Nama : Nurul Lestari Musva

Nim : 1805110835

Kelas : 4A

Matkul : Kimia Analitik II

Ringkasan Mengenai Jenis Kromatografi Kolom dan Contoh Analit, Cara Menghitung Waktu
Retensi , Dan Perhitungan Nilai Resolusi

Jenis-Jenis Kromatografi Kolom dan Contoh Analit

Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerak kromatografi kolom dibagi menjadi dua yaitu:

1. Kromatografi Kolom Fase Normal

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar,
misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.

2. Kromatografi Kolom FaseTerbalik

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya
bersifat polar; kebalikan dari fase normal. Jika kolom kromatografi dikemas kering dalam
keadaan vakum, maka metode kromatografi tersebut disebut kromatografi cair Vakum.

Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben

1. Kromatografi adsorbsi

Dalam kromatografi adsorbsi, komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada
permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. Kromatografi Kolom Adsorpsi
Berbeda dengan kromatografi partisi, maka dalam kromatografi adsorpsi yang menjadi fase
diam terdiri dari padatan yang sekaligus juga sebagai penyangga. Permukaan partikel-
partikel penyangga memiliki sifat aktif yang dapat mengikat komponen-komponen atau
molekul-molekul tertentu. Pada kromatografi kolom, adsorpsi juga digunakan seperti halnya
pada kromatografi kolom partisi dan cara penyiapannya juga tidak berbeda dengan penyiapan
kolom partisi. Pada umumnya penyangga merupakan komponen yang memiliki polaritas
tinggi, sehingga menarik solut pada permukaan penyangga sangat tergantung pada polaritas
solut. Sedangkan eluennya digunakan pelanut yang polaritasnya rendah.

2. Kromatografi partisi

Dalm kromtografi partisi, komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara
lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase diam dn eluen yang
bertindak sebagai fase gerak. . Penggunaan Kromatografi Kolom Partisi Pada sistem partisi,
adalah komponen yang sesuai atas perbedaan pada fase diam. Sistem ini terjadi pada
kromatografi yang menggunakan fase diam dan fase bergeraknya terdiri dari cairan, fase
diam dan fase bergeraknya berbentuk gas, fase diam berbentuk cairan sementara fase
bergerak terdiri gas, atau fase diam berbentuk gas sedangkan fase diamnya berbentuk cairan.
Untuk bahan penyangga terdiri dari gel silika, bahan penyangga harus dicampur dengan fase
diam yang akan digunakan dengan perbandingan 0,5-1,0 bagian fase diam dengan 1,0 bagian
bahan penyanggu. Pencampur harus baik, misalnya dengan menggunakan mortar atau
blender sehmgga akan dihasilkan semacam pasta atau bubur yang tidak terlalu basah tetapi
juga tidak kering. Fase diam kemudian ditambahkan berlebihan pada pasta tersebut schingga
terjadi sluri. Setelah sluri dimasukkan tabung, sluri diaduk dengan pengaduk berbentuk
cakram yang lebih kecil beberapa diameter tabung. Pada pusat cakram diberi tangkai
panjang. Jika cakram dimasukkan ke dalam tabung dan digerakkan berkali-kali sepanjang
tabung ke atas dan ke bawah, maka cakram akan dapat dipindahkan, dan sluri akan dapat
dipindahkan melalui sela-sela cakram dengan menggunakan tabung. Gerakan cakram harus
ganda-lahan, dilakukan beberapa kali. Sesudah itu cakram diambil dan kelebihan fase
dikeluarkan melalui mulut tabung yang diberikan di bagian dasar tabung. Untuk kolom
selulosa, maka bubuk selulosa direndam ke dalam aseton. Campuran kemudian dituangkan
ke dalam tabung. Kelebihan aseton dikeluarkan melalui tabung yang terletak di bagian dasar
tabung. Kolom kemudian diambil dengan fas bergerak sampai terjadi keseimbangan.
Kadung-kadang sebelum dipindahkan dengan fase bergerak, dipindahkan dulu dengan air
berlebihan.

3. Komatografi petukaran ion

Kromatografi petukran ion memishkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen

tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan terlepas/terelusi
oleh fase gerak.

4. Komatogrfi filtrasi gel

Dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam.
Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari
komponen yang dipisahkan.

Berdasarkan gaya yang bekerja pada kolom

Kromatografi kolom kategori ini tergantung pada bagaimana eluen bergerak melewati kolom,
terdiri dari kromatografi kolom gravitasi dan kromatografi kolom tekanan.

1. Kromatografi kolom gravitasi

Dalm komatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya gravitasi atau perkolasi.

Dalam komatografi kolom gravitasi, eluen bergerak berdasarkan gaya gravitasi atau
perkolasi.

1. Peralatan

Biasanya terbuat dari gelas yang berfungsi sebagai penunjang fase diam. Pada bagian dasar
dari kolom mempuny bentuk sedemikian rupa agar fase diam dapat tetap dalam keadaan
statis. Terdapat glass woll atau kapas, atau bahan dari pasir kuarsa yang dikemas dengan
kolom

2. Wadah eluen

Eluat dari kolom ditampung dalam bentuk fraksi-fraksi. Pada dasarnya penampung dapat
dilakukan secara manual, namun jika total volume dari eluat besar dengan setiap fraksi yang
diinginkan dalam volume kecil, maka diperlukan suatu alat penampung tertentu. Untuk hal
ini biasanya digunakan suatu alat penampun otomatis yng dikenal sebagai kolektor.

Pengemasan Kolom

A. Cara Basah

• Adsorben dicampur dengan pelarut, kemudian campuran dimasukkan ke dalam kolom.

• Keuntungan dari metode ini adalah gelembung udara dapat dihilangkan dari kolom.

• Contoh pengerjaan :

1. Kolom diisi dengan pelarut non polar seperti heksana kira-kira setengah dari tinggi kolom
gelas.

2. Ditimbang sebanyak 8 gram alumina dalam gelas piala sementara erlenmeyer 125 diisi 15
ml heksana. Dengan perlahan serbuk alumina ditambahkan sedikit demi sedikit sambil
diaduk. Gunakan pipet pasteur untuk membuat bubur, kemudian dengan cepat bubur tersebut
dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom.

3. Tempatkan erlenmeyer di bawah kolom kemudian buka screw clamp dan biarkan pelarut
mengalir.

4. Teruskan penambahan bubur alumina sampai habis, jangan lupa penambahan pelarut
heksana terus dilakukan dan pelarut heksan yang keluar dapat ditampung dan digunakan
kembali untuk packing/menambah lagi alumina ke dalam kolom.

5. Jika packing sudah selesai, screw clamp ditutup, tinggi cairan minimal sma dengan tinggi
alumina. Kadang-kadang pasir juga ditmbahkan pda puncak kolom untuk mencegah dari
gangguan saat pelarut baru ditambahkan.

Pengemasan Kolom

B. Cara Kering

• Metode ini lebih mudah tapi dapat menimbulkan adanya gelembung udara dalam kolom.
Gelembung udara ini harus dihindari, karena akan mengurangi resolusi dari pemisahan.

• Contoh pengerjaan :
1. Bagian dasar dari kolom diisi dengan glass woll secukupnya. Pinch clamp ditutup dan
kolom diisi dengan pelarut.

2. Masukkan 8 gram alumina ke dalam kolom gelas yang berisi pelarut dan biarkan pelarut
mengalir. Pinch clamp ditutup jika packing sudah selesai dan tinggi pelarut minimal sama
dengan tinggi alumina. Demikian juga hindari agar kolom tidak kering.

3. Perbandingan antara volume total kolom (cair+padat) dengan diameter kolom yang optimal
agar diperoleh pemisahan yang baik.

Secara umum, hanya dapat dinyatakan bahwa kemasan kolom yang panjang akan
memberikan tingkat pemisahan yang tinggi dan kolom yang lebar adalah baik untuk
memisahkan komponen- komponen dalam jumlah besar.

4. Jenis fase diam yang digunakan adalah silika gel dan alumina.

2. Kromatografi kolom tekanan

Adsorben, Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya pemberian
tekanan pada kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi.
Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum disunakan
untuk kromatografi kolom. Jika ukuran mesh lebih besar, maka ukuran silika tersebut lebih
kecil.

Ukuran partikel dari adsorben sngat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati
kolom. Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom
tekanan sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk
komatografi kolom gravitasi.

ADSORBEN

• Dalam kromatografi kolom tekanan, eluen bergerak karena adanya pemberian tekanan pada
kolom. Tekanan yang diberikan tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi.

• Contoh :

• Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3). Jika ukuran mesh lebih besar, maka ukuran silika
tersebut lebih kecil.

• Ukuran partikel dari adsorben sangat berpengaruh pada bagaiman eluen bergerak melewati
kolom. Partikel yang lebih kecil (mesh lebih besar) digunakan untuk kromatografi kolom
tekanan sedangkan adsorben dengan ukuran partikel yang lebih besar digunakan untuk
komatografi kolom gravitasi.

• Alumina

• Daya adsorbsi alumina dapat diatur dengan mengatur jumlah air yang dikandung. Caranya
ialah dengan mengeringkan alumina pada suhu 360 derajat C selama 5 jam, kemudian
membiarkan alumina kering tersebut menyerap air sampai jumlah tertentu.
PELARUT

• Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan
pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu
retensi yang terlalu lama.

• Sistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut
mengelusi kolom. Dalam hal ini pelarut yang pertama kali digunakan adalah pelarut non
polar untuk mengelusi komponen yang kurang polar. Pelarut yang lebih polar ditambahkan
untuk mengelusi komponen yang lebih polar juga.

Cara Menghitung Waktu Retensi

Waktu retensi: waktu dari awal sinyal terdeteksi oleh detektor hingga titik puncak profil
konsentrasi elusi masing-masing sampel yang berbeda. Waktu retensi (tR) adalah waktu yang
dibutuhkan oleh analit dari awal kolom sampai ke detektor. Semakin lama analit berinteraksi
dengan fase diam semakin lama ia keluar, tR semakin besar. Sehingga ada suatu konstanta
yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam. Kecepatan migrasi solut
dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh
afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:

Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak

Dari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan kalo semakin besar harga Kd suatu
senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam
besar dan migrasinya semakin lambat.

Pada pemisahan campuran-campuran pada kolom, solut di cirikan dengan waktu retensi (tR)
dan faktor retensi (k’) yang berbanding lurus dengan D. Waktu retensi merupakan lamanya
waktu yang di butuhkan solut untuk melewati kolom. Waktu retensi dan faktor retensi di
hubungkan oleh persamaan berikut:

tR=tM(1+k’)

tM terkadang di tulis t0 dan di kenal sebagai waktu mati merupakan waktu yang di butuhkan
oleh solut yang tidak tertahan untuk melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan
bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak, karenanya perbandingan
distribusi (D) dan faktor retensinya adalah 0 akan tertahan secara profosional dan akan
mempunyai waktu retensi yang lebih besar dari pada tM, misal:

jika k’ = 1 maka tR= 2tM

jika k’ = 2 maka tR = 3tM

kondisi kromatografi umumnya di atur sedemikian rupa sehingga nilai k’ lebih kecil dari
pada 20 untuk menghindari waktu retensi yang terlalu panjang. Nilai k’ dapat di hitung
dengan menyusun ulang persamaan di atas:
tR=tM (1=k’) maka k’ = (tR-tM) / tM

dalam kromatografi ukuran eksklusi, solut di karakterisasi dengan volume retensi (Vr) yang
merupakan volume fase gerak yang di butuhkan untuk mengelusi solut dari kolom. Waktu
retensi berbanding langsung dengan volume retensi pada kecepatan alir yang konstan
sehingga persamaan di atas dapat di tulis kembali:

Vr=Vm (1+k’)

Sementara nilai k dapat di ganti dengan:

k’=D(Vs / Vm)

dengan menggabungkan kedua persamaan ini maka akan di peroleh:

Vr=Vm(1+D Vs / Vm)

Atau

Vr=Vm+DVs

Vs dan Vm masing-masing merupakann volume fase diam dan volume vase gerak dalam
kolom.

Persamaan tersebut merupakan persamaan pundamental pada kromatografi kolom karena

berhubungan dengan volume retensi solut terhadap perbandingan distribusinya.

Perhitungan Nilai Resolusi

Resolusi adalah tingkat pernisahan atau derajat pemisahan dua komponen sample pada
kromatografi . Resolusi dapat dihitung sebagai jarak antara 2 puncak dibagi lebar alas
puncak. Nilai Resolusi ditentukan oleh selektifltas kolom (tR)dan efisiensi kolom (W). Nilai
resolusi yang baik adalah ≥ 1,5 yang disebut resolusi garis dasar atau Base line resolution.
Pada harga R = 1,5 tumpangsuh antara dua puncak adalah 0,3 %, ini sudah cukup untuk
analisis ,sedangkan untuk R=l tumpangsuh adalah 2%.

Resolusi adalah derajuat pemisahan dua komponen campuran dalam peoses kromatografi
dinyatakan dengan istilah resolusi (Rs) yang diformulasikan sebagai berikut:

R = (N1/2 / 4) ((α – 1) / α) ( k’2/ (1+ k’2))

N= efisiensi rata-rata

α = selektivitas

k’= retensi