Real Time PCR

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Jika dialih bahasakan ke

dalam Bahasa Indonesia menjadi reaksi berantai menggunakan aktivitas enzim Polymerase.
PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik
tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam
jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang
menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh
hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan
di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah
sampel yang sangat kecil.
Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi
PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real
time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction),
adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak)
sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.
Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut
dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA
atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel
DNA yang dianalisa.
Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau
PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk
mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih
urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi
secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif
ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.
Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi
dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah
dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR
memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA
hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi
dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap
elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide
(EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.
 Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah
DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time
sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum
digunakan antara lain :
(1) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda
(dsDNA) misalnya SyBr Green, dan
(2) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan
berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe
FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal
fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah
berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang
dihasilkan.   

Prinsip Real Time PCR (qPCR)

PCR adalah suatu molekul perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang
diperoleh dapat digunakan untuk analisis penelitian. DNA yang jumlahnya sangat sedikit juga
dapat dikarakterisasi dengan metode ini. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas pada
kedokteran forensik, diagnosis genetika, hingga teknik ini banyak digunakan karena cukup
spesifik, efisien, dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi
Real-Time PCR memiliki keunggulan daripada konvensional PCR yaitu pada Real-Time
sistem pengukuran analisis menggunakan molekul probes yang dapat diukur pada tiap siklus
reaksinya, pada konvensional PCR deteksinya memerlukan gel agarosa untuk proses
elektroporesis DNA pada deteksi produk hasil amplifikasi DNA tersebut

Real-Time PCR dapat mendeteksi produk amplifikasi pada tiap siklus pada proses
penggandaan DNA. Pada sistem Real-Time PCR ini terdapat enzim DNA polimerase yang
memiliki aktivitas pada DNA yang memiliki fungsi exonuclease pada rantai DNA 5’ menuju
3’. DNA polimerase ini dapat menguraikan molekul probes yang terikat pada untaian tunggal
DNA sehingga dapat digunakan untuk deteksi amplikon pada target DNA yang spesifik.
Molekul probes ini mengikat oligonukleotida dan akan mengikat sekuen DNA target. Probes
ini terikat pada ujung 5’P dan pada ujung 3’

Molekul probes ini memiliki bagian reporter dye pada ujung 5’ yang dapat mengeluarkan
floresensi sedangkan pada ujung 3’ terdapat quencher yang dapat meredam floresensi pada
reporter dye. Sehingga sebelum reaksi emisi dari reporter dye tidak dapat terbaca pada
detektor
Sekuen DNA Pada Primer hewan
Forward primer (F) Reverse primer (R) AT
Hewan
Sekuen (5’-3’) Posisi Sekuen (5’-3’) Posisi
CGGTGGCTA
AGCAGTCTGC
Ayam TGAGTGTGA F:311-292 R:43-58 67 °C
CTCATG
GG
TATGAGGGT
TAGCAGTATG
Kalkun GAGAAGTA F:304-287 R:42-61 63 °C
CCTCATCACT
A
GTTGCTATA TAGGCATCTG
Babi F:304-287 R:37-56 60 °C
ACGGTAAAT CCTAATCTTG
GGACGTATC GGAATCTGCC
Sapi F:323-307 R:38-55 57 °C
CTATAAAT TAATCCTA
ATGCTGTGG CCTAGGCATTT
Biri-Biri F:305-289 R:31-52 60 °C
CTATTGTC GCTTAATTTTA

DAFTAR PUSTAKA

Gibson, U.E.M., Heid, CA & Williams, M.P. (1996) A novel method for real ime quantitative
RT-PCR. Genome Research, 6, 986-995

Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. & Williams, M.P. (1996) Real Time quantitative PCR,
Genome Research 6, 995-1001