PRAKTIKUM III

IDENTIFIKASI BAKTERI DENGAN PENGECATAN GRAM DAN UJI

BIOKIMIAWI

I. TUJUAN
A. Pengecatan Gram
Melihat bentuk sel bakteri dan identifikasi bakteri gram negatifdan gram
positif.
B. Uji Biokimiawi
Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat-sifat
biokimiawinya.

II. DASAR TEORI

A. Pengecatan Gram
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki
panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih
panjang dari pada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan
ukuran antara 0,1sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips,
bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesanter warnai
dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas
dalam hal ukuran, bentuk, susunandankeadaanstruktur internal danbutiran.
Selselindividubakteridapatberbentukseperti bola/elips, batang (silindris), atau
spiral (heliks) (Pelczar& Chan, 2007).
Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa
pewarnaan /pengecatan atau dengan pewarnaan /pengecatan. Pengamatan tanpa
pengecatan lebih sukar dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel
dengan teliti karena sel bakteri atau mikroba lainnya transparan atau semi
transparan. Dengan pengecatan, dapat dilihat struktur sel mikroba lebih seksama.
Fungsi pengecatana dalah :
 a. Memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya sehingga
memberikontras dan tampak lebih jelas,
b. Dapat untuk menunjukkan bagian-bagian struktur sel,
c. Membedakan mikroba satu dengan yang lain,
d. Menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan
intraseluler (Santika, 2018).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial danpengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar& Chan, 2007).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua
golongan, yaitu: Gram positif ,bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian
violet) tetap bertahan, dengan demikian warna sel bakteri tampak ungu tua; dan
Gram negatif, bila warna zat pewarna pertama tidak bertahan (luntur) kemudian
tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat
pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram
egatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan
struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan
itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negative pada
umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi
kandungan lipid bakteri Gram negative lebih tinggi dari pada Gram positif.
Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan
dengan alcohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas
dinding sel meningkat. Dengan demikian, kompleks karbol gentian violet dan
lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negative terwarnakan. Keterangan lain
yang hamper sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua
golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negative kandungan peptidoglikan
jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit dari pada
bakteri gram positif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negative tetap
masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan
lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram positif diperlakukan dengan lisozim untuk
menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel
tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol.
Tetapi, selini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa
struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yang menjadi tempat tertahannya zat
pewarna pertama yaitu karbol gentian violet (Razali, 1987).
Perbedaan sifat bakteri gram positif dan gram negative tidak mutlak tegas
dan spesifik, tetapi masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat
menyebabkan variasi dalam pengecatan Gram. Sel bakteri gram positif yang
berasal dari kultur yang cukup tua bisa menunjukan warna pink atau menyerupai
gram negative sehingga disarankan tidak mengunakan kultur bakteri yang berusia
di atas rentang 16-30 jam. Selain itu beberapa kultur bakteri Bacillus kadang
berubah-ubah sehingga kadang bisa berupa gram negative dan terkadang berupa
gram positif. Metode kerja pewarnaan gram ditunjukan pada gambar sebagai
berikut:

Skema pewarnaan gram (Santika, 2018).

 B. Uji Biokimia
Mikroba yang dapat digunakan sebagai indikator keamanan pangan atau sanitasi harus
dapat dideteksi dengan mudah dan cepat serta dapat dibedakan dari mikroba lainnya. Selain itu
keberadaannya pada bahan pangan harus berkorelasi dengan keberadaan patogen, sehingga
mikroba ini dapat digunakan sebagai indikator keamanan pangan. Persyaratan lain yang harus
dipenuhi oleh mikroba yang akan digunakan sebagai indikator keamanan pangan adalah
memiliki kebutuhan nutrisi atau kecepatan pertumbuhan atau laju kematian yang hampir sama
dengan patogen (Dwidjoseputro, 1994).
Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia dari bakteri
tersebut. Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka akan diketahui sifat-sifat suatu
koloni bakteri. Sifat-sifat suatu koloni tersebut ialah sifat-sifat yang ada sangkut
pautnya dengan bentuk, susunan, permukaan, pengkilatan, dan sebagainya.
Identifikasi bakteri dapat diketahui dengan menanamkan sampel bakteri dalam media
seperti media gula-gula dan penanaman dalam IMVIC. Uji IMVIC ini merupakan singkatan dari
uji Indol, Metil Red, Voges Proskauer, dan Citrate (BPOM RI, 2008).
Bakteri yang tergolong dalam grup fekal dapat memecah asam amino triptofan dan
menghasilkan suatu senyawa berbau busuk yang disebut indol. Bakteri yang telah ditumbuhkan
dalam medium yang mengandung triptofan, kemudian diberi 3-5 tetes pereaksi.Kovacs
yang mengandung amil alkohol atau diberi kristal asam oksalat. Adanya indol akan
menyebabkan amil alkohol berubah warnanya menjadi merah tua atau warna kristal
asam oksalat menjadi merah muda. Uji yang menggunakan penunjuk amil alkohol disebut
metode Kovacs (Rizali. 1987).
Percobaan-percobaan dalam uji biokimiawi mencakup berbagai uji untuk
mengetahui aktivitas metabolisme mikroba.Pengamatan aktivitas metabolisme
diketahui dari kemampuan mikroba untuk menggunakan dan menguraikan
molekul kompleks, seperti zat pati, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu
pengamatan juga dilakukan pada molekul yang sederhana seperti asam amino dan
sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian dan identifikasi
mikroba. Bebarapa uji metode biokimia yang penting antara lain (Santika, 2018).
1. Uji Katalase
Sebagian besar bakteri aerob dan bakteri anaerob fakultatif mengunakan
oksigen dalam proses metabolismenya. Sebagian besar proses
metabolisme ini akan menghasilkan senyawa hidrogen peroksida (H2O2).
Senyawa ini merupakan senyawa radikal bebas yang bersifat toksik bagi
pertumbuhan sel. Bakteri aerob dan bakteri anaerob fakultatif mampu
bertahan hidup karena memiliki enzim catalase yang mampu memecah
hydrogen peroksida menjadi senyawa air dan oksigen. Kedua senyawa ini
tidak berbahaya bagi proses metabolisme sel. Diduga bahwa bakteri yang
bersifat anaerob tidak dapat tumbuh dalam lingkungan yang mengandung
oksigen karena bakteri anaerob ini tidak memiliki enzim katalase. Reaksi
pengubahan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen ditunjukan pada
gambar sebagai berikut :

Aktifitas katalase
2. Tes Pengunaan Sitrat
Beberapa bakteri usus mampu mengunakan asam sitrat sebagai sumber
utama karbon. Metode ini berguna untuk mengelompokan bakteri gram
negative berdasarkan kemampuannya mengunakan asam sitrat sebagai
sumber karbon. Media yang sering digunakan untuk menganalisis adalah
media Simmons Citrate Agar yang mengandung indicator pH Brom
Thymol Blue (BTB), asam sitrat dan garam amonium. Bakteri yang
tumbuh pada media ini akan mengunakan asam sitrat sebagai sumber
karbon dan mengubah garam ammonium menjadi ammonia. Perubahan ini
menyebabkan perubahan komposisi media. Perubahan ini dapat dideteksi
dengan indikator BTB yang akan bewana hijau pada pH di bawah 6,9 dan
akan berwarna biru pada pH di atas 7,6. Hasil positif dengan metode ini
ditunjukan dengan media yang berubah warna menjadi biru. Hasil tes
ditunjukan pada gambar sebagai berikut :
 Hasil Tes Pengunaan Sitrat

3. Tes Dekarboksilase Lisin

Tes ini bertujuan untuk melihat organisme yang mengunakan asam amino
lysin sebagai sumber karbon. Mikroba yang mampu mengunakan lysin
sebagai sumber karbon biasanya memiliki enzim lysin dekarboksilase di
dalam selnya. Ketika lysin dikonsumsi maka akan menghasilnkan senyawa
yang dapat meningkatkan pH dari medium. Perubahan pH ini selanjutya
diamati dengan indikator. Indikator yang sering digunakan adalah Brom
Cresol Purple (BCP). Indikator ini akan ungu pada pH netral atau basa dan
akan berubah warna menjadi kuning pada pH di bawah 5,2. Pada
percobaan dengan mikroba dengan mengunakan agar Lysin Iron Agar
maka mikroba harus mengunakan glukosa terlebih dahulu sehingga
menyebabkan pH medium menjadi turun di bawah 5,2 sehingga akan
diamati perubahan media dari unggu menjadi kuning setelah 24 jam
inkubasi. Setelah pH medium turun maka enzim lysin dekarboksilase
diaktifkan oleh sel mikroba. Kultur selanjutnya diinkubasi lagi selama 24
jam sehingga mikroba sekarang mengunakan lysin sebagai sumber karbon
dan merubah pH medium menjadi basa kembali. Setelah 48 akan diamati
perubahan warna dari kuning menjadi unggu lagi. Kegagalan terjadi jika
medium tidak berubah menjadi kuning dalam waktu 24 jam atau tidak
 berubah menjadi unggu dalam waktu 48 jam. Hasil tes dekarboksilase
lysin ditunjukan pada gambar sebagai berikut :

Tes dekarboksilase lysin (kuning 24 jam, unggu 48 jam)

4. Produksi Hidrogen Sulfida (H2S)

Beberapa jenis bakteri seperti Proteus vulgaris mampu merubah asam
amino sistein.dan menghasilkan produk berupa hidrogen sulfide. Jika
bakteri ini ditumbuhkan dalam media yang mengandung garam besi maka
akan terjadi reaksi antara H2S dengan ion besi membentuk endapan iron
sulfide yang berwarna gelap. Proses produksi H2S ditunjukan pada gambar
sebagai berikut :

Produksi Hidrogen Sulfida

III. ALAT DAN BAHAN
A. Pengecatan Gram
1. Mikroskopcahaya
2. Crystal violet (Gram A)
3. Larutan iodine (Gram B)
4. Alkohol 96% (Gram C)
5. Safranin (Gram D)
6. MinyakimmersI
7. Isolatmurnibakteri
8. Gelasbenda
9. Jarumose

B. Uji Biokimia
1. Isolat murni bakteri dalam NA miring dan NB (nutrien cair)
2. Reagen untuk test katalase : 10% atau 30% H2O2
3. Bahan untuk test sitrat : Simmons Citrate Agar yang mengandung
indikator Brom Thymol Blue (BTB)
4. Bahan untuk test dekarboksilase lisin : media Lysin Iron Agar (LIA) yang
mengandung Lisin dan indikator Brom Cresol Purple (BCP)
5. Media Nutrien Agar (NA)
6. Media McConkey
7. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
8. Jarum ose
9. Mikropipet

IV. PROSEDUR KERJA

A. Pengecatan Gram

Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, kering kan dan fiksasi dengan
api.

Teteskan cat crystal violet (Gram A) dan diamkan 30 - 60 detik.

 Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.

Teteskan larutan iodine (Gram B) dan diamkan selama 1-2 menit.

Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan

peluntur) dengan alkohol (Gram C) (kira- kira 20 detik, hati-hati jangan
sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil).

Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin (Gram D) selama 10-
20 detik.

Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah

mikroskop dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi.

Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai

warna sel bakteri yang menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.

B. Uji Biokimia
1. Test Katalase
Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan tambahkan 1
ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteriStaphylococus aureus.

Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih seketika.

Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).
2. Test Penggunaan Sitrat

Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose
dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons
Citrat Agar miring,

kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam

Perhatikan perubahan warna dengan melihat perubahan warna dari hijau

menjadi biru. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

3. Test Dekarboksilase Lisin

Pada medium yang mengandung lisin (Lysin iron Agar) dan kontrol (media
tanpa lisin) diinokulasi secara tusukan dengan isolat murni bakteri,
inkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam diamati

lalu dilanjutkan lagi dengan inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam

Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning (24 jam) dan
kembali ke ungu (48 jam). Sementara pada kontrol (media tanpa lisin) tidak
terjadi perubahan warna

4. Test H2S dan Fermentasi Gula

Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolat murni bakteri secara

goresan menggunakan jarum ose dan secara tusukan menggunakan jarum
inokulasi

Inkubasikan selama 24 jam Pembentukan H2S ditunjukkan dengan

terbentuknya endapan warna hitam
Perubahan warna TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya
fermentasi gula (glukosa, sukrosa, laktosa)

Amati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya media atau
terangkatnya media ke atas. Bandingkan dengan kontrol (media tanpa
inokulasi bakteri)
 V. LEMBAR PENGAMATAN
A. Pewarnaan Gram
HASIL (Gambar)
BAKTERI Keterangan
GRAM NEGATIF GRAM POSITIF
10X

Bentuk: Bulat
Staphylococcus Pewarnaan: Sederhana
aureus 100X dengan kristal violet
Warna: Ungu

10X

Bentuk: Batang pendek

Klebsiella Pewarnaan: Sederhana
pneumonia 100X dengan kristal violet
Warna: Pink
VI. PEMBAHASAN
A. Pewarnaan Gram
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroba atau
mikroorganisme. Karena ukurannya yang sangat kecil dan sukar dilihat oleh mata
biasa, maka mikrobanya dapat dilihat menggunakan mikroskop. Melihat dan
mengamati bakteri dalam keadaan hidup merupakan hal yang sangat sulit, selain
karena bakteri tidak berwarna, bakteri juga transparan dan kecil. Bakteri yang
hidup akan kontras dengan air dimana sel-sel tersebut disuspensikan. Untuk
mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan sebuah teknik pewarnaan bakteri
sehingga sel mudah diamati. Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba
dengan teknik pewarnaan, dapat digunakan dua cara, yaitu mengamati sel mikroba
yang masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati mikroba yang telah mati dengan
diwarnai. Namun, yang paling banyak digunakan adalah mengamati mikroba
dengan diwarnai. Maka dari itu, teknik pewarnaan mikroba menjadi cara utama
yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi pada umumnya (Sumarsih, 2003).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal dan membran selselapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel
(Manurung, 2010).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spiral, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan mewarnai menggunakan zat pewarna.
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan
cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan berkembangnya teknik pewarnaan
bakteri. Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-
sifat fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar, 2007). Zat
warna akan mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba
dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan
pengamatan struktur pada mikroba yang diamati. Terdapat juga beberapa faktor
pewarnaan yang akan dipelajari dan dilakukan dalam praktikum kali ini.
(Dwidjoseputro, 1994).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,
salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna
terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan
terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+ ). Hubungan antara bakteri dengan
zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat
dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan
negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna
basa, Kristal violet, safranin dan metilen blue adalah beberapa zat pewarna basa
yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan
negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan
menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel
bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler,
1984).
Pada praktikum kali ini, digunakan bakteri staphylococcus aureus dan
klebsiella pneumonia. Pewarnaan pada bakteri dibedakan menjadi empat, yaitu
pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan negatif dan pewarnaan spora.
Yang digunakan pada praktikum ini menggunakan Pewarnaan Sederhana. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat untuk mewarnai mikroba
yang akan diamati. Pada umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan
sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik atau suka dengan basa.
Pewarnaan sederhana biasanya menggunakan pewarna tunggal yaitu kristal
Violet, Iodin, Alcohol, Safranin. Pewarnaan sederhana bertujuan untuk
memberikan kontrasantara bakteri dan latar belakang. Pewarnaan sederhana
dilakukan ketika kita ingin mengetahui informasi tentang bentuk dan ukuran sel
bakteri. Adapun gambaran pewarnaan gram yang dilakukan pada praktikum kali
ini.
 Langkah pertama yang dilakukan pada praktikum ini yaitu melakukan
sterilisasi objek gelas dan sterilisasi kawat ose. Sterilisasi dilakukan dengan
mengangin-anginkan objek gelas dan kawat ose diatas api bunsen. Tujuan dari
pemanasan objek gelas dan jarum ose adalah untuk memusnahkan atau
mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam
alat yang akan digunakan. Langkah selanjutnya adalah melakukan fiksasi dengan
cara membuat pulasan bakteri diatas objek gelas menggunakan jarum ose
sebanyak 4 tetes, kemudian objek gelas yang telah berisi bakteri dikering
anginkan diatas lampu bunsen hingga bakteri mongering tujuan dari proses fiksasi
ini adalah untuk mematikan bakteri tanpa mengubah bentuk selnya.
Setelah melakukan proses fiksasi dilanjutkan dengan pengecatan gram.
Objek gelas yang telah berisi bakteri dan melewati proses fiksasi di simpan di
atas bak warna lalu di teteskan pewarna dengan menggunakan kristal violet.
Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan
pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target.
Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme
yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri
gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap
mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau
pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Setelah didiamkan
selama 1 menit kemudian mencucinya dengan aquades. Mencuci dengan aquades
bertujuan untuk melunturkan zat pewarna berlebih yang terletak pada bakteri.
Pewarnaan yang kedua menggunakan iodin, iodin yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian iodin pada pengecatan gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Iodinyang
diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat. Kemudian dicuci dengan aquades.
Langkah yang ketiga yaitu dengan menetesi alkohol yang didiamkan
selama 30 detik. Alkohol merupakan solven organik yang berfungsi untuk
membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna
dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan
tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96%
juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding
sel.
Pewarnaan yang ke 4 menggunakan safranin yang didiamkan selama 30
detik. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini
berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama
setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna
pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna.
Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding
selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori-pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke
pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat
warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang
lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap objek gelas dengan menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan
reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas
benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu
maka termasuk golongan bakteri gram positif, dan jika terbentuk warna merah
atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

B. Uji Biokimiawi
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari
interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia.
Kemampuan bakteri menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan
sumber energi yang dapat digunakan untuk identifikasi.

Uji-uji biokimia yang dipakai dalam praktikum kali ini untuk identifikasi
bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah test penggunaan sitrat, tes
dekarboksilase lysine, dan test H2S dan fermentasi gula-gula.

Bakteri yang diuji adalah bakteri E.Coli pada pengamatan selama 48 jam
atau 2 hari, dengan menggunakan 5 jenis media yaitu media NA (Media Nutrien
Agar), media NB (Nutrient Broth), media TSIA (Triple Sugar Iron Agar), media
MC Conkey pada cawan petri, media LIA (Lysin Iron Agar) dan media SCA
(Simmons Citrat Agar). Dengan media tersebut terdapat 3 media miring pada
tabung reaksi dan 2 media datar pada cawan petri.

Nutrient Agar (NA) adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy.
NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang
tidak selektif, yaitu mikroorganisme heterotrof. Nutrient Agar merupakan salah
satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa
dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan
sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.
Nutrient Agar (NA) adalah suatu medium yang mengandung sumber nitrogen
dalam jumlah cukup yaitu 0,3% ekstrak sapi dan 0,5% pepton, tetapi tidak
mengandung sumber karbohidrat (Irianto, 2006).
Pada praktikum ini menggunakan NA pada cawan petri dan pada tabung
reaksi miring dan juga menggunakan NB. Hasil yang didapatkan semua media
cawan petri maupun tabung reaksi yang berisi NA/NB setelah diinkubasi
ditumbuhi jamur dan tidak ditumbuhi bakteri. Hal ini terjadi karena praktikan
pada saat penanaman bakteri tidak secara aseptis, sehingga menyebabkan media
NA terkontaminasi. Nutrisi yang diperlukan untuk mikroba antara lain karbon,
nitrogen, hidrogen, fosfor, oksigen, sulfur, dan zat besi. Kekurangan sumber
nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya
menyebabkan kematian. Oleh karena itu pentingnya menciptakan lingkungan
yang bersih dan higinis untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba yang tidak
terkendali.
Media Mac Conkey Agar mempunyai keistimewaan memilih bakteri
enterik gram negatif yang memfermentasikan laktosa, karena media ini
mengandung laktosa, crystal violet, dan netral red bile salt. Kemampuan E.coli
memfermentasikan laktosa menyebabkan penurunan pH, sehingga mempermudah
absorbsi netral red untuk mengubah koloni menjadi merah bata dan bile/empedu
diendapkan. Koloni lain (Proteus sp., P.aeruginosa, dan Salmonella), bila tumbuh
tidak akan berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Mikroba lain
yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Enterobacter, Proteus, Salmonella,
Shigella, Aerobacter, dan Enterococcus. Proteus sp. jika dilakukan tes akan
didapatkan hasil positif untuk motility, phenilalanine, atau trypthopan deaminase,
dan methyl red tes. Sedangkan pada hasil tes negatif untuk fermentasi laktosa,
lysin, dekarboxilase, arginine, dihidrolisi, dan malonate broth. Salmonella sp.
pada MCA tidak memfermentasikan laktosa atau disebut non lactose fermentasi,
tapi ia dapat memfermentasi glukosa, manitol, dan maltosa disertai pembentukan
asam dan gas kecuali Salmonella thyphi yang tidak menghasilkan gas.
 Tes penggunaan sitrat. Media yang dipakai adalah Simmons citrat. Tujuan
dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai
sumber karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol
Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media
berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Interpretasi hasil: negative
(-): tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya
bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang
membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman tidak menggunakan citrat sebagai
salah satu/satu-satunya sumber karbon. Positif (+): terjadinya perubahan warna
media dari hijau menjadi biru, artinya kuman menggunakan citrat sebagai salah
satu/satu-satunya sumber karbon (Ratna, 2012). Pada percobaan yang dilakukan
ternyata ada perubahan dari warna hijau menjadi biru gelap pada bagian media
yang ditanami bakteri, artinya bakteri E-coli menggunakan citrat sebagai salah
satu/satu-satunya sumber karbon.
Tes dekarboksilase lisin. Media yang dipakai adalah medium yang
mengandung lisin (Lysin Iron Agar). Uji LIA pada bakteri bertujuan untuk
melihat kemampuan mikroorganisme dalam mendekarboksilase lisin membentuk
amin kadaverin yang bersifat basa, dimana indikator bromkresol ungu dari warna
coklat berubah menjadi ungu (reaksi positif). Reaksi ini dapat disertai atau tidak
disertai dengan pembentukan gas (adanya gelembung/pecahnya agara di daerah
tusukan atau adanya endapan hitam) (Rifa. 2012). Pada percobaan yang dilakukan
dengan menggunakan bakteri E-coli menunjukan adanya reaksi positif karena
mendapatkan hasil dimana pada bagian atas medium berubah menjadi warna
ungu, artinya bakteri E-coli melakukan dekarboksilase lisin membentuk amin
kadaverin yang bersifat basa.

Tes H2S dan fermentasi gula. Media yang digunakan adalah TSIA (Triple
Sugar Iron Agar). Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan kuman
untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam
karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah phenol red
yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam
suasana asam. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa
berada di bagian lereng. Fermentasi pada TSIA juga disertai dengan pembentukan
gas CO2 yang dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Media TSIA juga
dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H2S yaitu melihat apakah
kuman memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai gugus
S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika kuman
memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar dan gugus S
akan bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan
Fe2+ membentuk warna hitam. Pada percobaan yang dilakukan dengan bakteri E-
coli mendapatkan hasil berwarna orange di dalam tabung reaksi.
VII. PENUTUP
A. Kesimpulan
Dari percobaan pewarnaan gram yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan,
pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan
sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan
menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan
pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram positif (+)
dan gram negatif (-) dengan lebih dari satu zat warna. Perbedaan pada garam
negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu
karena dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi
pada dinding selnya. Dari praktikum ini dapat disimpulkan bakteri S-aureus
merupakan bakteri gram positif sedangkan bakteri Klebsiella pneumonia bakteri
gram negatif.
Berdasarkan dari hasil praktikum yang telah dilakukan bahwa dalam uji
biokimia yang digunakan untuk mengidentifikasikan bakteri dapat dilihat bahwa
tiap jenis bakteri dapat menunjukan karakternya sendiri.

B. Saran
Diharapkan kepada para praktikan untuk menjaga kebersihan lingkungan
sekitar. Baik alat maupun benda yang kita gunakan untuk praktikum dan benda
yang kita gunakan. Untuk uji biokimiawi perlu dijelaskan tentang uji-uji yang
dilakukan dan diharapkan semua mahasiswa dapat melakukan uji biokimiawi.
 DAPTAR PUSTAKA

BPOM. 2008. Informatorium Obat Nasional Indonesia. Jakarta: Badan Pengawas

Obat dan Makanan Republik Indonesia

Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan

Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme I. Bandung:

Yrama Widya

Ratna, Siri. 2012. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. Jakarta: PT. Gramedia

Razali, U. 1987. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD

Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. Laboratorium

Mikrobiologi UNS

Pelczar, M J.dan E.C.S Chan. 2007. Dasar- dasar Mikrobiologi Jilid 1. Jakarta:
UI Press.

Santika, Martadi. 2018. Modul Praktikum Mikrobiologi dan Virologi. Denpasar:

Institut Ilmu Kesehatan Medika Persada Bali

Sumarsih, S. 2003. Mikrobiologi Dasar. Yogyakarta: Universitas Pembangunan

Nasional Veteran

Volk and Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga

 LAMPIRAN

GAMBAR KETERANGAN

Sampel bakteri Staphylococcus

aureus yang akan dilakukan
pengecatan.

Proses fiksasi bakteri

Meteskan cat crystal violet (Gram

A) dan diamkan 30 - 60 detik.
Teteskan larutan iodine (Gram B)
dan diamkan selama 1-2 menit

Di decolorisasi (di beri larutan

peluntur) dengan alkohol (Gram
C) kira- kira 20 detik.

Di tambahkan larutan safranin

(Gram D) selama 10-20 detik.
 Sampel bakteri Klebsiella
pneumonia yang akan dilakukan
pengecatan.

Proses fiksasi bakteri

Meteskan cat crystal violet (Gram

A) dan diamkan 30 - 60 detik.
Teteskan larutan iodine (Gram B)
dan diamkan selama 1-2 menit

Di decolorisasi (di beri larutan

peluntur) dengan alkohol (Gram
C) kira- kira 20 detik.

Di tambahkan larutan safranin

(Gram D) selama 10-20 detik.