Selenium merupakan suatu unsur yang cukup penting bagi manusia dan hewan, namun unsur

ini dapat berbahaya apabila ditemukan pada tubuh dalam konsentrasi tinggi.oleh karena itu perlu
dilakukan evaluasi terkait prosedur yang dilakukan untuk pemisahan dan kuantifikasi selenium.
Dalam jaringan ikan, asam selenoamino terikat secara kovalen menjadi protein, dimana 6 M HCl
digunakan untuk mengekstraksi protein Se spesies terikat. Selain itu, enzim proteolitik (proteinase K,
subtilase, pepsin dan protease, atau campuran protease dan lipase) sekarang banyak digunakan untuk
menghidrolisis dan mengekstraksi asam selenoamino dari jaringan hewan dimana efisiensi ekstraksi
menggunakan hidrolisis enzimatik sangat dipengaruhi matriks sampel, jenis enzim, kondisi ekstraksi,
rasio enzim terhadap sampel, serta waktu inkubasi.
Jurnal ini membahas prosedur terkait analisis SeMet dan SeCys karena sebagian besar Se
terikat pada protein dan diharapkan akan terjadi dalam bentuk dua asam selenoamino, yakni
selenocysteine (SeCys) dan selenomethionine (SeMet). Analisis SeMet dan SeCys dilakukan pada
otot dan jaringan hati ikan laut yang diperoleh dari lingkungan yang sedikit tercemar akibat
pembangkit listrik tenaga batu bara, dimana pada proses ekstraksi digunakan berbagai pelarut dan
prosedur ekstraksi pertama kali dievaluasi menggunakan bahan referensi bersertifikat laut (CRMs)
untuk memahami sifat Se dalam jaringan hewan laut serta proses analisis spesies Se dilakukan dengan
menggunakan (HPLC-ICP-MS).

2. Bahan dan Metode

2.1 Reagen
Reagen yang digunakan untuk persiapan standar carbamidomethylated (CAM) dan sampelnya adalah
Tris (tris (hidroksimetil) aminometana), iodoacetamide, dithiothreitol dan urea. Fase gerak untuk
kromatografi penukar anion yang mengandung 20 mM amonium fosfat, (pH 4,6) disiapkan dengan
melarutkan amonium dihidrogen fosfat dengan akuades. Fase gerak untuk kromatografi penukar
kation yang mengandung 20 mM format piridin dibuat dengan melarutkan piridin dalam akuades,
dengan pH yang disesuaikan menjadi 2,5 menggunakan asam format. Fase gerak untuk kromatografi
eksklusi ukuran yang mengandung amonium asetat 0,1 M dibuat dengan melarutkan amonium asetat
dalam akuades dan disesuaikan hingga pH 7,5 menggunakan amonia. Fase gerak untuk kromatografi
fase terbalik pasangan-ion dibuat dengan melarutkan asam Heptafluorobutyric dalam 5% v / v
metanol.
2.2 Standar
Analisis ekstrak GFAAS dilakukan dengan mengukur larutan standar (3, 6, 12, 25, 50, 100 μg l -1) dan
larutan stok (1000 mg l-1) selenit yang dibuat dengan melarutkan natrium selenit dalam akuades.
Analisis penentuan total Se menggunakan ICP-MS dibuat larutan standar (0, 1, 10, 100, 1000 μg l−1).
Analisis proses kuantifikasi SeMet menggunakan kurva kalibrasi eksternal menggunakan
HPLC-ICPMS dilakukan dengan melarutkan L-selenomethionine dalam akuades (1000 mg l-1), lalu
larutan standar disiapkan dengan mengencerkan larutan stok menjadi 0, 0,5, 1, 10, 100 μg l −1. Standar
Semethylselenocysteine dibuat dengan melarutkan Semethylselenocysteine menggunakan akuades.
Lselenocystine (SeCys2), L-SeMet dan Selenite (Se (IV)) digunakan untuk menyiapkan larutan
standar carbamidomethylated
2.3 Konsentrasi Selenium dalam CRMS dan Jaringan Ikan
Semua sampel ditempatkan dalam pendingin untuk diangkut ke laboratorium. Selanjutnya Ikan
dibedah lalu jaringan otot dan hati dikeluarkan. Jaringan dikeringkan pada suhu -80°C selama 72 jam
Ditumbuk menjadi bubuk yang homogen dengan Ika A11 Basic Analytical Mill. Sampel dimasukkan
ke dalam botol steril 30 ml dan disimpan dalam desikator sebelum dianalisis. Bahan referensi
bersertifikat (CRM) dibekukan kering sesuai jaringan ikan. Lemak dihapus dari CRMs dan jaringan
ikan laut dengan menambahkan 20 ml aseton ke 0,5 g sampel dan diaduk menggunakan stirer pada 40
rpm selama 1 jam. Larutan kemudian disentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit dan supernatan
 didekantasi ke dalam botol lain. Ekstraksi diulang dua kali dan supernatan dikumpulkan dan
dikeringkan. Residu kemudian dilarutkan dalam 1% v / v HNO3 dengan pemanasan pada 100°C
selama 60 menit konsentrasi Se dianalisis menggunakan spektrometer serapan atom Perkin Elmer
5100 PC, dilengkapi dengan koreksi latar belakang Zeeman, tungku grafit HGA-600 dan tungku grafit
HGA-600 AS-60 auto sampler. Total konsentrasi Se dalam CRMs dan jaringan ikan diukur
menggunakan prosedur pencernaan gelombang mikro. Sekitar 0,07 g jaringan kering beku ditimbang
ke dalam 7 ml Teflon digestion vessels dan ditambahkan 1 ml HNO3 pekat Digestion dilakukan dalam
oven microwave MDS 2000 dengan variasi ; 2 menit pada 600 W, 2 menit pada 0 W dan 45 menit
pada 450 W. Setelah digestion, vessels dibiarkan dingin pada suhu kamar (25°C) selama kurang lebih
60 menit dan kemudian digests diencerkan dengan akuades hingga 10 ml dalam botol polietilen. Total
konsentrasi Se dalam digests yang diencerkan ditentukan menggunakan Perkin Elmer DRC-e ICP-MS
Kalibrasi dilakukan setiap 20 sampel. Larutan Standar (103Rh) digunakan untuk menilai drift
instrumen dan perubahan tabung pompa dan laju aliran. Isotop, 77Se, 82Se dan 37Cl dimonitor untuk
mengukur Se dan potensi interferensi ke Se (m /z 77) dari 40Ar37Cl+.

2.4 Spesiasi Selenium dalam CRMs dan Jaringan Ikan

2.4.1 Pengukuran selenomethionine oleh hidrolisis enzimatik dan HPLC-ICP-MS
CRMs dan sampel beku kering beku (0,1 g) dihidrolisis menggunakan protease tipe XIV (10
mg enzim dan 10 ml 0,1 M buffer fosfat, pH 7,5) pada suhu 37° C untuk 20 jam dalam oven
hibridisasi dan pada suhu 45° C untuk 45 menit dalam oven microwave. Kemudian, ekstrak
disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm dan supernatan disaring melalui filter jarum suntik
Acrodisc LC 13 mm dengan membran PVDF 0,2 m (Sigma, USA). Ekstrak sampel untuk
kromatografi kation selanjutnya diencerkan 1:10 v/v dengan fase gerak. Pemisahan spesies Se
dilakukan menggunakan kromatografi pertukaran anion dan kation dalam hubungannya dengan
ICP-MS. Kondisi operasi ICP-MS untuk pengukuran Se dalam kromatografi adalah:
1. Pertukaran anion: PRP X100 (Hamilton, USA), 4,1×250 mm, 10 μm, 20 mM amonium fosfat, pH 4,6,
1,5 mL min-1, 40° C; dan
2. Pertukaran kation: Supelcosil SCX (Supelco, USA), 4,6×250 mm, 5 m, piridin 20 mM - format, pH
2,5, 1,5 mL min-1, 40 ° C.
SeMet diidentifikasi dengan melakukan spiking dengan standar SeMet dan perbandingan waktu
retensi dan bentuk puncak.
2.4.2 Pengukuran Selenosistein dan Selenometionin setelah Derivatisasi Diikuti oleh Hidrolisis Enzimatik
CAM-SeCys, CAM-SeMet dan CAM-Se (IV) standar disiapkan. 6,4 mg L-SeCys2, L-SeMet
dan Se (IV) masing-masing dicampur dengan 4 mL Tris-HCl (50 mM, pH 8,6) dalam 50 mL tabung
Kimmax (Thomas Scientific, USA) menggunakan pengaduk magnetik, kemudian dibersihkan dengan
Ar pada 40° C. Tris-HCl (4 mL) yang mengandung 100 mg dithiothreitol ditambahkan diikuti dengan
penambahan 4 mL Tris-HCl yang mengandung 224 mg iodoacetamide. Reaksi dihentikan setelah 1
jam dengan penambahan 180 mg dithiothreitol dilarutkan dalam 4 ml Tris-HCl. Larutan kemudian
dibuat hingga 20 ml dengan air deionisasi.
CRMs dan jaringan ikan (0,1 g sampel yang dihilangkan lemak) diinkubasi dengan 2 mL
larutan 7 urea dalam 0,1 M buffer fosfat, pH 7,5 dan dikocok selama 1 jam. Larutan kemudian
dicampur dengan 40 μL 0,5 M dithiothreitol dalam 0,1 M dapar fosfat (pH 7,5) dan 165 μL 0,5 M
iodoacetamide ditambahkan dan diinkubasi pada 25° C dalam gelap. Setelah 1 jam, 225 μl larutan
dithiothreitol ditambahkan dan campuran diguncang selama 1 jam untuk menghancurkan kelebihan
iodoacetamide. 10 ml 0,1 M buffer fosfat, pH 7,5 dan 0,5 ml larutan protease (20 mg protease tipe
XIV dalam buffer 0,1 M fosfat, pH 7,5) ditambahkan dan sampel diinkubasi selama 20 jam pada suhu
37° C. Setelah inkubasi, sampel disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm dan supernatan
disaring melalui Acrodisc LC.
 3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Pemulihan selenium yang diekstrak dari CRMs
Ada perbedaan yang signifikan antara pemulihan Se menggunakan ekstraksi berair, hidrolisis
enzimatik dan hidrolisis asam dari ketiga CRMs ((Tort χ2=20,330, df=2, p = 0,000) (Dolt=2=18,394,
df=2, p=0,000 ) (NIST1566 χ2=22.056, df=2, p=0.000)). Analisis post hoc menunjukkan bahwa
pemulihan untuk masing-masing metode ekstraksi secara signifikan berbeda satu sama lain (p=0,004).
Untuk semua CRMs, Se yang diperoleh adalah dalam urutan, hidrolisis asam N hidrolisis enzimatik N
ekstraksi berair.
3.1.1 Ekstraksi Berair
Hanya sedikit persentase Se yang larut dalam ekstrak air. Efisiensi ekstraksi tidak ditingkatkan
dengan penambahan sistein atau SDS ke larutan ekstraksi air. Ekstraksi air pada suhu yang lebih
tinggi (160° C) dalam oven microwave memberikan respon Se yang lebih tinggi dibandingkan dengan
ekstraksi menggunakan air dan larutan buffer fosfat pada suhu yang lebih rendah. Efisiensi ekstraksi
tidak berbeda dengan waktu (30-60 menit). Dalam penelitian ini sejumlah besar Se dilarutkan pada
160° C, namun, kemungkinan bahwa penggunaan suhu tinggi menyebabkan beberapa ikatan protein
Se dihidrolisis sehingga melepaskan Se. Karena CRMs yang digunakan untuk mengevaluasi prosedur
ekstraksi adalah hati ikan, hepatopankreas ikan dan seluruh jaringan tiram, beberapa spesies Se yang
terlarut juga mungkin ada karena jaringan ini memproses Se yang diperoleh dari sumber makanan
seperti tanaman, bahan alga atau detrital.
3.1.2 Hidrolisis Enzimatik
Penggunaan semua enzim kecuali protease tipe XIV untuk pemulihan Se akan menghasilkan
hasil yang rendah (2 – 38%) di mana pemulihan terbaik yaitu ketika digunakan protease tipe XIV
dengan hasil pemulihan Se (72 – 82%). Pemulihan Se menggunakan pemanasan konvensional akan
meningkat dengan waktu ekstraksi yang lebih lama yaitu 20 jam (72 – 82%) dibandingkan dengan
waktu 8 jam (37 – 45%). Sedangkan pemulihan Se dengan pemanasan menggunakan microwave akan
dihasilkan hasil yang rendah apabila pemanasan dilakukan lebih dari 45 menit (45 menit dihasilkan 61
– 69% dan 60 menit dihasilkan 26 – 34%). Pemulihan Se yang terbaik adalah menggunakan protease
tipe XIV, hal ini dikarenakan menjadi campuran setidaknya tiga zat aktif proteolitik termasuk serin
ekstraseluler yang menghasilkan hidrolisis ikatan peptide lebih besar. Keterbatasan penggunaan enzim
spesifik telah tertulis dalam literatur. Menurut Moreno et al., ketika Pronase E digunakan dalam media
fosfat akan diperoleh endapan Ca3(PO4)2 karena kandungan Ca yang tinggi dari enzim komersial
dapat mengurangi kemampuan ekstraksi enzim. Menurut Wrobel et al., proeinase K dapat memotong
ikatan peptida yang mengandung gugus amino residu asam amino hidrofobik. Dimana sudah
diprediksiskan bahwa peptida yang mengandung metionin berbeda akan terbentuk dengan tidak
melepas asam amino bebas. Enzim driselase hanya membebaskan Se yang terikat ke dinding sel,
enzim lipase akan menghidrolisis lemak. Dengan demikian penggunaan enzim ini sendiri tidak akan
melepaskan Se dari bahan protein.
Penggunaan ekstraksi aseton sebelum protease tipe XIV memberikan pemulihan Se yang lebih
tinggi. Dalam sampel ikan terliofilisasi, lipid dapat mencapai 40% massa. Kehadiran lipid ini dapat
mempengaruhi ekstraksi dan derivatisasi yang akan menyebabkan pembusukan kolom kromatografi.
Oleh karena itu, untuk menghindari kemungkinan gangguan lemak, aseton digunakan untuk
menghilangkan lemak dari CRMs dan jaringan ikan.
3.1.3 Hidrolisis Asam
Ekstraksi menggunakan asam metanasulfonat (MSA) lebih efisien yaitu sebesar (89 – 94%)
dibandingkan menggunakan HCl yaitu sebesar (55 – 75%). Dengan pemanasan yang lebih lama
tingkat efisiensi ekstraksi meningkat (30 menit 78 – 85%). Pemulihan Se terbaik diperoleh dengan
menggunakan MSA pada 160oC selama 45 menit. MSA sendiri telah digunakan secara luas untuk
ekstraksi Se dari ragi dan kacang-kacang an dan memberikan hasil ekstraksi 20 – 50% lebih tinggi
 daripada menggunakan enzim. Selain kelebihan tersebut terdapat juga kekurangan dalam penggunaan
MSA yaitu ekstrak asam harus diencerkan 100 kali lipat dan pengencaran sebesar itu dapat
menurunkan konsentrasi Se ke tingkat yang tidak bias diukur dengan ICP-MS.

3.2 Stabilitas Spesies Selenium

Stabilitas spesies Se dievaluasi dengan mencerna 10 μg Se solusi standar SeMet dan SeCys2
yang mengandung 1% b/v sistein menggunakan hidrolisis enzimatik dengan protease tipe XIV pada
37°C selama 20 jam dan MSA menggunakan pemanasan dengan bantuan gelombang mikro selama 45
menit pada 160°C. SeMet stabil ketika dicerna dengan protease tipe XIV (95 ± 6% pemulihan, n = 5)
tetapi SeCys2, tidak stabil. Hidrolisis dengan MSA diperoleh paling banyak dari CRMs. Pemulihan
SeMet dalam ekstrak MSA adalah 78 ± 13% (n = 5) sementara SeCys2 semuanya terdegradasi.
Berdasarkan hasil ini, hidrolisis enzimatik dengan dan tanpa derivatisasi SeCys dikembangkan lebih
lanjut untuk kuantifikasi SeMet dan SeCys dalam jaringan ikan.

3.3. Pengukuran selenomethionine dalam CRMs dan jaringan ikan setelah protease tipe XIV
hidrolisis tanpa derivatisasi
Pengukuran selenomethionine dalam CRMs dan jaringan ikan, sesuai dengan nilai yang
dipublikasikan untuk DOLT 4 (8,3 ± 1,3 μg / g), TORT 2 (5,63 ± 0,67 μg / g) dan RM 50 (3,6 ± 0,4
μg / g). Jumlah Se yang diekstraksi dari CRMs dan jaringan ikan, merupakan hasil dari hidrolisis
enzimatik dengan protease XIV menggunakan pemanasan konvensional dan gelombang mikro.
Penggunaan pemanasan konvensional memberikan pemulihan Se yang lebih besar (76 ± 6%, n = 3)
daripada microwave ekstraksi berbantuan (66 ± 7%, n = 3) untuk CRMs dan jaringan ikan. Ketika
menganalisis ekstrak jaringan ikan juga didapatkan puncak yang tidak diketahui yang dielusi di dekat
void area yang tidak dapat disesuaikan dengan spesies Se yang diketahui. Untuk CRM, konsentrasi Se
dari puncak eluting dalam area kosong pada 1,8 menit dihitung menggunakan standar SeCys2. Puncak
eluting pada 2,4 menit tidak dikuantifikasi. Selenasi dielusi sekitar 13 menit pada kolom penukar
anion karena selenat hadir sebagai anion dengan dua muatan negatif pada pH 4,6. Selenite terelusi
sekitar 2,7 menit karena muatan mono negatifnya. Kehadiran selenat dalam sampel akan jelas, tetapi
selenit akan terelusi dengan spesies Se lainnya seperti selenomethyl selenocystine. Tidak ditemukan
puncak pencocokan waktu retensi untuk selenit dan selenat yang teramati dalam ekstrak. Awalnya,
ketika ekstrak sampel pekat dikromatografi menggunakan kromatografi penukar kation, beberapa
puncak ditemukan, satu dielusi dalam void area dan puncak lainnya pada waktu retensi standar SeMet
diharapkan akan dielusi. Namun, karena adanya konsentrasi garam yang tinggi dalam sampel,
pemisahan dan resolusi spesies Se yang tepat tidak dapat dicapai. Ekstrak perlu diencerkan dengan
fase gerak untuk mengurangi kandungan garam. Jaringan ikan dibubuhi SeMet sebelum ekstraksi
untuk mengkonfirmasi waktu retensi SeMet selama pemisahan HPLC. Menggunakan kromatografi
pertukaran kation, hanya satu puncak, yang dielusi pada 5 menit, diperoleh yang cocok dengan waktu
retensi SeMet. Puncak eluting dalam void area menggunakan anion exchange kromatografi tidak
terlihat. Tidak adanya puncak ini mungkin karena pengenceran ekstrak enzimatik sebelum
kromatografi. SeMet hanya memiliki satu gugus amino per molekul dan hadir sebagai kation
monopositif sehingga larutan pada pH 2,5. Asam amino bermuatan positif berinteraksi dengan situs
pertukaran kation dari resin dan dipertahankan oleh kolom pertukaran kation. Jika SeCys atau SeCyst2
telah hadir dalam sampel, mereka akan tertahan pada kolom. Karena konstanta disosiasi selenosistein
adalah pK1 = 2,4 dan pK2 = 8,9, pada pH 1, hampir semua gugus amino terprotonasi dan hadir
sebagai -NH3 +. Karena gugus karboksil juga terprotonasi (−COOH) dan tidak diisi, SeCys2 hadir
sebagai kation dipositif pada pH 1.

3.4. Pengukuran spesies selenium dalam CRMs dan jaringan ikan setelah derivatisasi dan
ekstraksi tipe XIV protease
 Kromatografi eksklusi ukuran digunakan untuk menghilangkan urea dan mendapatkan fraksi
asam selenoamino yang dielusi antara 28 dan 35 menit untuk standar Se yang diderivatisasi dan
ekstrak enzimatik DOLT-4. Kromatogram standar CAM-selenite, CAM-SeCys dan CAM-SeMet
menggunakan kromatografi fase balik C8 ditunjukkan pada Gambar. 5a. CAM-SeMet terdegradasi
dari waktu ke waktu ketika standar dan ekstrak disimpan dalam botol kaca coklat pada 25 ° C untuk
jangka waktu yang lama (N 3 - 7 hari) menghasilkan beberapa puncak untuk SeMet yang
diderivatisasi serta untuk SeMet yang diderivatisasi dalam ekstrak ikan, ini akan menjadi turunan
SeMet dan produk degradasi dari dekarboksilasi berturut-turut dan dekarbamidasi dari SeMet yang
diderivridisasi dan karenanya produk yang serupa diharapkan pada deritisasi SeMet dalam jaringan
ikan. Ini membuat analisis kuantitatif CAM-SeMet setelah derivatisasi menjadi sulit. Matogram chro
fase terbalik untuk spesies Se yang diderivatisasi dalam ekstrak selalu menunjukkan puncak eluting
pada waktu retensi yang cocok dengan standar CAM-selenite, namun, ini memungkinkan merupakan
puncak degradasi SeMet sebagai hidrolisis enzimatik tanpa derivatisasi mengungkapkan tidak ada
selenit yang cukup besar. Kuantifikasi turunan SeMet dan selenite dalam sampel, oleh karena itu,
tidak mungkin karena puncak yang tumpang tindih dan intensitas puncak variabel dari waktu ke
waktu. NRCC DOLT-4 juga dibubuhi CAM selenite, CAM SeMet dan CAM SeCys (100 μg l-1)
sebelum derivasi dan hidrolisis enzimatik. Pemulihan CAM-selenite, CAM-SeMet dan CAM-SeCys
masing-masing adalah 71%, 81% dan 84% menunjukkan bahwa beberapa Se hilang dalam proses
persiapan sampel selama pengeringan beku dan resuspensi. Karena CAM-SeMet tidak stabil dalam
ekstrak turunan, pemulihan absolut spesies Se dalam ekstrak tidak dapat dihitung dan hanya
konsentrasi SeCys yang dapat diukur. Konsentrasi rata-rata SeCys dalam CRMs dan jaringan ikan
adalah 0,50 ± 0,40 μg g-1 yang menunjukkan bahwa sejumlah kecil SeCys hadir dalam CRMs dan
jaringan ikan. Sekitar 33 ± 5% dari Se dalam CRMs dan 76 ± 18% dari Se dalam jaringan ikan
masing-masing dikaitkan dengan gabungan SeCys dan SeMet. Ini menunjukkan bahwa spesies Se
utama dalam jaringan ikan adalah SeMet dan spesies Se lainnya seperti selenium anorganik, ion
trimethyl selenonium (TMSe +) atau gula seleno, berada pada konsentrasi rendah. Beberapa Se hilang
dalam proses pengeringan beku karena kehilangan selama resuspensi ekstrak. Sampel perlu disaring
sebelum menyuntikkan pada kolom, yang dapat menyebabkan hilangnya beberapa Se pada filter.
Lonjakan standar CAM Se ke DOLT-4 dalam kerugian dinyatakan 17-30%. Jika kerugian ini
diperhitungkan, sebagian besar jaringan ikan Seinfi dicatat. Namun, dalam CRMs, lebih sedikit Se
yang diperhitungkan (sekitar 65%) karena bahan-bahan ini mungkin mengandung spesies Se organik
lainnya yang tidak dikuantifikasi

4. Kesimpulan

Dua metode pelengkap untuk pengukuran spesies Se dalam jaringan ikan laut dioptimalkan.
Hidrolisis enzimatik dengan protease XIV diikuti dengan pemisahan menggunakan kromatografi
pertukaran anion / kation dikembangkan untuk pengukuran konsentrasi SeMet. Dalam semua sampel
ikan, spesies Se utamanya adalah SeMet yang dapat diukur dengan metode ekstraksi dan pemisahan
satu langkah. Prosedur yang dikembangkan untuk mengukur konsentrasi SeCys melibatkan langkah
derivatisasi karboksimetilasi sebelum hidrolisis enzimatik untuk melindungi SeCys dan pemisahan
menggunakan pemisahan berdasarkan ukuran dan kromatografi fase terbalik. Selenium hilang dalam
proses pengeringan beku dan mungkin juga selama filtrasi ekstrak. Pemulihan rata-rata jarum yang
menunjukan SeCys adalah 84 ± 9%. Spesies Se lain seperti selenosugar juga dapat muncul dalam
konsentrasi kecil dalam sampel jaringan dan ini tidak dikuantifikasi menggunakan dua ekstraksi dan
metode pemisahan yang dikembangkan. Peningkatan dengan analisis spesies Se dalam jaringan
biologis dapat dicapai jika spesies Se ini juga dapat diukur bersama dengan asam selenoamino (SeMet
dan SeCys) yang ada dalam sampel jaringan ikan laut.