Farmaka

Suplemen Volume 14 Nomor 2 195

Review Artikel
TEKNIK PEMBUATAN KULTUR SEL PRIMER, IMMORTAL CELL LINE
DAN STEM CELL
Leni Rahmawati, Irma M. Puspitasari
Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran
Jl. Raya Bandung-Sumedang km 21 Jatinangor 45363
Korespondensi: Leni Rahmawati, Irma M. Puspitasari | lenirahmawati96@gmail.com,
irma.melyani@unpad.ac.id

ABSTRAK

Dalam dunia medis, sel yang berasal dari jaringan atau organ tertentu dapat digunakan sebagai
sarana untuk penelitian ataupun diagnosis suatu penyakit, misalnya pada penyakit yang
disebabkan oleh infeksi virus atau bakteri. Sel primer, immortal cell line dan stem cell merupakan
jenis sel yang paling banyak digunakan. Teknik pembuatan sel-sel tersebut penting dipelajari
untuk memudahkan para peneliti lain melakukan penelitian mendalam secara in vitro mengenai
berbagai macam penyakit yang sulit diidentifikasi. Metode yang digunakan dalam artikel ini yaitu
dengan cara penelusuran pustaka dari berbagai jurnal melalui Pubmed Electronic Database dan
mesin pencari Google. Dari hasil penelusuran pustaka ini diperoleh beberapa cara pembuatan sel
yaitu pembuatan sel primer lambung, immortal cell keratinosit dan mesenchymal stem cell.

Kata kunci: Sel Primer, Immortal Cell dan Stem Cell.

ABSTRACT

Cells derived from a particular tissue or organ can be used as a tool for research or diagnosis of
a disease, for example, the diseases caused by viral or bacterial infection. Primary cells,
immortal cells line and stem cells are the cell type that are most widely used. The technique of
making such cells is important to learn to facilitate other researchers conduct in-depth studies in
vitro on various diseases which are difficult to identify. The method used in this article is by
literature search of various journals through Pubmed Electronic Database and Google search
engine. Several procedures how to produce cell culture such as gastric primary cells,
keratinocytes immortal cells and mesenchymal stem cells were obtained.

Keyword: Primary cell, Immortal Cell and Stem Cell

PENDAHULUAN sesuai [1]. Sel tersebut dapat diangkat dari

Kultur sel merupakan suatu metode jaringan secara langsung dan dipilih secara

yang mengacu pada pengangkatan sel dari enzimatik, melalui suatu teknik yang berarti

hewan atau tumbuhan yang kemudian sebelum dibudidayakan, atau mungkin juga

dikultur dalam suatu lingkungan buatan yang diambil dari cell line atau cell stain yang
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 196

sudah disediakan [1]. Kultur sel sudah awal terjadinya kanker terebut pada sel

dilakukan sejak awal tahun 20-an dan epitel lambung yang sehat [7]. Untuk

digunakan sebagai sarana belajar mengenai memudahkan dalam penelitian berbagai

sel hewan secara in vitro [2]. penyakit diperlukan pula sel yang tahan

Dalam dunia medis, sel yang berasal lama agar penelitian dengan durasi waktu

dari jaringan atau organ tertentu dapat yang lama tidak mengalami kendala karena

digunakan sebagai sarana untuk penelitian sel mengalami kematian atau kerusakan pada

ataupun diagnosis suatu penyakit, misalnya waktu tertentu, oleh karena itu dibuat pula

pada infeksi virus atau bakteri [2]. Penyakit immortal cell line.

yang disebabkan oleh paparan virus atau Selain beberapa hal di atas, baru-baru

bakteri dapat menyebabkan terjadinya ini lahir terapi baru dalam bidang jaringan

kanker, salah satu contohnya adalah kanker yang sering disebut dengan stem cell, terapi

lambung yang disebabkan oleh bakteri ini berkembang dengan cepat dalam

Helicobacter pylori [3,4]. Helicobacter bidangnya [8] Terapi stem cell telah terbukti

pylori merupakan bakteri gram negatif yang efektif secara klinis dan berpotensi

prevalensinya hampir 50% dari populasi menyebabkan hasil pengobatan yang kuat

dunia [5] dan merupakan satu-satunya untuk regenerasi jaringan [9,10]. Oleh

bakteri yang diklasifikasikan sebagai bakteri karena itu, pengetahuan mengenai cara

karsinogen tipe 1 oleh WHO [6]. Mekanisme membuat sel induk juga sangat dibutuhkan

yang menunjukkan bahwa H. pylori dapat untuk proses penelitian berbagai macam

menginisiasi kanker lambung masih kurang penyakit.

dipahami, salah satu penyebabnya adalah Dalam artikel ini, telah dirangkum

kurangnya model hewan yang cocok sebagai bagaimana cara membuat kultur sel primer,

hewan uji [7]. Oleh karena itu, dibutuhkan immortal cell line dan stem cell.

sistem sel primer untuk dapat melihat fase Perkembangan ilmu pengetahuan dan
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 197

penelitian mengenai cara pembuatan sel Kriteria seleksi data (eksklusi dan inklusi)

memudahkan para peneliti lain untuk Dari beberapa jurnal yang telah

melakukan penelitian mendalam secara in diperoleh, dilakukan penyeleksian artikel

vitro mengenai berbagai macam penyakit berdasarkan pada kriteria inklusi dan

yang sulit diidentifikasi jika menggunakan eksklusi yang telah ditentukan. Kriteria

kultur sel biasa. Hal tersebut dapat inklusi yang digunakan ialah artikel-artikel

disebabkan oleh waktu hidup sel yang hanya yang di dalamnya memuat cara pembuatan

sebentar atau pun karena keterbatasan sel sel primer, immortal cel line dan stem cell.

yang akan digunakan. Oleh karena itu, untuk Sedangkan untuk kriteria eksklusi yaitu

lebih memudahkan penelusuran mengenai jurnal yang di terbitkan dibawah tahun 2005.

cara membuat sel maka dilakukan review HASIL DAN PEMBAHASAN

terhadap beberapa jurnal tentang cara 1. Metode Pembuatan Kultur Sel Primer

membuat kultur sel primer, immortal cell Isolasi Kelenjar Lambung

line dan stem cell dari sel hewan atau pun sel Untuk cara membuat sel primer,

manusia. Schlaermann et al.[7] menggunakan sel

METODE primer lambung sebagai contohnya[7].

Metode yang digunakan dalam review Pembuatan kultur sel primer lambung ini

artikel ini yaitu dengan cara penelusuran dilakukan dengan cara mengisolasi

pustaka dari berbagai jurnal melalui internet kelenjar lambung dari jaringan perut yang

pada mesin pencari Google dan Pubmed sehat, kemudian ditumbuhkan pada media

Electronic Database dengan kata kunci yang mengandung matrigel dengan

primary cell culture, stem cell and immortal berbagai factor pertumbuhan, regulator

cell line review. perkembangan dan inhibitor apoptosis

untuk menghasilkan sel epitel lambung

yang normal dan tahan lama [7].

Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 198

Pembuatan sel primer lambung diawali calf serum (FCS, Biochrom) disimpan dalam

dengan pengambilan sampel dari kelenjar tabung dan dibiarkan mengendap selama 1

lambug manusia sehat yang berasal dari menit sebelum supernatan yang mengandung

klinik umum[7]. Komposisi media yang sebagian besar kelenjar terisolasi

digunakan mengikuti protokol yang telah dipindahkan ke tabung baru [7]. Setelah lima

diterbitkan oleh Clevers laboratory [11-13]. kali dicuci, kelenjar dihitung di bawah

Sampel dari kelenjar dicuci dengan Hank’s mikroskop dan disentrifugasi selama 5 menit

Buffer Saline Solution (HBSS) dingin dan (250 × g) untuk kemudian dicuci kembali

lemak serta jaringan ikat lainnya sudah sebanyak tiga kali dengan Dulbecco yang

dihilangkan. Sampel dipotong-potong sekitar telah dimodifikasi media Eagle/ F12 (ADF;

5mm, kemudian dicuci dengan HBSS Infitrogen) [7].

sebanyak 8-10 kali sampai supernatannya Kultur Kelenjar Lambung

bersih dan diinkubasi dengan larutan Kelenjar lambung disolasi dan

pengkelat (air suling dengan 5,6 mM fragmen lambung yang telah dicampur

Na2HPO4; 8,0 mM KH2PO4’ 96,2 mM dengan ice-cold Matrigel (faktor

NaCl; 1,6 mM KCl; 43,4 mM sukrosa; 54,9 pertumbuhan berkurang, bebas fenol merah;

mM D-sorbitol; 0,5 mM DL dithiothreitol, 2 BD Biosciences) dan diunggulkan pada pra

mM EDTA) selama 30 menit dengan suhu pemanasan 24-well plate dari 300

37°C pada shaking platform [7]. Supernatan kelenjar/fragmen per 40 µL Matrigel/well

dipindahkan, fragmen jaringannya [7]. Matrigel dipolimerisasi selama 15 menit

ditempatkan dalam cawan petri dan diperas pada suhu 37oC dan dilapis dengan 500 µL

dengan lembut menggunakan slide kaca media ekspansi hangat (ADF, 50% kondisi

untuk mengisolasi kelenjar lambung [7]. media Wnt3A (seperti yang dijelaskan dalam

Kelenjar yang sudah diisolasi, disuspensi Willert et al [14], 25% kendisi media R-

dalam medium yang mengandung 10% fetal spondin1 yang disuplemen dengan 10 mM
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 199

4- (2-hidroksietil) -1-asam piperazine pada rasio 1: 8. Untuk passaging, media

ethanesulfonic, 1% Glutamax, 2% B27, 1% kultur dipindahkan dan spheroids bersama-

N2, 20 ng/mL faktor pertumbuhan epidermal sama dengan Matrigel dilarutkan dalam

manusia (EGF) (semua Invitrogen), 150 ADF dingin. Setelah ditransfer ke 15 mL

ng/mL noggin manusia, 150 ng / mL faktor tabung Falcon baru, dilakukan pipetting

pertumbuhan fibroblast manusia (FGF)-10, spheroids dengan kuat (8-10 kali) dengan

1,25 mM N-asetil-L-sistein, 10 mM menggunakan pipet Pasteur [7]. Selanjutnya,

nicotinamide, 10 nM gastrin manusia, 2 mM sheared spheroids disentrifugasi selama 5

SB202190 (semua Sigma) dan 1 mM A83- menit pada suhu 4°C dengan kecepatan

01 (Calbiochem) [7]. 7,5 mM Y-27632 250×g dan pelet yang dihasilkan diinkubasi

(Sigma) ditambahkan selama 3 hari pertama dengan TrypLE Ekspres Enzim (5 menit; 37

[7]. Kultur disimpan pada suhu 37°C, 5% ° C; Invitrogen). TrypLE diinaktivasi dengan

CO2 dalam inkubator lembab [7]. penambahan ADF dan 10% FCS, sheared

spheroids dipelet kemudian dicuci dalam

ADF dan disentrifugasi [7]. Supernatan

dibuang, pelet disuspensikan dalam Matrigel

dingin [7].

Untuk diferensiasi spheroids menjadi

gastroids, sel ditumbuhkan dalam medium

ekspansi selama 5 hari. Diferensiasi

diinduksi oleh kultur dalam media ekspansi

Gambar 1. Pembuatan kultur spheroid
lambung manusia Wnt3A-bebas dan RSPO-bebas (media

Pemeliharaan dan diferensiasi spheroids diferensiasi) untuk 5 hari [7]. Untuk

Medium kultur ditukar setiap 2-4 hari diferensiasi dengan menghambat Notch
dan spheroids passaged setiap 10-21 hari signaling, 1 mM DBZ (Calbiochem)
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 200

ditambahkan ke dalam media ekspansi dan buffer salin, dan disimpan selama satu

kultur yang disimpan selama 5 hari di bawah malam pada suhu 4°C dengan

kondisi ini sebelum analisis. Untuk paraformaldehid 3,7%, dicuci tiga kali

penyimpanan jangka panjang, spheroids dengan PBS pada suhu 4°C sampai label

dipanen di CryoSFM dingin (1 mL per berfluoresensi [7].

sumur, PromoCell), perlahan beku turun Pada pembuatan kultur sel primer

pada -80 ° C dan ditransfer ke nitrogen cair. lambung ini dilakukan kultur tiga dimensi

Untuk pemulihan, spheroids yang dicairkan (3D) dan dua dimensi (3D) [7]. Dari proses

dengan cepat, dicuci dengan ADF, pellet dan tersebut pada kultur 3D menunjukkan ciri-

diresuspensi dalam Matrigel sebelum ciri morfologi yang khas dari jaringan perut

penyemaian seperti yang dijelaskan [7]. manusia [7]. Ketika spheroid ditransfer ke

Kultur Sel primer lambung dua dimensi dalam kultur 2D menyebabkan terjadinya

Spheroid dengan protokol yang sama pembentukan kultur planar yang padat [7].

seperti yang telah dijelaskan di atas

digunakan untuk passaging, ditempatkan

dalam media dua dimensi (ADF, 10% FCS,

2% B27, 1% N2, 10 mM nicotinamide, 50

ng/mL human EGF, 7,5 mM Y-27632 and 1

mM A83-01) dan diunggulkan dengan

dilapisi kolagen[7]. Kultur disimpan pada

suhu 37°C, CO2 5% dalam inkubator

lembab [7]. Untuk mikroskopik, sel yang

telah diunggulkan dislip menggunakan

penutup kaca berlapis kolagen [7]. Sebelum Gambar 2. Hasil transfer spheroid kultur
3D ke dalam kultur 2D
dilakukan uji mikroskoik sel dicuci dengan
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 201

2. Metode Pembuatan Immortal Cell Line epidermis kemudian disentrifugasi [16]. Sel
Pembuatan immortal cell line dapat
dihitung dan ditempakan pada media HiCa
dilakukan dengan pendekatan yang berbeda
dengan berat jenis sekitar 2x105 sel/cm2
beda, diantaranya adalah melalui proses
[16]. Delapanbelas jam kemudian media
telomerase reverse transcriptase (TERT),
dipindahkan, piringannya dicuci dengan
mutase sel cek poin (p53/pRb), dan onkogen
PBS, dan sel disimpan pada media LoCa
serta onkoprotein [15]. Pada penelitian
(0,05 mM kalsium) [16]. Pada waktu yang
Hammiller et al [16] Pembuatan sel
bersamaan disiapkan keratinosit dari tikus
immortal menggunakan sel epidermis atau
dengan genotip campuran, kulit abdominal
sel keratinosit yang dilakukan pada medium
ditandai dengan nomor identifikasi yang
tinggi kalsium (HiCa). Hica merupakan
permanen [16].
media yang terbuat dari Lonza Bio Whittaker
Imortalisasi Kultur Primer
Minimum Esensial Medium Eagle (EMEM),
Keratinosit disiapkan pada medium
dengan larutan garam yang seimbang, asam
HiCa dengan 6-well plates pada densitas
amino non-esensial, dan l-glutamin tanpa
satu tikus/piringan [16]. Sekitar 18 jam
kalsium klorida dan disuplemen denegan 8%
kemudian, medium dipindahkan, sel dibilas
fetal bovine serum, 0,8% Pen Strep dan 60
dengan PBS dan disimpan selama 2-3 hari
µM CaCl2 [16]. Pembuatan sel keratinosit
pada media LoCa yang mengandung
primer ini merupakan pembuatan sel
10ng/ml KGF [16]. Setelah sekitar satu
immortal melalui cara onkogen [17].
bulan, keratinosit yang sehat dalam piringan
Preparasi dan Kultur Sel Keratinosit
sesekali diamati dan dibagi menjadi koloni
Primer
yang kecil dan morfologinya menyerupai
Kulit tikus yang baru lahir disimpan
keratinosit primer [16]. Kemudian dibilas
dalam 0,25% tripsin/EDTA pada suhu 4oC
dengan PBS, diinkubasi selama beberapa
[16]. Epidermisnya diangkat menggunakan
menit dengan 0,25% tripsin-EDTA sampai
forceps, media Hica ditambahkan pada
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 202

sel terpisah dari piringan, disentrifugasi

selama 3 - 5 menit pada 800 rpm (0,2 G),

supernatan dibuang, pelet sel disuspensi

dalam media HiCa dengan KGF, dan sel-sel

berlapis di piringan tanpa memperluas kutur

[16]. Delapan belas jam setelah replating,

kultur dicuci dengan PBS dan diberi nutrisi

dengan medium Loca 10ng / ml KGF [16].

Kultur diberi nutrisi dengan media tersebut

setiap 2-3 hari sampai menjadi konfluen lagi, Gambar 3. Karakterisik morfologi sel
keratinosit primer hasil
dalam beberapa minggu [16]. Sel sel tersebut imortalisasi

kemudian diberi perlakuan sama sepeti yang 3. Metode Pembuatan Stem Cell

telah dijelaskan di atas, namun kultur dibagi Untuk cara membuat stem cell, Nadri

menjadi 1:2 [16]. Dilakukan subkultur dan et al [18] menggunakan tikus sebagai hewan

pengulangan kembali dalam beberapa hari uji dan sel yang dikulturnya adalah

[16]. Setelah beberapa hari, konsentrasi KGF Mesenchymal stem cells (MSCs).

dalam medium dikurangi menjadi 5ng/ml Pembuatannya diawali dengan mengisolasi

dan kemudian ke 1 ng/ml [16]. Aliquot sel sel dari tikus yang berusia 6-8 minggu [18].

kemudian dibekukan dengan mengikuti Bagian tulang paha diambil dengan hati-hati,

protokol pembekuan standar dengan 10% kemudian jaringan lunak yang melekat

dimetilsulfoksida (DMSO) pada media LoCa dibersihkan [18]. Masing-masing tulang

di P2-4[16]. Berikut hasil imortalisasi sel diangkat dengan rongeur dan sumsum tulang

keratinosit primer dari kulit tikus. diambil dengan menggunakan syringe dan

dibilas dengan Dulbecco Modified Eagle

Medium (DMEM) [18]. Sel-sel sumsum

Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 203

tulang kemudian disaring dengan saringan dan media kultur diubah setelah 72 jam

mesh nilon 70-mm [18]. Sel-sel disimpan untuk pertama kalinya [18].

pada 6-well plate kultur sel dengan densitas

25 x 106 sel/well dalam DMEM yang

mengandung 15% fetal bovine serum, 2 mm

L-glutamine, 100 u/ml penisilin dan 100

u/ml streptomisin[18]. Kultur disimpan pada

suhu 37 ºC dalam suasana lembab dengan

kandungan CO2 5% [18]. Saat Kultur primer

mendekati konfluen, kultur dibuat dalam 0,5

ml dari 0,025% [18]. Tripsin yang

mengandung 0,02% EDTA disimpan selama

2 menit pada suhu kamar[18]. Sel-sel yang

sudah diangkat pada menit ke 2, dipanen dan Gambar 4. Kultur sel Sumsum tulang tikus

dikultur dalam labu berukuran 25cm2[18]. SIMPULAN

Berdasarkan hasil penelusuran pustaka
Setelah kultur mencapai 70-80% konfluen,
yang telah dilakukan dapat diketahui cara
sel-sel dipanen untuk dilakukan eksperimen
pembuatan kultur sel primer, immortal cell
lebih lanjut [18].
line dan stem cell dari sel hewan ataupun sel
Beberapa sel sumsum tulang yang
manusia dengan menggunakan media yang
dikultur tanpa perlakuan dijadikan sebagai
sama yaitu Modified Eagle Medium (MEM)
kontrol yang sering disebut sebagai sel
dan menggunakan prosedur yang berbeda.
WFMC [18]. Sebagai kultur sel kontrol,
UCAPAN TERIMAKASIH
WFMCs dikultur dalam 6-well plate dengan
Puji syukur kami panjatkan kepada
densitas 25 sel x106 per well dalam DMEM
Allah SWT karena berkat rahmat dan
Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 204

karunia-Nya review artikel ini dapat 3. Correa P. Bacterial infections as a

diselesaikan dengan baik. Terimakasih cause of cancer. J Natl Cancer Inst.

kepada kedua orang tua yang selalu 2003;95:E3.

mendoakan, dosen mata kuliah metodologi 4. Plummer M, Franceschi S, Vignat J,

penelitian yang telah memberikan ilmu yang Forman D, Martel C. Global burden

begitu bermanfaat, dan kepada Ibu Irma of gastric cancer attributable to

Melyani Puspitasari selaku dosen Helicobacter pylori. Int J Cancer.

pembimbing yang senantiasa membimbing 2015;136:487–90.

penulis, memberikan saran serta perbaikan- 5. Parkin DM. The global health burden

perbaikan dalam penulisan review artikel ini. of infection-associated cancers in the

KONFLIK KEPENTINGAN year 2002. Int J Cancer.

Seluruh penulis menyatakan tidak 2006;118:3030–44.

terdapat potensi konflik kepentingan dengan 6. IARC. Schistosomes, liver flukes and

penelitian, kepenulisan (authorship), dan Helicobacter pylori. IARC Working

atau publikasi artikel ini. Group on the Evaluation of

DAFTAR PUSTAKA Carcinogenic Risks to Humans.

1. Thermo Fisher Scientific: Cell Lyon, 7–14 June 1994. IARC

Culture Basics Handbook. UK: Monogr Eval Carcinog Risks Hum.

Gibco;2015: 1994;61:1–241.

www.lifetechnologies.com/cellcultur 7. Schlaermann P, Toelle B, Berger H,

ebasics Schmidt SC, Glanemann M,

2. Thorpe TA. History of Plant Tissue Ordemann J, et al. A novel human

Culture. Molecular Biotechnology. gastric primary cell culture system

2007;37(2):169-80. for modelling Helicobacter pylori

Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 205

infection in vitro. Gut. 2016;65:202– al. Long-term expansion of epithelial

213 organoids from human colon,

8. Iwata T, Washio K, Yoshida T, adenoma, adenocarcinoma, and

Ishikawa I, Ando T, Yamato M, et al. Barrett’s epithelium.

Cell sheet engineering and its Gastroenterology. 2011;141:1762–

application for periodontal 72.

regeneration. J Tissue Eng Regen 13. Stange DE, Koo BK, Huch M, Sibbel

Med. 2015;9(4):343–356. G, Lyubimova A, Kujala P, et al.

9. Garbern JC, Lee RT. Cardiac stem Differentiated Troy+ chief cells act

cell therapy and the promise of heart as reserve stem cells to generate all

regeneration. Cell Stem Cell. lineages of the stomach epithelium.

2013;12(6):689–698. Cell. 2013;155:357–68.

10. Ding G, Liu Y, Wang W, Wei F, Liu 14. Willert K, Brown JD, Danenberg E,

D, Fan Z, et al. Allogeneic Duncan AW, Weissman IL, Reya T,

periodontal ligament stem cell et al. Wnt proteins are lipid-modified

therapy for periodontitis in swine. and can act as stem cell growth

Stem Cells. 2010;28(10):1829–1838. factors. Nature. 2003;423:448–52

11. Barker N, Huch M, Kujala P, van de 15. Masqood MI, Matin MM, Bahramii

Wetering M, Snippert HJ, van Es JH, AR, Ghasroldasht M. Immortality of

et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self- cell lines: challenges and advantages

renewal in the stomach and build of establishment. Cell Biology

long-lived gastric units in vitro. Cell International. 2013.

Stem Cell 2010;6:25–36. 16. Hammiler BO, El-Baseri TG, Dulgoz

12. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries AA, Hansen LA. A Methode for the

RG, Van Es JH, Van den Brink S, et Immortalization of Newborn Mouse

Farmaka
Suplemen Volume 14 Nomor 2 206

Skin Keratinocytes. Front Oncol. 18. Nadri S, Soleimani M, Hosseni RH,

2015;5:177. Massumi M, Atashi A and Izadpanah

17. Balmain A, Yuspa SH. Milestones in R. An efficient method for isolation

skin carcinogenesis: the biology of of murine bone marrow

multi stage carcinogenesis. J Invest mesenchymal stem cells. Int. J. Dev.

Dermatol. 2014;134(e1):E2–7. Biol. 2007;51: 723-729.