REPLIKASI DNA PERCOBAAN MESELSON-STAHL, ROLLING CIRCLE

REPLICATION, DAN REVERSE TRANSCRIPTION

RQA
Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Genetika 1
yang diampu oleh Prof. Dr. Siti Zubaidah, M.Pd. dan Deny Setiawan, M.Pd.

Disusun Oleh:
Kelompok 5 Offering G 2018
Awil Endar Pramesti 180342618095
Muhammad Noorjazuli Abdillah 180342618087

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Februari 2020
REPLIKASI DNA PERCOBAAN MESELSON-STAHL
Replikasi DNA Semikonservatif
Ketika Watson dan Crick mengusulkan mengenai DNA yang menyatakan
bahwa DNA memiliki struktur double heliks dua rantai yang komplemen pada
double heliks membuka dan terpisah, dan tiap-tiap untainya membentuk untai
baru. Urutan basa tiap untai DNA induk digunakan sebagai template dan basa
akan berpasangan dengan komplemennya sehingga membentuk untai baru.
Sebagai contohnya Adenin yang terdapat pada untai DNA induk yang akan
bertindak sebagai template yang akan dihubungkan oleh ikatan hidrogen agar
dapat berpasangan dengan Timin yang terdapat pada untai DNA yang baru
terbentuk. Mekanisme ini disebut dengan replikasi semikonservatif (karena
setengah molekul “induk/ parent” masih tetap terjaga).

Terdapat beberapa kemungkinan mekanisme replikasi DNA, ada 3

hipotesis berbeda:
1. Semikonservatif
2. Konservatif, heliks ganda yang baru terbentuk dari dua untai heliks tunggal
yang sama-sama baru.
3. Dispersif, potongan DNA yang melakukan replikasi. Potongan-potongan itu
terpecah menjadi dua dan tiap kelompok potongan melengkapi dirinya dengan
segmn-segmen baru sehingga diperoleh susunan berseling antara segmen DNA
lama dan baru.
Percobaan Meselson-Stahl
Tahun 1958, Matthew Meselson dan Franklin Stahl mendemonstrasikan
sebuah replikasi semikonservatif pada kromosom Eschericia Coli. Kemudian
pada 1962, John Cairns mendemonstasikan bahwa kromosom dari E. coli
memiliki DNA dengan untai ganda. Hasil presentasi dari Cairns, Meselson, dan
Stahl bersama-sama mereka ingin membuktikan bahwa sebenarnya DNA
bereplikasi secara semikonservatif pada E.coli.
Meselson dan Stahl menumbuhkan sel bakteri E.coli di dalam medium
isotope berat nitrogen (15N) yang telah disubstitusi menjadi normal, yaitu isotop
ringan (14N) sebagai penanda pada masing-masing medium. Basa purin dan
pirimidin pada DNA mengandung nitrogen. Kemudian DNA sel bakteri tumbuh
pada medium yang mengandung isotop (15N) dan memiliki kepadatan yang lebih
tinggi (massa/unit volume) dari pada DNA sel bakteri yang tumbuh pada medium
yang mengandung isotop (14N). Molekul DNA dengan kepadatan yang berbeda
dapat dipisahkan oleh equilibrium density-gradient centrifugation. Dengan
menggunakan teknik inilah, Meselson dan Stahl mampu membedakan diantara
ketiga model replikasi DNA melalui bentuk perubahan kepadatan pada DNA sel
bakteri yang ditumbuhkan pada medium (15N) dan medium (14N) yang disebut
dengan eksperimen perpindahan kepadatan.
Meselson dan Stahl mengambil sel-sel yang telah tumbuh pada medium
yang mengandung (15N) selama beberapa generasi (sehingga terkandung "berat"
DNA), kemudian sel-sel tersebut dicuci untuk menghapus medium yang
mengandung (15N), dan dipindahkan pada medium yang mengandung (14N).
Selanjutnya sel dibiarkan tumbuh pada medium (14N) pada periode waktu,
kemudian DNA diekstraksi dan dianalisis dalam CsCl untuk mencapai
keseimbangan gradien kepadatan. Hasil penelitian Meselson dan Stahl konsisten
menunjukkan bahwa replikasi hanya dengan replikasi semikonservatif. Semua
DNA yang diisolasi dari sel setelah satu generasi pertumbuhan pada medium yang
mengandung (14N) memiliki setengah kerapatan antara atau kerapatan antara.
Kepadatan menengah ini biasanya disebut sebagai kepadatan "hybrid". Setelah
pertumbuhan dua generasi pada medium yang mengandung (14N), setengah dari
DNA merupakan kerapatan hybrid.
Salah satu dari generasi hasil replikasi semikonservatif dari helix ganda
15 14
induk yang mengandung N pada medium yang mengandung N hanya akan
15
menghasilkan dua keturunan heliks ganda, yang keduanya memiliki N dalam
satu untai (strand yang lama) dan 14N di untai lainnya (strand yang baru).
Molekul tersebut akan menjadi kepadatan hybrid.
Replikasi konservatif tidak menghasilkan molekul DNA dengan kepadatan
hybrid, karena setelah dihasilkan satu generasi DNA hasil dari replikasi
konservatif berat DNA dalam medium menjadi ringan, sehingga setengah dari
DNA masih akan memiliki berat yang lebih apabila dibandingkan dengan
setengah lainnya yang akan menjadi lebih ringan. Jika replikasi dispersif,
Meselson dan Stahl mengamati perubahan berat DNA terhadap cahaya dalam
setiap generasi (yaitu dengan mengamati setengah berat atau hybrid setelah satu
generasi, kuartal berat setelah dua generasi, dan sebagainya). Hasil dari percobaan
Meselson dan Stahl memiliki kemungkinan-kemungkinan yang tidak konsisten.
Replikasi DNA selanjutnya terbukti terjadi secara semikonservatif di beberapa
mikroorganisme.

Autoradiography Replikasi
Visualisasi dari replikasi kromosom pertama kali ditemukan oleh J.Cairns pada
1963. Menggunakan teknik autoradiography. Autoradiography adalah metode
untuk mendeteksi dan memidahkan isotope radioaktif pada tempat cytoplasma
atau makromolekul dengan eksposure photografi yang sensitive terhadap energy
rendah. Cairns menumbuhkan E.coli sel pada medium yang mengandung
pirimidin dengan hati hati mengumpulkan kromosom pada membrane penyaring.
Penyaring ini diselubungi dengan emulsi sensitive pada beta partikel.
ROLLING CIRCLE REPLICATION
Bakteriofage ΦX174 adalah wakil dari sekelompok virus kecil (baik
bacterial maupun eukariotik) yang menyimpan informasi genetik dalam molekul
DNA yang bundar (circular) ber-strand tunggal. Di saat virus ini menginfeksi sel
induk E. coli pada ΦX174, DNA viral berstrand tunggal (+) akan menjadi bentuk
double helix (RF) melalui sintesa strand (-) tambahan. RF ini kemudian akan
bereplikasi sampai beberapa kali untuk menghasilkan populasi yang terdiri oleh
molekul RF progeny (strand double) dan pada waktunya akanbereplikasi asimetris
dan menghasilkan strand yang (+) progeny dengan kuantitas banyak. Strand ini
akan bergabung dengan mantel protein untuk mengakhiri suatu siklus reproduksi.
Replikasi dari kromosom ΦX174 lalu dibagi menjadi tiga yaitu (1) parental strand
(+) menjadi parental RF, (2) parental RF menjadi progeny RFs dan CS menjadi
progeny strand (+). Dua tahapan terakhir, akan terjadi sintesis DNA dengan
mekanisme yang berbeda yang disebut rolling circle.
Replikasi rolling circel dimulai ketika endonuklease memiliki rangkaian
khusus pada fage ΦX174. Sebuah protein memotong untaian positif parietal RF
pada asal replikasi .Aktivitas endonuklease ini terjadi di lokasi tertentu (site
specific) memotong kromosom oX174 hanya pada satu tempat yaitu asal replikasi.
Proses ini menghasilkan 3'-OH dan 5'-fosfat termini di situs potongan untai (+);
untai (-) tetap utuh. Ujung 5 'dari untai (+) tidak dilepas dan "dikupas" sedangkan
untai (-) berputar pada sumbunya (dengan demikian nama "rolling circel"). Ini
menyebabkan strand memiliki ekor. Seperti yang awalnya disebutkan oleh W.
Gilbert dan D. Dressler, model rolling circel dari replikasi DNA membutuhkan
enzim spesifik, yang disebut "transferase," yang mengikat ujung tepian straind (+)
dengan lokasi tertentu pada membran selnya. Meskipun sebagian besar,
kromosom yang bereplikasi terikat ke membran, hanya sedikit info yang diketahui
mengenai sifat alami dari ikatan semacam ini. Banyak kasus yang menganggap
ikatan membran semacam ini bukanlah perangkat esensial dari replikasi rolling
circle, karena pada saat lingkaran berputar dan ujung tepi 5’ berpindah,
polymerase DNA meng-katalisasi ekstensi kovalen pada ujung tepi (3’-OH) yang
lainnya.
Selama RF orangtua untuk replikasi progeni, untai positif yang baru
digunakan sebagai template untuk sintesis berulang tanpa putus (diskontinyu) dari
untai negatif komplementer. Dalam beberapa kasus, sintesis untaian
komplementer dapat terjadi secara tidak terputus pada ekor beruntai tunggal
sebelum sintesis untai pertama telah selesai. Dalam kasus seperti itu, Pergantian
proses sintesis DNA RF dengan strand dobel menjadi sintesis DNA viral (+)
dengan strand tunggal terjadi saat ada protein tertentu di dalam mantel protein
sedang diproduksi didalam sel. Replikasi rolling circle terus berlangsung, namun
pada saat strand viral berganti tempat, mantel protein akan mengikatnya dan
mencegah terjadinya sintesis pada strand (-) tambahannya.
Fage ΦX174 dari gen protein A adalah protein kunci dalam proses
replikasi ΦX174. ia memiliki banyak perangkat aktivitas. (1) gen protein A
mempunyai aktivitas endonuklease pada lokasi khusus (site specific) yang bisa
memecah strand (+) pada daerah asalnya (origin). (2) gen protein A kemudian
mampu mempertahankan energi dari pecahan ikatan fosfodiester dalam bentuk
ikatan kovalen pada terminus 5’ fosforil itu sendiri. (3) gen protein A terus
mengikat ujung terminus 5’ pada strand (+)-nya dan juga pada ‘garpu replikasi’
yang melintasi perputaran template dari strand (-). (4) ketika strand (+) mulai
disintesiskan, gen protein A memecah dan membentuk asal (origin) baru, ligasi
termini 3’ hidroxil dan 5’ fosforil, dan sekali lagi akan terikat secara kovalen
kepada 5’ terminus strand positif yang baru dihasilkan. Daur aktivitas gen protein
A ini akan terus berulang sampai sebuah populasi progeny RFs (tahap II) atau
progeny strand (+) (tahap III) akan diproduksi.

Struktur Nukleoid Prokaryot

Umumnya kromosom eukariotik adalah kromosom meiosis atau mitosis yang
sangat padat, keadaan kromosom yang tidak aktif secara metabolik. Diketahui
bahwa kromosom kaktus fungsional berfungsi sebagai "nukleoid" memiliki
sedikit kemiripan dengan struktur yang terlihat dalam autoradiograf Cairns seperti
halnya metabolis aktif. kromosom interphase dari eukariota memiliki sedikit
kemiripan morfologis dengan kromosom metafase mitosis atau meiotik. Panjang
kontur molekul DNA melingkar dari E. coli adalah sekitar 1100 μm. Sel bakteri
E.coli memiliki diameter hanya 1-2 μm. Ketika kromosom E. coli diisolasi dengan
prosedur tanpa adanya deterjen ionik (biasanya digunakan untuk melisiskan sel)
dan disimpan pada keadaan kation yang berkonsentrasi tinggi seperti poliamina
(protein yang bermuatan positif) atau 1 M garam untuk menetralkan gugus fosfat
bermuatan negatif dari DNA, kromosom tetap dalam keadaan sangat
terkondensasi sebanding dengan ukuran nukleoid di tivo. Struktur ini, disebut
"genom terlipat" tampaknya merupakan fungsi fungsional dari kromosom E. coli.
Dalam keadaan genom terlipat, molekul DNA tunggal bakteri E coli disusun
menjadi sekitar 50 domain, yang berkelok kelok atau disebut "supercoiled" (mirip
seperti kabel telepon yang dililit erat). Struktur ini terdiri dari RNA dan protein,
yang keduanya merupakan komponen genom terlipat. Genom yang terlipat dapat
direnggangkan melalui proses deoksiribonuklease (DNase) atau ribonuklease
(RNase). Supercoiling DNA adalah fitur penting dari semua kromosom, mulai
dari virus terkecil hingga yang dimiliki eukariota.
REVERSE TRANSCRIPTION
Reverse transcription adalah proses pembentukan rantai ganda molekul
DNA dengan template berupa rantai tunggal RNA. Disebut dengan transkripsi
balik karena pada prosesnya berlawanan dengan proses transkripsi dan transkripsi
balik ini dilakukan oleh retrovirus. Retrovirus merupakan virus yang memiliki
materi genetik berupa RNA dan dapat mereplikasi DNA dan prosesnya disebut
transkripsi balik. Virus ini dapat melakukan transkripsi balik dengan bantuan
enzim reverse transcriptase. Contoh retrovirus adalah Human Immunodeficiency
Virus (HIV) dan Human T-Lymphotropic virus (HTLV).
Bagian dari RNA (Primer Binding Site (PBS)), bagian ini terletak dekat
ujung 5` RNA virus akan bersilangan dengan tRNA sel inang yang spesifik.
Setelah itu tRNA ini akan menjadi ujung 3` dari untai DNA yang sesuai dengan
kode pada RNA virus. Kemudian ujung bagian luar PBS akan terlepas dari untai
RNA virus dengan bantuan enzim Rnase H.
Selanjutnya DNA akan berpindah dari ujung 5` ke segmen R pada ujung 3`
RNA virus. dari ujung ini, DNA akan mengalami polimerisasi dan mengikuti
kode pada RNA virus. Sebagian dari RNA telah terlepas akibat RNase H. Di sisa
untai RNA virus yang masih ada ,dibentuk untai DNA kedua sesuai dengan kode
pada DNA yang pertama. Terjadi perpindahan kembali, bagian PBS pada DNA
pertama bertemu dengan PBS DNA untai kedua. Kemudian dari masing-masing
untai DNA melakukan polimerisasi sehingga terbentuklah DNA untai ganda
(dobel helix).
Contoh salah satu retrovirus yang kita kenal pada manusia yaitu penyakit
AIDS yang sisebabkan oleh Human Immunodeficiency Virus (HIV). AIDS
merupakan penyakit yang secara bertahap merusak kekebalan tubuh manusia yang
mana pada tahap perkembangannya seseorang akan kehilangan kemampuan untuk
melawan infeksi pathogen sehingga jika dibiarkan tanpa pengobatan penderita ini
akan mati. AIDS ditularkan dari satu orang ke orang lain melalui cairan tubuh
seperti darah atau air mani yang telah terkontaminasi dengan HIV. Gejala-gejala
awal penyakit ini seperti terserang flu sehingga individu yang terinfeksi HIV akan
mengalami nyeri, demam dan kelelahan, setelah beberapa minggu gejala-gejala ini
mereda dan kesehatan tampaknya pulih, namun gejala-gejala ini dapat
berlangsung selama beberapa tahun, virus terus berkembangbiak dan akan
menyebar keseluruh tubuh, menargetkan sel-sel khusus yang mempunyai peranan
menjaga homeostatis tubuh.
QUESTION AND ANSWER

Awil Endar Pramesti

1. Question:
Jelaskan mengapa replikasi DNA penting untuk keberlangsungan hidup suatu
jenis organisme.
Answer:
karena seperti yang telah diketahui DNA merupakan tempat dari informasi
genetik, informasi genetik ini dapat membentuk individu baru yang sifat-sifat
yang dibawa tersebut dapat diturunkan atau diwariskan, untuk menjaga
keberlangsungan hidup suatu jenis organisme dalam menghindari kepunahan,
dengan melakukan reproduksi untuk memperbanyak keturunan. Oleh karena
itu, replikasi DNA penting untuk keberlangsungan hidup suatu jenis
organisme.

2. Question:
Mengapa rolling circle replication hanya dapat terjadi pada replikasi DNA
yang berbentuk sirkuler?
Answer:
Rolling circle replication merupakan mekanisme replikasi DNA yang umum
terjadi pada DNA dengan bentuk sirkuler. Hal ini dapat terjadi karena pada
DNA sirkuler saja yang dapat membentuk pemanjangan DNA agar
templatenya tetap utuh dan memutar. Mekanisme rolling circle replication
dapat ditemukan pada replikasi genom virus, transfer DNA bakteri, dan
amplifikasi gen-gen pengkode RNA ribosomal selama oogenesis amfibi.
Muhammad Noorjazuli A.
1. Question:
Mengapa pada perobaan digunakan medium yang harus memiliki isotop 15N ?
Answer:
Karena dengan basa nitrogen 15N, molekul DNA memiliki tingkat kerapatan
yang lebh tinggi dibanding dengan molekul DNA normal yaitu 14N. Molekul
dengan kerapatan yang berbeda bisa urai atau dipisahkan dengan proses
disentrifuge.

2. Question:
Apa yang dimaksud dengan supercoiled ?
Answer:
Merupakan molekul DNA tunggal bakteri E coli disusun menjadi sekitar 50
domain, yang berkelok kelok (mirip seperti kabel telepon yang dililit erat).
Struktur ini terdiri dari RNA dan protein, yang keduanya merupakan
komponen genom terlipat