembacaan hasil
a. Pada media gula-gula diliat adanya gas pada tabung durham dan
perubahan warna indicator brom timol blue dari ungu menjadi kuning
atau fenol merah dari merah mejadi kuning
b. Pada media SIM (tes indol): amati perubahan bakteri pada media SIM
yang telah diinkubasi pada shu 37 ˚C selama 24 jam, tetesi dengan
reagen erlich sebanyak 5 tetes melalui dinding tabung dan baca hasilnya.
(+) terbentuk cincin merah.
c. Pada media MR (metal red test): amati pertumbuhan bakteri pada media
MR, lalu tetesi dengan reagen metal red sebanyak 5 tetes dan baca
hasilnya. (+) waran merah pad lapisan permukaan
d. Pada media VP (voges-proskeur): amati perubahan bakteri pada media
VP, kemudian tetesi dengan KOH 40% sebanyak 4 tetes dan alfa-naftol
 sebanyak 12 tetes campur, baca hasil setelah 5 menit terbentuk warna
merah jambu pada lapisan permukaan menandakan hasil positif.
e. Pada media simon citrate, amati perubahan yang terjadi
f. Pada media TSIA, amati adanya H2S, dan perubahan warna yang terjadi