BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Paracoccidioidomycosis (PCM) adalah mikosis yang mendalam disebabkan oleh jamur
thermo-dimorphic Paracoccidioides brasiliensis, Penyakit ini endemik di beberapa negara
Amerika Latin, terutama di Brazil.
Pada penyakit ini, jamur dapat tetap terbatas di paru-paru, fokus utama dari infeksi, atau
menyebar ke organ lain dan jaringan, sehingga manifestasi klinis yang berbeda. Bentuk akut
dan sub akut terjadi pada orang muda dari kedua jenis kelamin, terutama mempengaruhi sistem
retikuloendotelial. Bentuk kronis dari PCM menonjol dalam laki-laki dewasa dan ditandai
dengan kehadiran jamur dibatasi di paru-paru dan / atau disebarluaskan pada mukosa, kulit dan
kelenjar getah bening.
Diagnosis konvensional PCM didasarkan pada melihat dan / atau isolasi jamur dalam
spesimen klinis. Namun, spesimen mungkin tidak selalu dilihat dan budaya mikrobiologis
adalah memakan waktu dan kebanyakan negative. Oleh karena itu, pendekatan molekuler
tampaknya menjadi alternatif yang sangat baik dalam diagnosis PCM. Namun, sejauh ini
teknik ini tidak digunakan secara rutin dalam diagnosis PCM.
DNA ribosom hadir di semua isolat dan ada daerah dilestarikan dalam struktur ini,
sehingga primer untuk daerah ini akan lebih tepat dalam hal sensitivitas dan spesifisitas.
Dengan demikian, kami bertujuan untuk mengembangkan PCR konvensional. untuk
menentukan apakah PCR ini dapat digunakan untuk mendeteksi DNA dari P. lutzii.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana penerapan PCR dalam serum penderita Paracoccidioidomycosis ?

1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui penerapan PCR dalam serum penderita Paracoccidioidomycosis
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik untuk mengamplifikasi suatu
segmen DNA secara in vitro. Pada tahun 1985 , Karry Mullis mengembangkan teknik ini
pertama kali ( Handoyo dan Rudiretna, 2001 ). PCR dapat mengamplifikasi untai DNA atau
DNA target pada daerah tertentu dan biasanya dapat mengkopi hingga 10 kb, bahkan pada
teknik PCR tertentu dapat mengkopi hingga 40 kb ( Cheng at all. 1994 ).
Menurut Handoyo dan Rudiretna ( 2001 ) komponen – komponen yang dibutuhkan dalam
PCR yaitu :
1. Template DNA
2. Primer
3. dNTPs ( deoxynucleotida Triphosphate )
4. Buffer PCR dan MgCl2
5. DNA Polymerase
Sedangkan tahapan amplifikasi PCR menurut kusuma ( 2010 ) ada tiga tahap, yaitu :
1. Denaturasi
Pada tahap ini terjadi pemisahan dari DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal.
Untai DNA tunggal inilah yang nantinya menjadi cetakan bagi DNA baru yang akan
dibuat.
2. Penempelan ( annealing )
Enzim Taq Polymerase akan Mukai membuat DNA baru apabila ada primer yang
menempel pada DNA target yang terlah terpisah.
3. Pemanjangan ( extention )
Inti dari tahap ini adalah ketika primer yang telah menempel pada DNA target,
maka DNA Polymerase akan memanjangkan dan membentuk DNA baru.
 BAB III
PEMBAHASAN

3.1 Bahan dan Metode

1. Isolat Paracoccidioides Lutzii
Menggunakan tiga isolat Paracoccidioides Lutzii
2. Ekstraksi DNA dari isolate
DNA dari isolate di ekstraksi dengan beberapa modifikasi.
a) 0,4 g jamur dimaserasi dengan nitrogen cair dan bubuk yang dihasilkan
dipindahkan ke 2 mL microtube.
b) Kemudian 1,7 ml buffer ekstraksi (100 mM EDTA, 100 mM Tris, 1,5 M NaCl,
1% SDS, 2% CTAB) ditambahkan dan campuran diinkubasi selama 20 menit
pada 65ᴼC (pembalik microtube setiap 5 menit)
c) sebelum sentrifugasi (20 menit pada 4500 6 g, Centrifuge MiniSpin, Eppendorf-
AG, Jerman). supernatan dikumpulkan dan dipindahkan ke microtube baru.
d) Volume yang sama dari fenol-kloroform-isoamil alkohol (25: 24: 1)
ditambahkan, dan setelah homogenisasi konten tabung disentrifugasi pada 4500
6 g selama 10 menit.
e) supernatan dikumpulkan dan 0,7 volume isopropanol (100%) dan 0,1 volume 3
M sodium asetat ditambahkan dan dicampur secara perlahan membalik
microtube 10 kali.
f) Setelah penyimpanan semalam di 20ᴼC sampel disentrifugasi selama 10 menit
pada 4500 RPM 6 g dan pellet yang dihasilkan dicuci dua kali dengan 70%
etanol.
g) pelet dikeringkan, diresuspensi dalam 200 m L MilliQ air dan dianalisis dengan
elektroforesis di 2% agarose gel di TBE penyangga (40 basis mM Tris, 20 mM
asam borat, 1 mM EDTA) pada 100 V selama 30 menit dan pewarnaan GelRed
3. Primer