6f77 PDF
6f77 PDF
Review Artikel
TEKNIK PEMBUATAN KULTUR SEL PRIMER, IMMORTAL CELL LINE
DAN STEM CELL
Leni Rahmawati, Irma M. Puspitasari
Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran
Jl. Raya Bandung-Sumedang km 21 Jatinangor 45363
Korespondensi: Leni Rahmawati, Irma M. Puspitasari | lenirahmawati96@gmail.com,
irma.melyani@unpad.ac.id
ABSTRAK
Dalam dunia medis, sel yang berasal dari jaringan atau organ tertentu dapat digunakan sebagai
sarana untuk penelitian ataupun diagnosis suatu penyakit, misalnya pada penyakit yang
disebabkan oleh infeksi virus atau bakteri. Sel primer, immortal cell line dan stem cell merupakan
jenis sel yang paling banyak digunakan. Teknik pembuatan sel-sel tersebut penting dipelajari
untuk memudahkan para peneliti lain melakukan penelitian mendalam secara in vitro mengenai
berbagai macam penyakit yang sulit diidentifikasi. Metode yang digunakan dalam artikel ini yaitu
dengan cara penelusuran pustaka dari berbagai jurnal melalui Pubmed Electronic Database dan
mesin pencari Google. Dari hasil penelusuran pustaka ini diperoleh beberapa cara pembuatan sel
yaitu pembuatan sel primer lambung, immortal cell keratinosit dan mesenchymal stem cell.
ABSTRACT
Cells derived from a particular tissue or organ can be used as a tool for research or diagnosis of
a disease, for example, the diseases caused by viral or bacterial infection. Primary cells,
immortal cells line and stem cells are the cell type that are most widely used. The technique of
making such cells is important to learn to facilitate other researchers conduct in-depth studies in
vitro on various diseases which are difficult to identify. The method used in this article is by
literature search of various journals through Pubmed Electronic Database and Google search
engine. Several procedures how to produce cell culture such as gastric primary cells,
keratinocytes immortal cells and mesenchymal stem cells were obtained.
Kultur sel merupakan suatu metode jaringan secara langsung dan dipilih secara
yang mengacu pada pengangkatan sel dari enzimatik, melalui suatu teknik yang berarti
hewan atau tumbuhan yang kemudian sebelum dibudidayakan, atau mungkin juga
dikultur dalam suatu lingkungan buatan yang diambil dari cell line atau cell stain yang
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 196
sudah disediakan [1]. Kultur sel sudah awal terjadinya kanker terebut pada sel
dilakukan sejak awal tahun 20-an dan epitel lambung yang sehat [7]. Untuk
sel hewan secara in vitro [2]. penyakit diperlukan pula sel yang tahan
Dalam dunia medis, sel yang berasal lama agar penelitian dengan durasi waktu
dari jaringan atau organ tertentu dapat yang lama tidak mengalami kendala karena
digunakan sebagai sarana untuk penelitian sel mengalami kematian atau kerusakan pada
ataupun diagnosis suatu penyakit, misalnya waktu tertentu, oleh karena itu dibuat pula
pada infeksi virus atau bakteri [2]. Penyakit immortal cell line.
yang disebabkan oleh paparan virus atau Selain beberapa hal di atas, baru-baru
bakteri dapat menyebabkan terjadinya ini lahir terapi baru dalam bidang jaringan
kanker, salah satu contohnya adalah kanker yang sering disebut dengan stem cell, terapi
lambung yang disebabkan oleh bakteri ini berkembang dengan cepat dalam
Helicobacter pylori [3,4]. Helicobacter bidangnya [8] Terapi stem cell telah terbukti
pylori merupakan bakteri gram negatif yang efektif secara klinis dan berpotensi
prevalensinya hampir 50% dari populasi menyebabkan hasil pengobatan yang kuat
dunia [5] dan merupakan satu-satunya untuk regenerasi jaringan [9,10]. Oleh
bakteri yang diklasifikasikan sebagai bakteri karena itu, pengetahuan mengenai cara
karsinogen tipe 1 oleh WHO [6]. Mekanisme membuat sel induk juga sangat dibutuhkan
yang menunjukkan bahwa H. pylori dapat untuk proses penelitian berbagai macam
dipahami, salah satu penyebabnya adalah Dalam artikel ini, telah dirangkum
kurangnya model hewan yang cocok sebagai bagaimana cara membuat kultur sel primer,
hewan uji [7]. Oleh karena itu, dibutuhkan immortal cell line dan stem cell.
sistem sel primer untuk dapat melihat fase Perkembangan ilmu pengetahuan dan
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 197
penelitian mengenai cara pembuatan sel Kriteria seleksi data (eksklusi dan inklusi)
memudahkan para peneliti lain untuk Dari beberapa jurnal yang telah
vitro mengenai berbagai macam penyakit berdasarkan pada kriteria inklusi dan
yang sulit diidentifikasi jika menggunakan eksklusi yang telah ditentukan. Kriteria
kultur sel biasa. Hal tersebut dapat inklusi yang digunakan ialah artikel-artikel
disebabkan oleh waktu hidup sel yang hanya yang di dalamnya memuat cara pembuatan
sebentar atau pun karena keterbatasan sel sel primer, immortal cel line dan stem cell.
yang akan digunakan. Oleh karena itu, untuk Sedangkan untuk kriteria eksklusi yaitu
lebih memudahkan penelusuran mengenai jurnal yang di terbitkan dibawah tahun 2005.
terhadap beberapa jurnal tentang cara 1. Metode Pembuatan Kultur Sel Primer
line dan stem cell dari sel hewan atau pun sel Untuk cara membuat sel primer,
Metode yang digunakan dalam review Pembuatan kultur sel primer lambung ini
artikel ini yaitu dengan cara penelusuran dilakukan dengan cara mengisolasi
pustaka dari berbagai jurnal melalui internet kelenjar lambung dari jaringan perut yang
pada mesin pencari Google dan Pubmed sehat, kemudian ditumbuhkan pada media
primary cell culture, stem cell and immortal berbagai factor pertumbuhan, regulator
Pembuatan sel primer lambung diawali calf serum (FCS, Biochrom) disimpan dalam
dengan pengambilan sampel dari kelenjar tabung dan dibiarkan mengendap selama 1
lambug manusia sehat yang berasal dari menit sebelum supernatan yang mengandung
digunakan mengikuti protokol yang telah dipindahkan ke tabung baru [7]. Setelah lima
diterbitkan oleh Clevers laboratory [11-13]. kali dicuci, kelenjar dihitung di bawah
Sampel dari kelenjar dicuci dengan Hank’s mikroskop dan disentrifugasi selama 5 menit
Buffer Saline Solution (HBSS) dingin dan (250 × g) untuk kemudian dicuci kembali
lemak serta jaringan ikat lainnya sudah sebanyak tiga kali dengan Dulbecco yang
dihilangkan. Sampel dipotong-potong sekitar telah dimodifikasi media Eagle/ F12 (ADF;
pengkelat (air suling dengan 5,6 mM fragmen lambung yang telah dicampur
NaCl; 1,6 mM KCl; 43,4 mM sukrosa; 54,9 pertumbuhan berkurang, bebas fenol merah;
mM EDTA) selama 30 menit dengan suhu pemanasan 24-well plate dari 300
ditempatkan dalam cawan petri dan diperas pada suhu 37oC dan dilapis dengan 500 µL
dengan lembut menggunakan slide kaca media ekspansi hangat (ADF, 50% kondisi
untuk mengisolasi kelenjar lambung [7]. media Wnt3A (seperti yang dijelaskan dalam
Kelenjar yang sudah diisolasi, disuspensi Willert et al [14], 25% kendisi media R-
dalam medium yang mengandung 10% fetal spondin1 yang disuplemen dengan 10 mM
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 199
N2, 20 ng/mL faktor pertumbuhan epidermal sama dengan Matrigel dilarutkan dalam
ng/mL noggin manusia, 150 ng / mL faktor tabung Falcon baru, dilakukan pipetting
pertumbuhan fibroblast manusia (FGF)-10, spheroids dengan kuat (8-10 kali) dengan
SB202190 (semua Sigma) dan 1 mM A83- menit pada suhu 4°C dengan kecepatan
01 (Calbiochem) [7]. 7,5 mM Y-27632 250×g dan pelet yang dihasilkan diinkubasi
(Sigma) ditambahkan selama 3 hari pertama dengan TrypLE Ekspres Enzim (5 menit; 37
[7]. Kultur disimpan pada suhu 37°C, 5% ° C; Invitrogen). TrypLE diinaktivasi dengan
CO2 dalam inkubator lembab [7]. penambahan ADF dan 10% FCS, sheared
dingin [7].
ditambahkan ke dalam media ekspansi dan buffer salin, dan disimpan selama satu
kultur yang disimpan selama 5 hari di bawah malam pada suhu 4°C dengan
kondisi ini sebelum analisis. Untuk paraformaldehid 3,7%, dicuci tiga kali
penyimpanan jangka panjang, spheroids dengan PBS pada suhu 4°C sampai label
sumur, PromoCell), perlahan beku turun Pada pembuatan kultur sel primer
pada -80 ° C dan ditransfer ke nitrogen cair. lambung ini dilakukan kultur tiga dimensi
Untuk pemulihan, spheroids yang dicairkan (3D) dan dua dimensi (3D) [7]. Dari proses
dengan cepat, dicuci dengan ADF, pellet dan tersebut pada kultur 3D menunjukkan ciri-
diresuspensi dalam Matrigel sebelum ciri morfologi yang khas dari jaringan perut
penyemaian seperti yang dijelaskan [7]. manusia [7]. Ketika spheroid ditransfer ke
Kultur Sel primer lambung dua dimensi dalam kultur 2D menyebabkan terjadinya
Spheroid dengan protokol yang sama pembentukan kultur planar yang padat [7].
penutup kaca berlapis kolagen [7]. Sebelum Gambar 2. Hasil transfer spheroid kultur
3D ke dalam kultur 2D
dilakukan uji mikroskoik sel dicuci dengan
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 201
2. Metode Pembuatan Immortal Cell Line epidermis kemudian disentrifugasi [16]. Sel
Pembuatan immortal cell line dapat
dihitung dan ditempakan pada media HiCa
dilakukan dengan pendekatan yang berbeda
dengan berat jenis sekitar 2x105 sel/cm2
beda, diantaranya adalah melalui proses
[16]. Delapanbelas jam kemudian media
telomerase reverse transcriptase (TERT),
dipindahkan, piringannya dicuci dengan
mutase sel cek poin (p53/pRb), dan onkogen
PBS, dan sel disimpan pada media LoCa
serta onkoprotein [15]. Pada penelitian
(0,05 mM kalsium) [16]. Pada waktu yang
Hammiller et al [16] Pembuatan sel
bersamaan disiapkan keratinosit dari tikus
immortal menggunakan sel epidermis atau
dengan genotip campuran, kulit abdominal
sel keratinosit yang dilakukan pada medium
ditandai dengan nomor identifikasi yang
tinggi kalsium (HiCa). Hica merupakan
permanen [16].
media yang terbuat dari Lonza Bio Whittaker
Imortalisasi Kultur Primer
Minimum Esensial Medium Eagle (EMEM),
Keratinosit disiapkan pada medium
dengan larutan garam yang seimbang, asam
HiCa dengan 6-well plates pada densitas
amino non-esensial, dan l-glutamin tanpa
satu tikus/piringan [16]. Sekitar 18 jam
kalsium klorida dan disuplemen denegan 8%
kemudian, medium dipindahkan, sel dibilas
fetal bovine serum, 0,8% Pen Strep dan 60
dengan PBS dan disimpan selama 2-3 hari
µM CaCl2 [16]. Pembuatan sel keratinosit
pada media LoCa yang mengandung
primer ini merupakan pembuatan sel
10ng/ml KGF [16]. Setelah sekitar satu
immortal melalui cara onkogen [17].
bulan, keratinosit yang sehat dalam piringan
Preparasi dan Kultur Sel Keratinosit
sesekali diamati dan dibagi menjadi koloni
Primer
yang kecil dan morfologinya menyerupai
Kulit tikus yang baru lahir disimpan
keratinosit primer [16]. Kemudian dibilas
dalam 0,25% tripsin/EDTA pada suhu 4oC
dengan PBS, diinkubasi selama beberapa
[16]. Epidermisnya diangkat menggunakan
menit dengan 0,25% tripsin-EDTA sampai
forceps, media Hica ditambahkan pada
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 202
setiap 2-3 hari sampai menjadi konfluen lagi, Gambar 3. Karakterisik morfologi sel
keratinosit primer hasil
dalam beberapa minggu [16]. Sel sel tersebut imortalisasi
kemudian diberi perlakuan sama sepeti yang 3. Metode Pembuatan Stem Cell
telah dijelaskan di atas, namun kultur dibagi Untuk cara membuat stem cell, Nadri
menjadi 1:2 [16]. Dilakukan subkultur dan et al [18] menggunakan tikus sebagai hewan
pengulangan kembali dalam beberapa hari uji dan sel yang dikulturnya adalah
[16]. Setelah beberapa hari, konsentrasi KGF Mesenchymal stem cells (MSCs).
dan kemudian ke 1 ng/ml [16]. Aliquot sel sel dari tikus yang berusia 6-8 minggu [18].
kemudian dibekukan dengan mengikuti Bagian tulang paha diambil dengan hati-hati,
protokol pembekuan standar dengan 10% kemudian jaringan lunak yang melekat
di P2-4[16]. Berikut hasil imortalisasi sel diangkat dengan rongeur dan sumsum tulang
keratinosit primer dari kulit tikus. diambil dengan menggunakan syringe dan
tulang kemudian disaring dengan saringan dan media kultur diubah setelah 72 jam
mesh nilon 70-mm [18]. Sel-sel disimpan untuk pertama kalinya [18].
sudah diangkat pada menit ke 2, dipanen dan Gambar 4. Kultur sel Sumsum tulang tikus
penelitian yang telah memberikan ilmu yang Forman D, Martel C. Global burden
penulis, memberikan saran serta perbaikan- 5. Parkin DM. The global health burden
terdapat potensi konflik kepentingan dengan 6. IARC. Schistosomes, liver flukes and
Gibco;2015: 1994;61:1–241.
regeneration. J Tissue Eng Regen 13. Stange DE, Koo BK, Huch M, Sibbel
9. Garbern JC, Lee RT. Cardiac stem Differentiated Troy+ chief cells act
cell therapy and the promise of heart as reserve stem cells to generate all
10. Ding G, Liu Y, Wang W, Wei F, Liu 14. Willert K, Brown JD, Danenberg E,
therapy for periodontitis in swine. and can act as stem cell growth
11. Barker N, Huch M, Kujala P, van de 15. Masqood MI, Matin MM, Bahramii
et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self- cell lines: challenges and advantages
12. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries AA, Hansen LA. A Methode for the