MAKALAH ANALISA KIMIA INSTRUMEN

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)/KCKT

(Kromatografi Cair Tenaga Tinggi)

DISUSUN OLEH :

ISTIQOMAH
KELAS : 4 Kimia Analisis 1

SEKOLAH MENENGAH KEJURUAN NEGERI 1

TEMANGGUNG
Jalan Kadar Maron, Temanggung Kode Pos 56221 Telepon 0293-4901639
 Faksimile 0293-4901639 Surat Elektonik smkn1_marontmg@yahoo.co.id

KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan saya kemudahan sehingga saya dapat
menyelesaikan makalah ini dengan tepat waktu. Tanpa pertolongan-Nya tentunya saya tidak
akan sanggup untuk menyelesaikan makalah ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga
terlimpah curahkan kepada baginda tercinta kita yaitu Nabi Muhammad SAW yang kita
nanti-natikan syafa’atnya di akhirat nanti.

Saya mengucapkan syukur kepada Allah SWT atas limpahan nikmat sehat-Nya, baik itu
berupa sehat fisik maupun akal pikiran, sehingga saya mampu untuk menyelesaikan
pembuatan makalah sebagai tugas dari mata pelajaran Kimia Instrumen dengan judul “HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) ”.
Saya tentu menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kata sempurna dan masih banyak
terdapat kesalahan serta kekurangan di dalamnya. Untuk itu, apabila terdapat banyak
kesalahan pada makalah ini saya mohon maaf yang sebesar-besarnya.

Demikian, semoga makalah ini dapat bermanfaat. Terima kasih.

Temanggung , Agustus 2019

Istiqomah
 Daftar Isi
BAB I....................................................................................................................................................5
PENDAHULUAN.................................................................................................................................5
1.1 Latar Belakang....................................................................................................................5
1.2 Rumusan Masalah...............................................................................................................6
1.3 Tujuan..................................................................................................................................6
BAB II...................................................................................................................................................7
PEMBAHASAN...................................................................................................................................7
2.1 Definisi..................................................................................................................................7
2.2 Prinsip Dasar........................................................................................................................8
2.3 Manfaat KCKT....................................................................................................................8
2.4 Kelebihan dan Kekurangan KCKT....................................................................................8
2.5 Resolusi...............................................................................................................................10
2.6 Instrument KCKT.............................................................................................................10
2.7 Jenis- jenis KCKT..............................................................................................................14
2.8 Penerapan KCKT..............................................................................................................17
BAB III PENUTUP............................................................................................................................18
DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................................................20
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Di dunia ini sangat banyak ditemukan unsur-unsur. Ada yang bersifat logam,
semilogam, dan nonlogam. Dan letaknya pun juga berbeda-beda. Ada yang di tanah,
udara, air, dan lain-lain. Seorang analis perlu untuk mengetahui banyak konsentrasi
unsur-unsur logam tersebut. Misalnya unsur yang ada di dalam daun tumbuh-
tumbuhan. Pentingnya bagi seorang analis adalah untuk menambah ilmu pengetahuan
dan untuk menganalisis suatu penyakit, bahkan juga berguna untuk menciptakan suatu
produk yang berguna bagi masyarakat luas. Namun, proses analisis tersebut tidaklah
mudah. Karena membutuhkan keahlian tertentu. Cara penentuan konsentrasi suatu
unsur (logam) dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu cara konvensional dan cara
instrumental. Cara konvensional adalah cara menentukan konsentrasi suatu unsur
yang berdasarkan reaksi-reaksi kimia dan cara ini masih sederhana serta memiliki
banyak kesalahan. Sedangkan cara instrumental adalah cara menentukan konsentrasi
suatu unsur dengan menggunakan alat instrument yang canggih. Cara ini lebih efektif
dan efisien serta memiliki banyak keuntungan.

Pada saat ini, pekerjaan yang dilakukan secara konvensional sudah mulai pudar.
Umumnya, orang-orang cenderung menggunakan alat-alat yang canggih untuk
melakukan pekerjaannya. Karena menurut mereka, dengan menggunakan alat mereka
merasa terbantu. Sehingga mudah dalam mengerjakan pekerjaannya. Untuk itu, dalam
menentukan konsentrasi suatu logam dalam sampel juga sangat dibutuhkan instrument
yang canggih.

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berdampak pada

makin meningkatnya pengetahuan serta kemampuan dari manusia. Betapa tidak setiap
manusia lebih dituntut dan diarahkan kearah ilmu pengetahuan dan teknologi di segala
bidang. Tidak ketinggalan pula ilmu kimia yang identik dengan ilmu mikropun tidak
luput dari sosrotan perkebangan IPTEK ini. Belakangan ini telah lahir IPTEK-IPTEK
yang berpeluang mempermudah dalam keperluan analisis kimia. Bebrapa bentuk
kemajuan IPTEK di bidang analisis kimia diantaranya alat serapan atom yang
kemudian sangat mendukung dalam analisis kimia dengan metode Atomic Absorption
 Spectrophotometry (AAS), High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC), dan
Gas Chromatography (GC).

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa definisi KCKT?
2. Apa prinsip dasar kerja KCKT?
3. Apa saja manfaat KCKT?
4. Apa saja kelebihan dan kekurangn KCKT?
5. Bagaimana resolusi pada KCKT?
6. Apa saja instrumen dari KCKT?
7. Apa saja jenis-jenis KCKT?
8. Bagaimana penerapan KCKT?

1.3 Tujuan

Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah untuk mengetahui prinsip dasar dan
prinsip kerja KCKT, mengetahui jenis-jenis KCKT, mengetahui instrumen dari
KCKT, mengetahui kelebihan dan kekurangan KCKT, mengetahui fase diam dan fase
gerak yang digunakan, mengetahui kolom apa yang digunakan dalam KCKT,
mengetahui macam detektor yang digunakan, dan mengetahui penerapan KCKT.
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Definisi
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak
destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
KCKT paling sering digunakan untuk :
1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
2. Menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses
sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Komatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan
senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)
dengan menggunakan fase gerak (mobile phase) mengaliri semua ini. Senyawa dalam
kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan
mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak
Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi
puncak. Kedua hal ini berguna untuk :
1. Analisis kualitatif digunakan informasi tR,
2. Analisis kuantitatif digunakan informasi luas
3. Area/tinggi puncak kromatogram
Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :
1. Low pressure (tekanan rendah)
2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).
Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan
ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan
menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus
76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur
meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena
ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding.
Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom
konstan sehingga KD tetap.
2.2 Prinsip Dasar
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <
senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan
alkohol < golongan asam.

2.3 Manfaat KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi sering kali digunakan untuk beberapa
kepentingan, seperti :
1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
4. Penentuan molekul-moleku netral, ionik, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa yg strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa-senyawa dlm jml sekelumit (trace elements)
8. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu

2.4 Kelebihan dan Kekurangan KCKT

Banyak analisa yang mengutamakan penggunaan KCKT dalam proses kerja
mereka, hal ini dikarenakan KCKT mempunyai beberapa kelebihan dibanding metode
Kromatografi lainnya, diantaranya :
1. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
2. Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
 Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa
gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan
yang diinginkan.
3. Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam
zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
4. Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan
dari solven dan jenis solven yang digunakan.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies
ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis
zat – zat tersebut.
6. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam
KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan
menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur
khusus.
Namun, terdapat pula beberapa kekurangan KCKT yang membuatnya tidak
efisien untuk digunakan, yaitu :
1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan
spektrometer massa
2. Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan) yang
baik sulit diperoleh
3. Mahal
4. Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
5. Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan
2.5 Resolusi
Merupakan tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode
kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan Untuk hasil
 pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara
sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak
tumpang tindih.

Resolusi adalah ukuran dari pemisahan efektif puncak analit yang berdekatan.
Resolusi dua puncak dibantu oleh faktor termodinamika, yang menimbulkan partisi
dan pemisahan (yaitu-K), dan itu adalah balas oleh kinetika, yang dapat menimbulkan
dispersi tambahan puncaknya, membuat puncak yang dinyatakan baik jika dipisahkan
antar dua puncaknya.

2.6 Instrument KCKT

Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi
lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam,
detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya.
1. Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert.
Wadah ini dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih
dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan
menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan sangat
mengacaukan hasil analisis.
2. Fase Gerak
Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan
tingkat kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT
(HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada
sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang
kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.
Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan
campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan
resolusi KCKT ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat-sifat komponen dalam sampel.
Secara umum ada 2 tipe fase gerak:
a. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak
berubah selama percobaan kromatografi
b. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang
berubah selama masa kromatografi
Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan)
serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk
mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi
maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada
elusi gradien.
Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada
cairan murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak
secara coba-coba tentu tidak mudah dilakukan.
Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak
dibedakan menjadi:
a. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya
akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.
b. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya.
Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.
c. Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun
berdasarkan kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase
gerak.
Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan
adalah campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan
 dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon
dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.

3. Pompa
Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan
pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi
dan mamp mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:
a. Pompa dengan tekanan konstan
b. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum
digunakan.

4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Untuk mengetahui perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor klik disini.
Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:
a. Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi kolom
konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor mempunyai kecepatan
alir yang lebih lambat (10-100 ul/menit)
b. Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa
c. Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat,
sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel
klinis.
Perbedaan kolom konvensional dan mikrobor akan dijelaskan disini :
I. Fase Diam
Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

II. Detektor
Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang
bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal
adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah
detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.
Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:
1. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible
2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar
yang sangat kecil
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada
kolom mikrobar.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang luas
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini.
Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya
didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan
faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks
bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan
dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini
mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang
proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan
kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan pendeteksian akan
bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut.
a. Detektor Spektrofotometri
Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya,
spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan
memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat
terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.
b. Detektor fluorometri
Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.
c. Detektor elektrokimia
 Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana
larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial
pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer
elektron.

5. Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa
komputer, integrator dan rekorder.

2.7 Jenis- jenis KCKT

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase

diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua
pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal
dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan
berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut,
dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

2.7.1 Kromatografi Adsorbsi

 Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi
kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase
diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda,
karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang
berekor

2.7.2 Kromatografi Fase Terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak
adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk
solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena
kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam
menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi
karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat

2.7.3 Kromatografi Penukar Ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya
air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin
2.7.4 Kromatografi Pasangan Ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-

sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran
ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan

2.7.5 Kromatografi Eksklusi

Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan
dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul
> 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar,
akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan
terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM
yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.
Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi
kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

2.7.6 Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang

sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik
tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks

2.8 Penerapan KCKT

Penerapan secara umum adalah:

 - Kombinasi kromatografi cair tekanan tinggi (KCKT) dengan
pemantauan melalui deteksi UV/visibel memberikan suatu
metode yangg akurat, tepat, dan terandalakan untuk analisi
kuantitatif produk-produk farmasi dan merupakan metode
standar di industri untuk tujuan ini.
- Pemantauan stabilitas zat-zat obat murni dan obat-obat dalam
formulasi, dengan penukuran kuantitas semua hasil urai.
- Pengukuran obat-obat dan metabolitnya di dalam cairan
biologis.
- Penentuan koefisien partisi dan nilai-nilai pKa obat dan
penentuan ikatan protein obat.

Penerapan KCKT untuk analisis kuantitatif obat-obatan dalam

formulasi

- Analisis berdasarkan kalibrasi dengan baku eksternal

- Analisis tablet parasetamol dengan menggunakan kurva
kalibrasi
- Penetapan kadar parasetamol dan aspirin dalam tablet dengan
menggunakan kurva kalibrasi rentang-sempit.
- Penetapan kadar krim hidrokortison dengan kalibrasi satu-titik
terhadap baku internal.

Penerapan kadar yang melibatkan teknik-teknik KCKT yang

lebih khusus

- Penetapan kadar injeksi adrenalin secara kromatografi dengan

senyawa pasangan ion anionik
- Penetapan kadar asam askorbat secara kromatografi dengan
senyawa pasangan ion kationik dan deteksi elektrokimia
- Penetapan kadar protein dengan kemasan KCKT berpori lebar
 BAB III
PENUTUP

Demikian dapat diketahui bahwa:

- Prinsip Dasar: Prinsip dasar dari KCKT, dan semua metode

kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample
untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif).
Untuk KCKT sendiri pemisahan didasarkan atas perbedaan sifat
kepolarannya. Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi
krusial point dalam metode KCKT. Yang pertama adalah proses
separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua
hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses
analisa.
Prinsip Kerja: Suatu fase gerak cair dipompa dibawah tekanan
melalui kolom baja yang mengandung partikel-partikel fase diam
dengan diameter 3-10 um. Analit tersebut dimasukkan ke dalam
bagian atas kolom melalui katup lengkung dan pemisahan suatu
campuran berlangsung sesuai dengan lamanya waktu relatif yang
dibutuhkan oleh komponennya di dalam fase diam. Perlu
diperhatikan bahwa semua komponen di dalam cammpuran
membutuhkan waktu yang kurang lebih sama dengan fase gerak
agar dapat keluar dari kolom. Pemantauan eluen kolom dapat
dilakukan dengan berbagai detektor.
- Jenis-jenis KCKT: Kromatografi padat-cair, Kromatografi partisi,
Kromatografi penukar ion, dan Kromatografi eksklusi.
- Instrumensi: Reservoir pelarut, pompa, injektor, kolom, detektor,
dan penangkap data
- Kelebihan: Pemasukan sampel yang tepat dan mudah dikendalikan
menjamin presisi kuantitatif. KCKT merupakan teknik kromatografi
yang perkembangannya tampak paling intensif beberapa tahun
belakangan, memberikan perbaikan pada pengendalian kolom,
detektor, dan piranti lunak. Keragaman kolom dan detektor berarti
bahwa selektivitas metode tersebut dapat disesuaikan dengan
mudah. Dibandingkan dengan KG, terdapat risiko penguraian
sampel yang lebih kecil karena pemanasan bukan meruupakan
syarat dalam proses kromatografi. Mudah diotomatisasi.
Kekurangan: Masih dibutuhkan detektor yang terandalkan dan tidak
mahal yang dapat memantau senyawa-senyawa yang tidak memiliki
kromofor. Obat-obat harus diekstraksi dari formulasi sebelum
dianalisis. Terbentuknya buangan pelarut organik dalam jumlah
besar, yang mahal jika dibuang.
- Terdapat dua mekanisme penting yang menyebabkan penahanan
suatu senyawa melewati kolom. Kedua mekanisme untuk gel silika
yang merupakan pengemas fase lurus, dengan mekanisme
penahanan melalui adsorpsi gugus polar suatu molekul pada gugus
polar fase diam. Gel silika ODS juga yang merupakan pengemas
fase balik dengan mekanisme penahanan akibat partisis bagian
lipofilik suatu molekul ke dalam fase diam. Dengan fase gerak
berbanding terbalik dengan fase diamnya.
- Terdapat 2 jenis kolom dalam KCKT, yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor.
- Macam Detektor yang digunakan adalah detektor UV panjang
gelombang yang bervariasi, detektor dioda array (DAD), detektor
hamburan-cahaya evaporatif, detektor elektrokimia, detektor
amperometik berpulsa, detektor indeks bias, dan detektor
fluoresensi.
- Penerapannya antara lain: Pengukuran obat-obat dan metabolitnya
di dalam cairan biologis, penentuan koefisien partisi dan nilai-nilai
pKa obat dan penentuan ikatan protein obat, analisis berdasarkan
kalibrasi dengan baku eksternal, analisis tablet parasetamol dengan
menggunakan kurva kalibrasi, dan penetapan kadar protein dengan
kemasan KCKT berpori lebar
 DAFTAR PUSTAKA

https://www.academia.edu/24575160/MAKALAH_KIMIA_ANALISIS_KROMATOGRAFI
_CAIR_KINERJA_TINGGI_KCKT_

https://www.academia.edu/36619763/HPLC

https://www.academia.edu/5267709/HPLC_LENGKAP_HPLC_ADALAH_HPLC_High_Pe
rformance_Liquid_Chromatography

http://kimia40.blogspot.com/2016/10/makalah-kromatografi-cair-kinerja.html

https://www.academia.edu/29770793/HPLC_High_Performance_Liquid_Chromatography

https://www.academia.edu/12317735/HPLC_kromatografi