Laporan Praktikum Biokimia KI3261

Percobaan 1

Penyiapan Larutan Buffer, Media, dan Larutan Pendukung Eksperimen

Nama : Carolus Ivander

NIM : 10517052

Kelompok :5

Tanggal Percobaan : 6 Februari 2020

Tanggal Pengumpulan : 13 Februari 2020

Asisten : Zuhdina (10516025)

LABORATORIUM BIOKIMIA

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2020
 Bab I Pendahuluan
Latar Belakang
Sterilisasi adalah proses pemanasan terkontrol yang bertujuan mematikan semua
mikroorganisme yang meliputi bakteri, jamur, virus, dan spora bakteri dari suatu peralatan,
permukaan, dan media kultur (Silindir and Özer, 2009). Sterilisasi mampu menggunakan panas dan
tidak, penggunaannya sesuai dengan kebutuhan. Mikrobiologi umumnya membedakan sterilisasi
menjadi 2 jenis yakni sterilisasi basah dan kering. Sterilisasi basah menggunakan uap panas, sedangkan
sterilisasi kering menggunakan udara kering panas untuk mematikan mikroorganisme. Pada
laboratorium biokimia, sterilisasi bahan dan alat bertujuan menghilangkan kontaminasi yang dapat
menganggu hasil uji atau analisis. Bahan dan alat yang umum digunakan adalah larutan buffer posfat,
buffer TAE, cawan petri, media pertumbuhan, larutan glukosa, dan cairan antiseptik (etanol 70%).
Dikarenakan semua bahan tersebut dapat dibuat secara langsung, maka percobaan ini bertujuan
memberi wawasan kepada praktikan tentang proses persiapan bahan dan teknik sterilisasi yang akan
digunakan.

Tujuan Percobaan
1. Membuat larutan media, buffer posfat, dan glukosa
2. Melakukan sterilisasi larutan dan alat

Bab II Metodologi
Alat dan Bahan
Alat yang dipakai pada percobaan ini adalah autoklaf, cawan petri, peralatan gelas standar,
membrane filter, tabung reaksi, pH meter, spatula, neraca, dan magnetik stirrer. Bahan yang dipakai
adalah garam posfat, glukosa, akuades, nutrient broth dan nutrient agar, larutan TAE 10x, dan etanol
96%.

Cara Kerja
Pada percobaan ini dilakukan 7 tahap, yang pertama pembuatan 100 ml etanol 70%.
Pembuatan etanol 70% dilakukan dengan cara 73 ml etanol 96% dicampurkan dengan 27 ml air. Tahap
kedua adalah pembuatan buffer posfat pH 7,0 dengan konsentrasi 50 mM. Pertama-tama dibuat
terlebih dahulu 100 mL larutan induk KH2PO4 0,1 M dan K2HPO4 0,1 M. Kemudian dicampurkan 47,85
mL K2HPO4 0,1 M dan 77,15 mL KH2PO4 0,1 M. Kemudian diencerkan dengan akuades sampai 200 mL.
Setelah itu dicek pH larutan tersebut dengan pHmeter dan diatur pHnya sampai dengan 7 dengan
penambahan basa dan asam konjugat. Setelah tercapai pH 7, larutan tersebut diencerkan dengan
akuades hingga 250 mL. Larutan buffer dimasukkan ke dalam botol Duran dan dimasukkan ke dalam
autoklaf untuk disterilisasi. Tahap ketiga adalah melakukan sterilisasi cawan petri, cawan petri dicuci
dan dikeringkan. Kemudian dibungkus koran dan dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilisasi.
Tahap keempat adalah pembuatan larutan glukosa 1 mg/ml, larutan ini dibuat dengan cara
mencampurkan 50 mg glukosa dengan 50 ml akuades. Larutan ini perlu disaring dengan membran
mikro supaya steril. Tahap kelima adalah pembuatan media nutrient broth, media ini dibuat dengan
cara 0,09 g ekstrak sapi, 0,15 g NaCl, dan 0,15 g pepton dilarutkan dalam 30 ml akuades. Media ini
disimpan dalam tiap tabung reaksi yang disumbat kasa dan aluminium foil, kemudian disterilisasi
dalam autoklaf. Tahap keenam adalah pembuatan media nutrient agar, media ini dibuat dengan cara
0,3 g ekstrask sapi, 0,5 g NaCl, 0,5 g pepton, dan 2 g agar dilarutkan dalam 100 ml akudes. Media ini
disimpan dalam Erlenmeyer 250 mL dan disumbat dengan kasa dan aluminium foil, kemudian
disterilisasi dalam autoklaf. Tahap ketujuh adalah pembuatan buffer TAE, buffer TAE dibuat dengan
cara mencampurkan 2,42 basa tris, 0,372 g EDTA, dan 0,57 mL asam asetat dalam 50 mL akuades.
Kemudian larutan TAE disimpan di dalam tabung Falcon.

Bab III Hasil

Data Pengamatan
 Pembuatan 250 ml buffer posfat 50 mM pH 7,0
o Pembuatan KH2PO4 0,1 M
𝑚 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 𝑉 × 𝑀 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 × 𝑀𝑟 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4
𝑚𝑜𝑙 𝑔
= 0,1 𝐿 × 0,1 × 136 = 1,36 𝑔
𝐿 𝑚𝑜𝑙
𝑚 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 1,4576 𝑔
o Pembuatan K2HPO4 0,1 M
𝑚 𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 𝑉 × 𝑀 𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 × 𝑀𝑟 𝐾2 𝐻𝑃𝑂4
𝑚𝑜𝑙 𝑔
= 0,1 𝐿 × 0,1 × 174 = 1,74 𝑔
𝐿 𝑚𝑜𝑙
𝑚 𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 1,7563 𝑔
o Pembuatan buffer posfat 250 ml 50 mM pH 7,0
[𝐻 + ][𝐻𝑃𝑂42− ]
 𝐾𝑎 = [𝐻2 𝑃𝑂4− ]

(10−7 )([𝐻𝑃𝑂42− ])
6,2.10−8 = , [𝐻𝑃𝑂42− ] = 19,14 𝑚𝑀
(50 − [𝐻𝑃𝑂42− ])
[𝐻2 𝑃𝑂4− ] = 50 𝑚𝑀 − 19,14 𝑚𝑀 = 30,86 𝑚𝑀
19,14 𝑚𝑀×250 𝑚𝐿
 𝑉𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 0,1 𝑀 = 100 𝑚𝑀
= 47,85 𝑚𝐿
 30,86 𝑚𝑀×250 𝑚𝐿
 𝑉𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 0,1 𝑀 = 100 𝑚𝑀
= 77,15 𝑚𝐿

o pH buffer posfat terukur = 6,99

 Pembuatan Nutrient Broth
𝑔
o 𝑚 𝑏𝑒𝑒𝑓 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 0,3 × 30 𝑚𝑙 = 0,09 𝑔
100 𝑚𝐿

𝑚 𝑏𝑒𝑒𝑓 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 0,09 𝑔

𝑔
o 𝑚 𝑁𝑎𝐶𝑙 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 0,5 100 𝑚𝐿 × 30 𝑚𝑙 = 0,15 𝑔

𝑚 𝑁𝑎𝐶𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 0,15 𝑔

𝑔
o 𝑚 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 0,5 100 𝑚𝐿 × 30 𝑚𝑙 = 0,15 𝑔

𝑚 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 0,15 𝑔

 Pembuatan Nutrient Agar
𝑔
o 𝑚 𝑏𝑒𝑒𝑓 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 0,3 × 100 𝑚𝑙 = 0,3 𝑔
100 𝑚𝐿

𝑚 𝑏𝑒𝑒𝑓 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 0,3 𝑔

𝑔
o 𝑚 𝑁𝑎𝐶𝑙 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 0,5 100 𝑚𝐿 × 100 𝑚𝑙 = 0,5 𝑔

𝑚 𝑁𝑎𝐶𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 0,5 𝑔

𝑔
o 𝑚 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 0,5 100 𝑚𝐿 × 100 𝑚𝑙 = 0,5 𝑔

𝑚 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 0,5 𝑔

𝑔
o 𝑚 𝑎𝑔𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 2 × 100 𝑚𝑙 = 2 𝑔
100 𝑚𝐿

𝑚 𝑎𝑔𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = 2 𝑔
 Pembuatan glukosa 1 mg/ml
1𝑚𝑔
o 𝑚 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 = × 50 𝑚𝐿 = 50 𝑚𝑔
𝑚𝐿

o 𝑚 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑏𝑎𝑎𝑛 = 50 𝑚𝑔
 Pembuatan etanol 70%
100 𝑚𝐿 ×70%
o 𝑉 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 96% = 96%
= 73 𝑚𝐿

o 𝑉 𝑎𝑖𝑟 = 100 𝑚𝐿 − 73 𝑚𝐿 = 27 𝑚𝐿
 Pembuatan buffer TAE 10x
𝑚𝑜𝑙 𝑔
o 𝑚 𝑏𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑟𝑖𝑠 = 0,4 𝐿
× 0,05 𝐿 × 121 𝑚𝑜𝑙 = 2,42 𝑔
𝑚𝑜𝑙 𝑔
o 𝑚 𝐸𝐷𝑇𝐴 = 0,02 𝐿
× 0,05 𝐿 × 372 𝑚𝑜𝑙 = 0,372 𝑔
𝑚𝑜𝑙
0,002 ×0,05 𝐿
𝐿
o 𝑚 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡 = 17,5 𝑀
= 0,57 𝑚𝐿
 Bab IV Pembahasan
Pada percobaan ini, dilakukan teknik sterilisasi basah yakni sterilisasi dengan uap air panas
lewat penggunaan alat autoklaf. Kondisi dari autoklaf adalah 121oC dan 15 psi. Suhu 121oC adalah
suhu saat semua mikroorganisme diperkirakan mati. Tujuan penggunaan tekanan tinggi adalah
membantu mematikan mikroorganisme lewat pemberian tekanan yang mampu memecah membrane
dari mikroorganisme. Waktu yang diperlukan pada saat pemanasan oleh autoklaf adalah 1 jam, waktu
ini terdiri dari 15 menit proses autoklaf dan 45 menit proses pendinginan dan penurunan tekanan
autoklaf. Larutan yang disterilisasi meliputi larutan buffer posfat, buffer TAE, glukosa, dan media.
Garam posfat digunakan untuk membuat buffer pH 7 dikarenakan pKa2 dari asam posfat mendekati
nilai pH 7. Buffer sangat diperlukan saat pekerjaan analisis melibatkan kehadiran enzim tertentu,
kinerja enzim bergantung pada pH dikarenakan enzim merupakan polipeptida yang mampu
mengalami denaturasi saat pH terlalu tinggi atau tidak sesuai dengan karateristik enzim tersebut.
Akibat denaturasi tersebut, kinerja enzim menjadi tidak maksimal atau enzim tidak dapat bekerja
sama sekali.

Kemudian larutan media pertumbuhan terdiri dari NaCl yang berperan sebagai elektrolit dan
menjaga tekanan osmosis media. Pepton dan ekstrak daging berperan sebagai sumber zat hara dan
makanan bagi mikroorganisme untuk pertumbuhan sel. Mikroorganisme memerlukan unsur hara, pH,
dan tekanan osmosis yang sesuai supaya dapat bertumbuh dengan baik. Media yang dibuat meliputi
media padat dan media cair. Media padat yang akan digunakan umumnya akan dimasukkan ke dalam
cawan petri atau tabung reaksi saat akan digunakan, namun volume media yang dituangkan adalah
2/3 dari volume wadah. Hal ini bertujuan untuk menyediakan udara yang akan digunakan bakteri
aerob untuk respirasi. Komponen agar di dalam media padat akan menentukan kemampuan
pemadatan suatu media, semakin banyak agar maka media tersebut akan semakin mudah memadat.
Media NB umumnya digunakan untuk menanam bakteri penghasil gas dan mengisolasi bakteri.
Sedangkan media NA digunakan untuk mendapatkan koloni tunggal dan inokulasi.

Larutan glukosa 1mg/ml nantinya akan digunakan sebagai sumber makanan bagi
mikroorganisme. Glukosa merupakan bentuk sederhana dari gula yang mudah dicerna dan langsung
menuju metabolisme glikolisis. Buffer TAE (tris, asetat, EDTA) akan digunakan saat elektroforesis DNA
dengan gel agarosa. EDTA berperan sebagai pengkelat logam divalen yang mampu bertindak sebagai
kofaktor DNAnase, DNAnase berpeluang memotong DNA yang sedang dianalisis. Larutan etanol 70%
adalah cairan aseptik yang mampu membunuh mikroorganisme dan menghilangkan DNA nase lewat
mendenaturasi protein dan fosfolipid.
 Bab V Penutup
Simpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan larutan buffer posfat 50 mM pH 7, larutan
glukosa 1mg/ml, media NA dan NB, etanol 70%, dan buffer TAE berhasil dibuat. Juga sterilisasi bahan
dan alat dengan autoklaf telah dilakukan.

Daftar Pustaka
Silindir, M., & Özer, A. Y. (2009): Sterilization methods and the comparison of e-beam sterilization
with gamma radiation sterilization, Fabad Journal of Pharmaceutical Sciences, 34, 43.

www.sigmaaldrich.com

www.labprotocols.com