Target pengiriman phycocyanin untuk pencegahan

kanker usus besar menggunakan electrospun

Nama: Nurzamza

Stambuk : G70115 236

Pengantar

Studi ekstensif telah menunjukkan bahwa banyak senyawa bioaktif, terisolir atau dimurnikan
dari makanan atau makanan suplemen, memilki mempromosikan kesehatan. Dalam hal ini
phycocyanin (PC). Suatu senyawa nutriceutical berasal dari rumput laut, pameran kuat anti-
inflamasi, anti-oksidan , dan kegiatan radikal. Banyak penelitian telah mendokumentasikan
bahwa PC selektifnmemberikan sebuah terapi e ff dll pada sel kanker, sementara itu memiliki
sedikit atau tidak ada beracun sisi e ff dll pada sel normal. Secara khusus, penting
pemnghambatan e ff dll dari PC pada kanker usus besar, ancaman kesehatan umum diseluruh
dunia, telah terbukti. Thangam et al, menemukan bahwa PC secara signifikan dapat
menghambat pertumbuhan sel HT29.

Materi dan metode

PC dengan rasio kemurnian ( SEBUAH 620 / SEBUAH 280) 1,79 dibeli dari Taizhou
Binmei Bioteknologi Co, Ltd (Taizhou, Cina); CS (160 kDa, DD adalah 87%) dibeli dari
Dacheng Biotech. Co Ltd (Weifang, Cina). β- Glukosidase, SA (viskositas 15 - 25 cps) dan
tripolifosfat (TPP) diperoleh dari Sigma-Aldrich (Shanghai, Cina). 1,1-Diphenyl-2-
pikrilhidrazil (DPPH) diberikan oleh Shanghai Yuanye Bio-Technology Co Ltd (Shanghai,
Cina). Polioksietilen (PEO), tripsin dan pepsin berasal dari Aladdin Biologi Technology
Co, Ltd (Shanghai, Cina). Serum janin sapi (FBS), penisilin / streptomisin, dan Dulbecco ' s
dimodifikasi Elang ' s menengah (DMEM) yang dibeli dari Gibco Life Technologies,
Paisley, UK. Propidium iodida (PI), FluoroPure kelas dihidroklorida (DAPI), alat tes kit
protein BCA dan annexin. Sel-sel HCT116 yang dikultur dalam DMEM dilengkapi dengan
10% FBS, penisilin (50 IU mL - 1) dan streptomisin (50 IU mL - 1). Sel-sel disimpan pada
suhu 37 ° C dalam 5% CO 2 inkubator, dan menengah itu berubah setiap dua hari.
Biokompatibilitas PC-loaded matriks EFM diperoleh dievaluasi dengan mengamati
perilaku manusia usus CCC-HIE-2 sel normal berbudaya pada serat tikar silang seperti yang
dijelaskan sebelumnya. 25 Kepadatan optik (OD) diukur menggunakan pembaca lempeng
dan sel-sel yang layak di EFM itu juga. e ff dll dari EFM PC-loaded pada sel kanker
HCT116 usus diukur oleh CCK-8 assay. Pertama, di ff jumlah erent dari PC-loaded EFM
direndam dalam cairan pencernaan (simulasi cairan lambung (SGF) selama 2 jam, cairan
usus simulasi (SIF) selama 4 jam, dan simulasi cairan usus (SCF) untuk 14 h) untuk
mendapatkan dirilis PC. 100 μ L suspensi sel ditempatkan ke dalam piring. 96-baik (10 4 sel
per juga), setelah inkubasi selama 24 jam, mereka diperlakukan dengan di ff konsentrasi
erent dari PC dirilis. Sel diinkubasi tanpa merilis PC dipertahankan sebagai kontrol. Setelah
inkubasi selama di ff kali erent, kelangsungan hidup sel ditentukan oleh CCK-8 tes sesuai
dengan produsen ' s petunjuk. IC 50 ( konsentrasi hambat diperlukan untuk pengurangan
50% dari jumlah sel) nilai diperoleh. Setelah pengobatan dengan PC dirilis untuk
ditunjukkan waktu, sel-sel dipanen, diwarnai dengan PI selama 10 menit dalam gelap, dan
divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi. Sel HCT116 dikultur selama 48 jam
pada suhu 37 ° C di piring 6-baik di hadapan di ff konsentrasi erent media rilis PC. Setelah
mencuci dengan PBS, sel-sel segaris dan konsentrasi protein ditentukan dengan
menggunakan alat tes Bradford. Protein (30 μ g per lane) dipisahkan dengan menggunakan
natrium dodesil sulfat-poliakrilamida gel (SDS-PAGE), dan kemudian. elektro-ditransfer ke
membran PVDF. Setelah itu, membran diblokir di TBS sebuah - Tween 20 (0,1%, v / v)
larutan yang mengandung 5% (b / v) susu non fat selama 2 jam, diikuti dengan inkubasi
semalam dengan antibodi primer pada suhu 4 ° C selama 14 jam. Setelah dicuci dengan
TBS-Tween 20 bu ff er, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder (horseradish
peroksidase) selama 1 jam, dilanjutkan dengan deteksi menggunakan reagen
chemiluminescence ditingkatkan. Densitas optik band dianalisis menggunakan perangkat
lunak Image

Hasil dan Diskusi

Pada awalnya, PCNPs disiapkan dan gambar TEM mereka mengungkapkan bahwa PCNP
tunggal memiliki struktur bola dan ukuran partikel rata-rata adalah 53,2 nm (Gbr. 1a). Studi
telah menegaskan bahwa PC memiliki aktivitas antioksidan. 26,27 Dalam penelitian ini, DPPH
metode radikal-pemulungan digunakan untuk menentukan aktivitas antioksidan dari PC
dikemas. DPPH adalah stabil nitrogen berbasis radikal bebas dan warna dapat berubah dari ungu
menjadi kuning ketika bereaksi dengan senyawa proton-menyumbangkan. Gambar. 1b jelas
menunjukkan bahwa PCNP bisa mengais DPPH radikal dalam cara yang tergantung dosis, dan
DC50 dari PCNP dicapai pada konsentrasi 452 mg ml Dengan demikian, kami menyimpulkan
bahwa PC telah e ff ectively dikemas ke dalam NP. Stabilitas PCNP itu selanjutnya dinilai
dengan mengukur ukuran partikel, ζ- potensial dan EE bawah di ff kondisi penyimpanan
erent (4 ° C dan 25 ° C). Setelah 1 bulan penyimpanan, ukuran partikel rata-rata PCNP
berkisar dari 260,6 nm ke 274,7 nm dan dari 258,3 nm ke 290,8 nm bila disimpan pada suhu
4 ° C dan 25 ° C, masing-masing. Demikian pula, ζ- potensial bervariasi dari 31,6 mV untuk
30,3 mV dan 31,4 mV untuk 28,1 mV selama 4 ° C dan 25 ° C, masing-masing. Tidak ada
perubahan jelas dalam ukuran partikel atau biaya (Tabel 1). Sebaliknya, EE dari PCNP menurun
sekitar 4,3% dan 10,5% setelah penyimpanan 1 bulan pada suhu 4 ° C dan 25 ° C, masing-
masing. Penurunan ini mungkin disebabkan oleh oksidasi molekul PC. Oleh karena itu, dapat
disimpulkan bahwa penyimpanan pada suhu 4 ° C menguntungkan untuk mempertahankan
PCNP ' stabilitas. Kemudian, EFM inti-selubung PC-loaded itu dibuat menggunakan PCNP dan
PVA sebagai lapisan inti dan SA dan PEO sebagai lapisan shell. Selama electrospinning,
beberapa parameter proses yang dikenal untuk mempengaruhi morfologi EFM. 30,31 Seperti
ditunjukkan dalam Gambar. 2, peningkatan jarak electrospinning dari 13 cm sampai 15 cm
dapat mengurangi manik-manik-serat dan membentuk serat tipis. Demikian pula, tegangan
rendah adalah menguntungkan untuk memproduksi serat morfologi seragam (<20 kV). Harga
pakan yang lebih tinggi ( ≥ 0,45 mL h - 1) dapat menghasilkan serat dengan distribusi yang luas
dari diameter. Namun, pendekatan konvensional memeriksa eksperimen faktor tunggal tidak
memperhitungkan gabungan e ff Ects dari beberapa parameter electrospinning. Berdasarkan
hasil tes awal kami (Gbr. 2), RSM dipekerjakan untuk menyelidiki interaksi antara di ff serat
parameter erent dan mengoptimalkan beberapa faktor untuk mendapatkan seragam, manik-
manik bebas (Tabel S2 †). Diameter serat rata-rata terpilih sebagai respon, dan plot permukaan
3D dan kontur model digambarkan dalam Gambar. 3. Pada meningkatkan tegangan diterapkan,
diameter serat adalah ff ected di di ff cara erent tergantung pada electrospinning jarak yang
dipilih. Hal ini karena jarak electrospinning memiliki e signifikan ff dll pada waktu penerbangan
jet dan kekuatan medan listrik. Pada tegangan rendah, waktu penerbangan adalah faktor
dominan. jarak berputar lagi mengarah ke lebih banyak waktu untuk jet peregangan, sehingga
menghasilkan serat tipis. The EFM PC-loaded ditempatkan dalam cairan pencernaan
simulasi untuk menyelidiki profil rilis PC. The EFM PC-loaded dengan diameter rata-rata
390 nm menunjukkan bahwa hanya sejumlah kecil PC (sekitar 3%) dirilis pada simulasi
cairan lambung (SGF) karena perlawanan dari SA untuk lingkungan asam (Gambar. 4).
Dalam cairan usus simulasi (SIF) selama 4 jam, sekitar 14% PC dirilis dan komponen inti
dari CS menghambat pembengkakan lebih lanjut dari EFM yang bisa mempromosikan rilis
lebih PC. Setelah direndam dalam cairan kolon simulasi (SCF) selama 14 jam, EFM
menunjukkan bahwa sekitar 74% PC dirilis karena degradasi pembawa CS melalui aksi β-
glukosidase.
Dengan demikian, perilaku rilis usus-spesifik PC dari EFM yang ditunjukkan. Selain itu, telah
dilaporkan bahwa serat electrospun lebih menguntungkan untuk pelepasan senyawa dikemas
dari cor film. 32,33 Dalam penelitian ini, jumlah dirilis PC meningkat dengan penurunan
diameter serat. Secara khusus, untuk SCF, sekitar 5,5% h - 1 dan 5,1% h - 1 PC dibebaskan dari
serat diameter 410 nm dan 740 nm, masing-masing. Kami percaya bahwa ini adalah terkait
dengan luas permukaan spesifik serat; tipis diameter serat, semakin besar luas permukaan serat.
Oleh karena itu, rilis lebih cepat dari PC dicapai dengan menggunakan EFM memiliki diameter
serat kecil. Perilaku rilis ini mirip dengan yang dilaporkan oleh Wang et al. Kami selanjutnya
mengevaluasi ekspresi protein apoptosis terkait untuk memperjelas mekanisme yang mendasari
apoptosis yang disebabkan oleh PC dalam sel HCT116 diobati. β- Aktin digunakan sebagai
kontrol untuk memastikan pemuatan sama protein dalam semua sampel. Ada dua jalur
apoptosis utama sebagai mekanisme apoptosis: satu adalah mitokondria / sitokrom C (endogen)
jalur, yang diatur oleh berbagai anggota Bcl-2 keluarga; yang lain adalah membran sel mati
permukaan reseptor (eksogen) jalur. 4 Biasanya, di ff protein erent dari Bcl-2 keluarga yang
berhubungan dengan mengendalikan mitokondria permeabilitas dan sitokrom c ekspresi telah
terlibat dalam memicu atau mencegah apoptosis. Di antaranya, Bcl-2 adalah 28 kDa protein anti-
apoptosis, yang menghambat produksi ROS, sitokrom c rilis, dan caspase-3 aktivasi, dan Bax
adalah kDa protein 23 yang berfungsi sebagai agonis apoptosis, memfasilitasi sitokrom C rilis,
dan memicu kematian sel apoptosis caspase-dimediasi. Oleh karena itu, rasio Bcl-2 / Bax
mewakili tingkat apoptosis. Para peneliti telah menemukan bahwa PC mampu mengaktifkan
mitokondria / sitokrom C (endogen) jalur, mengubah Bcl-2 / Bax

Kesimpulan
e ff usus efektif sistem penargetan untuk rilis terkendali PC dikembangkan oleh co-axial
electrospinning. Inti-selubung terstruktur EFM mengandung PC dipamerkan seragam dan
beadfree morfologi dengan mengoptimalkan parameter electrospinning menggunakan RSM.
Berkat pelindung e ff dll serat electrospun, aktivitas antioksidan dari PC dirilis setelah in vitro
pencernaan juga diamati, serta sifat rilis usus spesifik. PC-loaded EFM terhambat proliferasi sel
HCT116 melalui penangkapan siklus sel di G 0 / G 1 fase dan induksi apoptosis. Mekanisme
apoptosis yang paling mungkin terlibat adalah salah satu yang dimediasi oleh jalur
mitokondria, yang relevan untuk merangsang aktivitas caspase-3, menurunkan tingkat Bcl-2 /
Bax dan pelepasan sitokrom c. sistem pengiriman ini dapat berpotensi dimanfaatkan sebagai
calon yang baik untuk pengiriman target dan berkelanjutan bioprotein / peptida ke usus besar
untuk pencegahan kanker usus besar. Namun, mekanisme rinci masih belum sepenuhnya
diklarifikasi dalam studi saat ini, dan penyelidikan lebih lanjut dari PC-loaded EFM dalam
model tikus yang diperlukan untuk mengeksplorasi kegiatan ke arah sel-sel kanker in vivo.