LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PERCOBAAN 4
PEWARNAAN GRAM

Disusun Oleh:
Zahra Zerlina (10060317043)
Ghina Zulia R (10060317044)
Bella Khofila (10060317045)
Gina Aulia (10060317046)
Silvi Adella (10060317047)
Shift/Kelompok : B/1
Tanggal Praktikum : 04 Desember 2018
Tanggal Laporan : 11 Desember 2018
Asisten : Fitri Reginia., S.Farm.

LABORATORIUM FARMASI TERPADU UNIT D

PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
BANDUNG 1440 H/2018
I. Tujuan
1.1 Dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
1.2 Mengamati morfologi bakteri gram positif dan gram negative dengan teknik
pewarnaan gram

II. Teori Dasar

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan
struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik
dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat
dibedakan menjadi tiga macam yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial
(gram) dan pewarnaan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik
lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau
olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan
yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938)
yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara
Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia (Karmana.2008).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan,
yaitu: Gram positif, bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap
bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak ungu tua dan Gram negatif, bila
warna zat pewarna pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna
tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya.
(Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif
ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan
komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat
merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih
tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram
negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen
pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang
menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Dengan demikian,
kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif
terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan
permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif
kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih
sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif
tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan
lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk
menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa
dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel
ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur
dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna
pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai
dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding
sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori
dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap
menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu
dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Aryulina, 2004).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif
(Dwidjoseputro.2005):
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi
4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan
Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota
dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya.
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah
peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki
peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian
luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat
yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan
penyakit,spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies
gram-positif. Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif
sering bersifat toksik (racun), dan membran bagian luar membantu melindungi bakteri
gram-negatfi patogen melawawn sistem pertahanan inangnya. Lebih jauh, bakteri
gram negatif umumnya lebih resisten terhadap antibiotik dibandingkan dengan gram-
positif karena membran bagian luar itu mengahalangi masuknya obat-obatan (
Campbell, 2003 ).
Menurut Pelczar and Chan (2007) secara morfologi sel bakteri memnyai bagian-
bagian sebagai berikut:
1. Kapsul: lapisan tebal dari lendir yang membungkus sel. Fungsi kapsul adalah
melindungi sel dari kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sebagai sarana
pengikat antar sel satu dengan yang lainnya. Kapsul berhubungan dengan sifat
patogenitas dimana bakteri yang berkapsul biasanya bersifat patogen akan hilang/
berkurang. Hal ini terjadi karena kapsul melindungi bakteri dari dari sistem imun
tubuh, sehingga ketika bakteri masuk ke tubuh hospes, sistem imun tubuh tidak
mampu lelawan bakteri.
2. Dinding sel: bagian sel yang membungkus isi sel, terletak antara kapsul dan
membran sitoplasma dengan struktur sangat kaku. Tebal sel 10-35mm. Fungsi
dindiing sel adalah pelindung sel dari tekanan osmosis, memberi bentuk pada sel,
dan berperann dalam reproduksi.
3. Membran sel/sitoplasma : lapisan tipis yang bersifat permiabel, fungsinya untuk
mengatur zat-zat masuk dan keluar sel.
4. Pili : benang-benag halus yang keluar dari dinding sel (seperti filamen tetapi bukan
flagela).Jumlah pili lebih banyak, lebih pendek, dan lebih kecil dari flagela.
5. Flagela : alat gerak dari bakteri terdiri dari rambut tipis yang mencuat menembus
dinding sel dan bermula dari dasar tubuh, merupakan suatu struktur granular yang
tepat dibawah membran sel dalam sitoplasma. Flagela terdiri dari tiga bagian yaitu
tubuh dasar, struktur seperti kait dan sehellai filamen panjang di luar dinding sel.
Panjang flagel: beberapa kali panjang sel, namun diameternya lebih kecil daripada
diameter sel.
6. Kromoson : merupakan pembawa sifat yang diturunkan pada sel anakan.
7. Krommosom : bakteri tidak terbentuk membran (DNA telanjang), biasanya terdiri
dari satu sel DNA yang sirkuler
8. Plasmit : bahan genetk tambahan yang bersifat otonom.
9. Ribosom : tempat sintesis protein.

III. Alat dan Bahan

IV. Prosedur
V. Pembahasan
Pada praktikum pewarnaan gram, prinsipnya ialah kemampuan dinding sel
mengikat zat warna dasar setelah pencucian dengan alkohol untuk membedakan bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif. Pertama dibilas kaca objek dengan alkohol
hingga bebas lemak dan diflambir. Hal ini bertujuan untuk mensterilkan alat yang akan
dipakai dengan memusnahkan mikroorganisme yang terdapat pada kaca objek
sehingga tidak menganggu proses pengamatan. Kemudian, diteteskan 1 tetes suspense
bakteri setipis mungkin diatas kaca objek yang sebelumnya diberi tanda label bakteri
yang akan diamati dengan maksud agar tidak tertukar bakteri yang diamati. Setelah itu,
difiksasi menurut Karmana (2008) bahwa fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri
dan melekatkan sel bakteri pada kaca objek tanpa merusak struktur selnya.

Selanjutnya, penambahan kristal violet pada bakteri dan didiamkan selama 1

menit. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini
merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme
target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme
yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri
gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap
mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau
pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Lalu, lugol diteteskan
dan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi
semakin lebih kuat (Dwidjoseputro.2005).

Selanjutnya, diteteskan alkohol 96% di atas kaca objek tetes demi tetes sampai
bilasan terakhir tetap jernih dan dibilas dengan aquades. Etanol 96% merupakan solven
organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung
pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka
warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan
warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme(bakteri) akan tetap
berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel
(Subandi.2012).

Kemudian, diteteskan zat warna fucshin selama 30 detik berfungsi untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol
lalu di bilas aquades. Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan
pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades ini bertujuan untuk
mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Selanjutnya olesan di
tetesi emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai untuk
olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi
mikroskop. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan
air, sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa
minyak emersi (Karmana.2008)

Pada praktikum kali ini bakteri yang digunakan ialah Bacilus subtillis,
pseudomonas aeruginosa, dan Escherichia coli. Pada bakteri Bacilus subtillis yang
teramati adalah warna bakteri berwarna ungu, berbentuk tabung tidak beraturan dan
susunan bakteri berkoloni dan ada yang terpisah dari koloni. Menurut literatur B.
subtilis memiliki karakteristik gram positif, oleh karena itu tampak berwarna ungu
kebiruan setelah diperlakukan dengan pewarnaan Gram. Dari hasil pengamatan, B.
subtilis tampak memiliki bentuk batang panjang, dapat soliter ataupun membentuk
koloni bergandengan yang memanjang (Jawetz, et. al,1995). Bakteri B. Subtilis
dikatakan bakteri gram positif karena ketika hasil pengamatan didapatkan berwarna
ungu, hal ini bisa terjadi karena Bakteri gram positif adalah jenis bakteri dengan
dinding peptidoglikan yang tebal, sementara bakteri gram negatif adalah jenis bakteri
dengan dinding peptidoglikan yang tipis (seperlima dari bakteri gram positif).
Perbedaan ketebalan dinding ini mengakibatkan perbedaan kemampuan afinitas
dengan pewarna gram. Dinding peptidoglikan memiliki afinitas yang kuat dengan cat
gram, sehingga bakteri dengan dinding peptidoglikan tebal akan mengikat cat gram
dengan kuat, sehingga disebut bakteri gram positif.

Pada bakteri pseudomonas aeruginosa didapatkan hasil yaitu bakteri berwarna

ungu dengan bentuk kapsul atau batang dan susunan bakteri menyebar tidak berkoloni.
Menurut literatur Pseudomonas auroginosa merupakan bakteri gram negative yang
dapat menyebabkan penyakit pada hewan maupun pada manusia. P. aeruginosa dapat
bergerak karena memiliki flagel monotrika, berbentuk batang dan bersifat aerobik
obligat yang dapat cepat tumbuh pada berbagai tipe media (Jawetz, et. al,1995). Oleh
karena itu terdapat kesalahan yaitu bakteri pseudomonas aeruginosa berwarna ungu,
seharusnya bakteri ini berwarna merah atau pink saat diamati diatas mikroskop. Warna
merah atau pink yang seharusnya didapat karena bakteri ini merupakan bakteri gram
negatif. Warna pink atau merah yang seharusnya didapat disebabkan karena dinding
peptidoglikan tipis pada bakteri gram negatif tidak memiliki afinitas yang tinggi
dengan cat gram, sehingga disebut bakteri gram negatif. Hasil pewarnaan gram adalah
bakteri gram positif akan berwarna ungu gelap, sementara bakteri gram negatif akan
berwarna dadu atau merah (Purves dan Sadava, 2003).Kesalahan ini dapat terjadi
karena pada saat pembilasan dengan alkohol yang berfungsi sebagai penghilang warna
tidak dilakukan secara tuntas atau dengan kata lain zat warna dari Kristal violet belum
terbilas dengan bersih pada preparat sehingga ketika diamati pada mikroskop hasil
yang didapat yaitu seharusnya berwarna merah atau pink bukan ungu.

Pada bakteri Escherichia coli hasil yang didapat yaitu warna yang teramati
ungu, bentuk tabung atau kapsul tipis lebih tipis dari bakteri pseudomonas aeruginosa,
dan susunan bakteri terpisah pisah tidak berkoloni. Menurut literatur E. coli memiliki
karakteristik gram negatif, sehingga tampak berwarna merah. Dari hasil pengamatan,
E. coli tampak memiliki bentuk bervariasi dari bulat hingga batang pendek. Bakteri ini
ada yang soliter, namun ada juga yang tampak berkumpul atau berpasangan. Oleh
karena itu terdapat kesalahan yaitu seharusnya warna bakteri memiliki pewarnaan gram
negative dimana warna yang teramati seharusnya pink atau merah. Warna pink atau
merah bias terbentuk karena pada , dinding peptidoglikan tipis pada bakteri gram
negatif tidak memiliki afinitas yang tinggi dengan cat gram, sehingga disebut bakteri
gram negatif. Hasil pewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu
gelap, sementara bakteri gram negatif akan berwarna dadu atau merah (Purves dan
Sadava, 2003). Kesalahan ini dapat terjadi karena pada saat pembilasan dengan alkohol
yang berfungsi sebagai penghilang warna tidak dilakukan secara tuntas atau dengan
kata lain zat warna dari Kristal violet belum terbilas dengan bersih pada preparat
sehingga ketika diamati pada mikroskop hasil yang didapat yaitu seharusnya berwarna
merah atau pink bukan ungu.

VI. Kesimpulan
Dari percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
5.1 Bakteri gram positif berwarna ungu kebiruan setelah diperlakukan dengan
pewarnaan gram, sementara bakteri gram negatif tampak berwarna merah setelah
diperlakukan dengan pewarnaan gram.
5.2 Bakteri gram positif adalah jenis bakteri dengan dinding peptidoglikan yang tebal
sementara bakteri gram negatif adalah jenis bakteri dengan dinding
peptidoglikan yang tipis (seperlima dari bakteri gram positif).
Daftar Pustaka
Aryulina, Diah.(2004). Biologi Umum. Jakarta : Erlangga
Campbell, Nell.(2003). Bilogi Edisi Kelima Jilid 2. Jakarta : Erlangga.
Dwidjoseputro, D.(2005). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Penerbit Djambatan
Harley dan Presscot.(2002). Laboratory Exercise in Microbiology. McGraw-Hill
Publisher:USA.
Jawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F. Brooks., J.S. Butel., dan L.N. Ornston.
(1995). Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20 (Alih bahasa : Nugroho &
R.F.Maulany). Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta.
Karmana. (2008). Biologi. PT. Grafindo Media Pratama: Jakarta.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S.(2007). Elements of Microbiology. Mc Graw Hill
Book:USA
Purves, Bill dan Sadava, David.(2003). Life The Science of Biology 7th Edition. Sinauer
Associates Inc: New York
Razali, U.(1987). Mikrobiologi Dasar. FMIPA UNPAD: Bandung.
Subandi.(2012). MikroBiologi. PT. Remaja Rosdakarya: Bandung.