KROMATOGRAFI GEL

Kromatografi gel merupakan pemengembangan prinsip pemisahan

kromatografi dimana fase diam berupa gel yang permeabel dan dapat berfungsi

sebagai penyaring. Gel sendiri merupakan jaringan tiga dimensi yang dibuat

dengan cross-linking polimer rantai panjang yang dapat menyerap air dan pelarut

polar-pelarut polar lain. Beberapa gel menerima pelarut non polar juga. Pelarut

akan diserap tergantung pada kapasitas gel, yang ditentukan oleh derajat cross-

lingking-nya. Dengan demikian, tiap gel mempunyai batas eksklusi (exclusion

limit) bagi molekul-molekul berukuran tertentu. Jika molekul tidak dapat

memasuki gel karena ukurannya besar maka molekul tersebut akan dielusi

langsung dan molekul-molekul yang lebih kecil akan masuk dalam jaringan gel

serta dielusi sesuai dengan ukurannya.

Kromatografi jenis ini digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa

dengan berat olekul tinggi dalam penelitian biokimia dan kimia polimer.

Pemisahan didasarkan pada psoses eksklusi sterik yang biasanya dilakukan untuk

partikel-partikel bermassa molekul besar. Adapun bermacam-macam gel yang

telah ada saat ini mempunyai limit eksklusi yang berbeda-beda dan tergantung

pada kebutuhannya. Adapun mekanisme pemisahan dapat dilihan secara skematis

pada gambar berikut.

Gambar 1. Ilustrasi untuk pemisahan dengan kromatografi gel

 Dalam pratiknya, proses pemisahan terjadi seperti penyaringan (sieving).

Karena gel yang digunakan bersifat permeabel, maka kromatografi gel ini sering

disebut dengan istilah kromatografi gel permeasi atau kromatografi ekslusi

sterik karena memisahkan berdasarkan ukuran sterik partikel komponen. Istilah

ini lebih umum digunakan dalam lapangan biokimia.

Gambar 2. Ilustrasi mekanisme pemisahan dengan gel permeabel

1. Beberapa Tipe Gel

Ada beberapa tipe gel yang digunakan dalam eksperimen biokimia dan

polimer selama ini. Yang utama adalah gel Sephades yang digunakan untuk

pemisahan protein dan senyawa-senyawa biokimia lainnya. Gel ini dibuat dengan

dekstran polisakarida yang dihidrolisis dengan bantuan bakteri. Tiap residu

glukosa akan memberikan karakter polar dari dekstran sebelum di cross-link

dengan epiklorhidrin membentuk gel dengan derajat porositas yang tergantung

pada kondisi polimerisasi. Sephadex tidak larut dalam air, namun stabil di dalam

asam basa lemah. Gel ini dapat memasukkan air, glikol, dimetil sulfoksida, dan

formamida, namun tidak dalam asam asetat glacial, methanol, dan etanol. Jumlah
molekul yang dapat masuk disebut dengan parameter ‘’water regain’’ yang berarti

lepasnya struktur yang terhubung dalam crosslink jaringan gel. Sephadex

mempunai beberapa jenis derajat hubung silang yang ditujukan pada bermacam-

macam aplikasi seperti terlihat pada tabel 1.

Tipe Water Regain, Limit eksklusi, Rentang Fraksionasi,

g/g Sephadex Kering (Masa molekul) Mol. Wt. Limits
G-10 1,0 700 Sampai 700
G-25 2,5 5.000 100-5.000
G-50 5,0 10.000 500-10.000
G-75 7,5 50.000 1.000-50.000
G-100 10,0 100.000 5.000-100.000
G-200 20,0 200.000 5.000-200.000

Gel lain yang tidak kalah penting dalam kromatografi jenis ini adalah Bio-

Gel yang relative lebih inert. Bio-Gel dibuat dari polimerisasiakrilamida dengan

N,N’-metilena-bis-akrilamida, tidak larut dalam air serta pelarut-pelarut organik

yang umum dan dapat bekerja di rentangan pH dari 2-11. Rentangan limit eksklusi

dari gel yang berguna untuk pemisahan senyawa-senyawa polar ini adalah 1.800-

400.000. Gel Agarose digunakan untuk memisahkan molekul bermassa lebih dari

500.000, dibuat dari bahan dasar poligalaktopiranosa. Styragel tidak larut dalam

air, namun dapat swell dalam pelarut organik. Gel yang berbahan dasar polistirena

yang sangat kaku dengan ini tersedia dalam berbagai porositas. Gel ini tahan

dalam kondisi percobaan sampai 150oC dengan pelarut-pelarut benzene,

tetrahidrofuran, triklorobenzena, dimetil sulfoksida, kloroform, karbon

tetraklorida, perkloroetilena, kresol, dan banyak lagi, namun tidak dalam air,

aseton atau alkohol-alkohol. Batas eksklusi mempunyai rentangan 1.600-

40.000.000. Karena matriksnya padat, kerja pemisahan dalam tekanan tinggi

masih dimungkinkan. Gelas berpori (Porous Glass) sering kali digunakan untuk
pekerjaan dengan tekanan tinggi karena jaringannya keras dan tahan. Gelas

berpori dibuat dengan mengontrol ukuran porinya, terdiri dari bermacam-macam

jenis.

2. Proses Pemisahan

Pada dasarnya, gel mempunyai butiran-butiran berpori yang saling

berhubungan dengan bentuk dan ukuran seragam. Ada sebagian molekul kecil

yang dapat masuk ke pori da terelusi disana, sebagian yang tidak dapat masuk ke

pori akan terelusi diluar butiran. Molekul kecil akan bebas masuk dan bergerak di

dalam interior gel dan akan terpisah menurut ukuran pori dari gel, sementara yang

berada di luar akan terpisah menurut fungsi dari ukuran butiran, kepadatan dan

derajat swelling serta jenis pelarut yang digunakan.

Ada dua jenis pelarut yang bekerja selama elusi, yakni pelarut di dalam

pori gel yang merupakan lingkungan partikel kecil selama elusi, dengan volume

Vi serta pelarut di luar pori dengan Vo yang mengelusi partikel yang lebih besar

dari pori gel, jumlahnya sama dengan volume pelarut yang mengelusi Vi partikel

kecil yang dielusi melalui pori mempunyai volume elusi Ve dan ditambah

sejumlah V1 sehingga dapat dinyatakan:

Ve = Vo + KVi…………………………………………………(1)

dimana K adalah koefisien distribusi yang mempunyai makna perbandingan

konsentrasi senyawa di dalam pelarut di dalam interior gel dan di luar jaringan

gel. Harga K juga berarti fraksi volume dari pelarut di dalam interior gel yang

dapat dinyatakan sebagai:

K = (Ve-Vo)/Vi………………………………………………..(2)
Harga Vi dapat diambil dari berat gel kering yang dapat menerima air (water

regain) WR:

Vi = a WR………………………………………………………(3)

Dimana a adalah massa gel dalam keadaan kering dan menyerap air. Sebuah

proses pemisahan (pada dasarnya adalah penyaringan) harga K berkisar antara 1

dan 1, dalam hal ini retensi senyawa di fase diam dalam kromatografi biasa

digantikan oleh ekslusi parsial. Mekanismenya agak berbeda, namun hasilnya

adalah pemisahan menurut besarnya ukuran partikel. Jika ada dua senyawa yang

mempunyai harga KA dan KB maka harga volume elusinya adalah Ve + K1V1 dan

Ve + KeVi sehingga keduanya akan terpisah dengan perbedaan sebesar (KB –

KA)vi.

Gambaran diatas adalah untuk proses penyaringan ideal dan jalannya

pemisahan mempertimbangkan kondisi geometrik dari gel. Walaupun demikian,

dalam proses penyaringan yang sering didapati adalah proses yang dipengaruhi

oleh banyak faktor, terutama faktor interaksi senyawa dengan permukaan fase

diam gel itu sendiri. Pelarut yang mengelusi akan tinggal di permukaan gel dan

ikut serta dalam menyumbangkan kerumitan tersendiri dalam proses elusi. Pelarut

dan juga partikel yang dipisahkan bisa terikat di permukaan gel dan ikut serta

dalam menyumbangkan kerumitan tersendiri dalam proses elusi. Pelarut dan juga

partikel yang dipisahkan bisa terikat di permukaan gel karena gel mengandung

gugus hidroksil aktif, padahal seharusnya mekanisme elusi hanya berdasrkan

eksklusi sterik dan bukan retensi di permukaan fasa diam. Tambahan lagi, pelarut

yang tertinggal di permukaan ini dapat berfungsi sebgai fase diam dalam
kromatografi biasa, karena akan menahan sejenak senyawa yang sedang dielusi

beberapa saat. Pemisahan yang terjadi mirip seperti kromatografi parisi. Dengan

demikian, partikel yang dipisahkan ini juga mempunyai waktu retensi yang

sebenarnya tidak diperhitungkan dalam metode gel permeasi. Hal ini diluar

pembahsan pemisahan dengan metode eksklusi sterik. Beberapa hal lain juga tidak

terhindarkan sebagai faktor-faktor yang menyumbangkan kerumitan dalam

rancangan proses.

3. Teknik Eksperimental

Kolom disiapkan sama dengan cara mempersiapkan kolom pertukaran ion

yang menggunakan resin. Butiran gel harus dibuat mengembang (swelling)

dengan pelarut yang tepat sampai mencapai kesetimbangan dalam beberapa saat

sebelum dimasukkan ke dalam kolom. Cairan harus dimasukkan dengan hati-hati

dan tidak boleh ada gelembung udara dan ditahan di kolom dengan memberikan

glasswool di ujung kolom.

Sampel dimasukkan perlahan-lahan dan elusi dijalankan dengan tekanan

tetap supaya laju alir konstan. Deteksi pemishan dilakukan dengan batuan sinar

ultraviolet, indeks refraksi serta radioaktivitas yang diuku oleh detektor.

4. Aplikasi Umum

Dalam penelitian biokimia, menghilangkan garam atau partikel kecil dari

antara makromolekul yang ada bukanlah hal yang mudah. Kromatografi gel

permeasi ini sering digunakan untuk “desalting” dalam kolom sederhana dengan

menggunakan gel Sephadex. Dilain pihak, untuk memekatkan larutan

makromolekul juga dapat dilakukan dengan menggunakan gel kering yang

higroskopis. Dengan catatan, ukuran makromolekul lebih besar dari limit

eksklusinya. Aplikasi yang paling mirip dengan kromatografi adalah fraksionasi

makromolekul. Jika ada campuran makromolekul dengan beberapa harga K maka

cara elusi dengan gel permeasi akan dipilih untuk langkah pemisahan. Dalam

perlakuan-perlakuan awal eksperimen biokimia kromatografi sering digunakan

untuk memisahkan protein, peptida, asam amino, asam nukleat, polisakarida,

hormone maupun polimer-polimer.

5. Kelebihan dan Kekurangan

1. Kelebihan kromatografi gel adalah :

a. Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik

b. Frekuensi tajam sehingga menghasilkan sensitivitas yang baik

c. Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase

stasioner

d. Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa mengganggu proses filtrasi,

sementara mempersiapkan aktivitas biologis partikel untuk memisah.

2. Kekurangan kromatografi gel adalah :

a. Hanya sejumlah frekuensi terbatas dapat diakomodasikan karena skala

waktu kromatogram pendek

b. Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran yang seragam,

seperti isomer. Diperlukan sedikitnya perbedaan 10% dari berat

molekul untuk resolusi yang masuk akal.

 TUGAS METODE PEMISAHAN KIMIA

KROMATOGRAFI GEL

OLEH :

KELOMPOK III

KIMIA B

ALISIAH ANUGRAH PRACILIA F1C1 17 036

DWI RATNA KARIM F1C1 17 040

GRACE SUUD RAMBA’ MADAO F1C1 17 044

MARSIA ANDRA F1C1 17 050

REGITA DEWI CHAHYANI F1C1 17 058

ZULKIFLI ABDUL MALIK F1C1 17 064

IIS AFRISA HAMID F1C1 17 074

RAHMA UDITA SURYA A.P. F1C1 17 084

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2019