2.

4 Spesiasi Selenium dalam CRMs dan Jaringan Ikan

2.4.1 Pengukuran selenomethionine oleh hidrolisis enzimatik dan HPLC-ICP-MS
CRMs dan sampel beku kering beku (0,1 g) dihidrolisis menggunakan protease tipe
XIV (10 mg enzim dan 10 ml 0,1 M buffer fosfat, pH 7,5) pada suhu 37° C untuk 20 jam
dalam oven hibridisasi dan pada suhu 45° C untuk 45 menit dalam oven microwave.
Kemudian, ekstrak disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm dan supernatan disaring
melalui filter jarum suntik Acrodisc LC 13 mm dengan membran PVDF 0,2 m (Sigma,
USA). Ekstrak sampel untuk kromatografi kation selanjutnya diencerkan 1:10 v/v dengan
fase gerak. Pemisahan spesies Se dilakukan menggunakan kromatografi pertukaran anion
dan kation dalam hubungannya dengan ICP-MS. Kondisi operasi ICP-MS untuk
pengukuran Se dalam kromatografi adalah:
1. Pertukaran anion: PRP X100 (Hamilton, USA), 4,1×250 mm, 10 μm, 20 mM amonium
fosfat, pH 4,6, 1,5 mL min-1, 40° C; dan
2. Pertukaran kation: Supelcosil SCX (Supelco, USA), 4,6×250 mm, 5 m, piridin 20 mM
- format, pH 2,5, 1,5 mL min-1, 40 ° C.
SeMet diidentifikasi dengan melakukan spiking dengan standar SeMet dan
perbandingan waktu retensi dan bentuk puncak.

2.4.2 Pengukuran Selenosistein dan Selenometionin setelah Derivatisasi Diikuti oleh Hidrolisis
Enzimatik
CAM-SeCys, CAM-SeMet dan CAM-Se (IV) standar disiapkan. 6,4 mg L-SeCys2,
L-SeMet dan Se (IV) masing-masing dicampur dengan 4 mL Tris-HCl (50 mM, pH 8,6)
dalam 50 mL tabung Kimmax (Thomas Scientific, USA) menggunakan pengaduk
magnetik, kemudian dibersihkan dengan Ar pada 40° C. Tris-HCl (4 mL) yang
mengandung 100 mg dithiothreitol ditambahkan diikuti dengan penambahan 4 mL Tris-
HCl yang mengandung 224 mg iodoacetamide. Reaksi dihentikan setelah 1 jam dengan
penambahan 180 mg dithiothreitol dilarutkan dalam 4 ml Tris-HCl. Larutan kemudian
dibuat hingga 20 ml dengan air deionisasi.
CRMs dan jaringan ikan (0,1 g sampel yang dihilangkan lemak) diinkubasi dengan
2 mL larutan 7 urea dalam 0,1 M buffer fosfat, pH 7,5 dan dikocok selama 1 jam. Larutan
kemudian dicampur dengan 40 μL 0,5 M dithiothreitol dalam 0,1 M dapar fosfat (pH 7,5)
dan 165 μL 0,5 M iodoacetamide ditambahkan dan diinkubasi pada 25° C dalam gelap.
Setelah 1 jam, 225 μl larutan dithiothreitol ditambahkan dan campuran diguncang selama
1 jam untuk menghancurkan kelebihan iodoacetamide. 10 ml 0,1 M buffer fosfat, pH 7,5
dan 0,5 ml larutan protease (20 mg protease tipe XIV dalam buffer 0,1 M fosfat, pH 7,5)
ditambahkan dan sampel diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37° C. Setelah inkubasi,
sampel disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm dan supernatan disaring melalui
Acrodisc LC.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1 Pemulihan selenium yang diekstrak dari CRMs
Ada perbedaan yang signifikan antara pemulihan Se menggunakan ekstraksi berair,
hidrolisis enzimatik dan hidrolisis asam dari ketiga CRMs ((Tort χ2=20,330, df=2, p = 0,000)
 (Dolt=2=18,394, df=2, p=0,000 ) (NIST1566 χ2=22.056, df=2, p=0.000)). Analisis post hoc
menunjukkan bahwa pemulihan untuk masing-masing metode ekstraksi secara signifikan
berbeda satu sama lain (p=0,004). Untuk semua CRMs, Se yang diperoleh adalah dalam
urutan, hidrolisis asam N hidrolisis enzimatik N ekstraksi berair.
3.1.1 Ekstraksi Berair
Hanya sedikit persentase Se yang larut dalam ekstrak air. Efisiensi ekstraksi tidak
ditingkatkan dengan penambahan sistein atau SDS ke larutan ekstraksi air. Ekstraksi air pada
suhu yang lebih tinggi (160° C) dalam oven microwave memberikan respon Se yang lebih
tinggi dibandingkan dengan ekstraksi menggunakan air dan larutan buffer fosfat pada suhu
yang lebih rendah. Efisiensi ekstraksi tidak berbeda dengan waktu (30-60 menit). Dalam
penelitian ini sejumlah besar Se dilarutkan pada 160° C, namun, kemungkinan bahwa
penggunaan suhu tinggi menyebabkan beberapa ikatan protein Se dihidrolisis sehingga
melepaskan Se. Karena CRMs yang digunakan untuk mengevaluasi prosedur ekstraksi
adalah hati ikan, hepatopankreas ikan dan seluruh jaringan tiram, beberapa spesies Se yang
terlarut juga mungkin ada karena jaringan ini memproses Se yang diperoleh dari sumber
makanan seperti tanaman, bahan alga atau detrital.