BAB III

METODELOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Judul dari penelitian ini adalah “Sintesis Turunan Antibiotik Golongan
Sulfonamida dari Eugenol pada Limbah Daun Cengkeh (Syzygium aromaticum
L.) Melalui Pendekatan Amino Metil Eugenol dan Asam Klorosulfonat” bersifat
eksploratif bertujuan untuk mensintesis antibiotik analog sulfonamida dari senyawa
bioaktif limbah daun cengkeh.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan April 2021 sampai Oktober
2021 di Laboratorium Kimia Dasar Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam Universitas Mataram dan Laboratorium Kimia Analitik Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mataram

3.3 Persiapan Penelitian

3.3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu botol sampel, blender,
gelas kimia 25 mL, corong pisah 250 mL, penangas es, labu alas bulat, pengaduk
magnetic, kondensor, evaporator, KLT, GC-MS, HRMS, FT-IR, UV, dan NMR.

3.3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu daun cengkeh
(Syzygium aromaticum L.), DCM, NaOH pellet, Aquades, HCl pekat, petrolium
ether, Na2SO4 anhidrous, dimethyl sulfate, diethyl ether,asam asetta, HNO3 65%,
H2SO4, ethanol, serbuk Sn, NH3 pekat, dichloromethane, pyridin, asam
chlorosulfonat, kertas saring Whatman, pH stick, krtas label, aluminium foil,
tissue.

3.4.1 Metode Preparasi Sampel

Sampel daun cengkeh (Syzygium Aromaticum L.) kering dibersihkan,
kemudian dikering anginkan. Selanjutnya sampel di haluskan sehingga diperoleh
serbuk daun cengkeh dan diukur kadar airnya.
3.4.2 Ekstraki Sampel
1000 gram daun cengkeh kering yang telah dihaluskan dengan blender
ditempatkan pada gelas piala (2000 mL) dan tambahkan DCM (1000 mL) sambil
terus digojog dengan pengojog automatik selama 2 jam, kemudian disaring atau
didekantasi. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan rotary epavorator sehingga
akan diperoleh minyak cengkeh. Minyak dianalisis dengan khromatograpy lapis
tipis (KLT) dan GC-MS.

3.4.3 Isolasi Eugenol Dari Daun Cengkeh (Syzygium aromaticum L.)

Ada berbagai cara untuk mengisolasi eugenol dari minyak cengkeh
antara lain: Ke dalam gelas kimia 500 mL yang telah dilengkapi pengaduk magnet
dimasukan 100 g minyak cengkeh, 40 g NaOH pellet (1 mol) dan 300 mL aquades
kemudian diaduk sampai terbentuk dua lapisan. Campuran kemudian dimasukan
kedalam corong pisah ukuran 250 mL dan didiamkan sampai kedua lapisan
terlihat dengan jelas. Lapisan bawah yang merupakan garam eugenolat dipisahkan
dari lapisan atas yang merupakan komponen-komponen penyusun minyak
cengkeh yang lain. Lapisan eugenolat kemudian dimasukan kedalam gelas kimia
ukuran 500 mL dan diasamkan dengan menambahkan HCl pekat sampai pH = 3.
Campuran ini dimasukan kedalam corong pisah ukuran 250 mL kemudian
didiamkan sampai kedua lapisan terlihat. Lapisan bawah kemudian dipisahkan
dari lapisan atas (A) dengan mengeluarkannya dari dalam corong pisah. Lapisan
bawah hasil pemisahan kemudian dimasukan kedalam corong pisah ukuran 250
mL selanjutnya diekstraksi dengan 150 mL petrolium ether sebanyak tiga kali.
Lapisan bawah hasil ekstraksi kemudian dikeluarkan dan dibuang. Selanjutnya
lapisan atas (B) yang masih ada di dalam corong pisah kemudian digabungkan
dengan lapisan atas (A) yang pertama dengan campuran tetap berada di dalam
corong pisah. Campuran kemudian dicuci dengan air sampai pH air netral. Setelah
campuran netral, maka lapisan bagian atas (eugenol kotor) tersebut dimasukan
kedalam gelas kimia ukuran 100 mL dan ditambahkan Na2SO4 anhidrous untuk
mengikat air yang masih berada di dalamnya selanjutnya dibiarkan selama
beberapa menit. Eugenol kotor kemudian disaring dan dilakukan penguapan
pelarut yang masih tersisa di dalam oven pemanas. Destilasi pengurangan tekanan
kemudian dilakukan untuk memperoleh eugenol murni. Hasil yang diperoleh
kemudian diuji kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis dan GC-MS.
Eugenol kotor dipisahkan dengan kromatografi kolom yang diisi dengan silika
gel. Kolom dipacking dengn pelarut heksan dan dielusi dengan pelarut non polar
(heksan, petroleum ether) dilajutkan dengan eluent semi polar (DCM, ether,
acetonitrile) dan terakhir dengan eluent polar seperti methanol, ethanol. Hasil
fraksinasi ini dinalisis dengan klt dengan standar eugenol. Eugenol murni hasil
isolasi dianalisis secara spekroskopi meliputi GC-MS, HR-MS, FT-IR, UV, 1H
NMR dan 13C NMR.

3.4.4 Metilasi Eugenol

Eugenol (2 g, 12.18 mmol) dimasukkan kedalam labu alas bulat (50 mL)
yang dilengkapi dengan kondensor dan pengaduk magnetik. NaOH (0.7 g, 175
mmol) dalam 5 mL aquades ditambahkan setetes demi setetes. Dimethyl sulfate
1.6 mL (100 mmol) ditambahkan selama 30 menit sambil diaduk dan direfluks
selama 1 jam. Campuran ditambahkan aquades (5 mL) dan diekstrak dengan
diethyl ether (5 mL x 3). Di ethyl ether diuapkan dengan rotary evaporator
diperoleh produk dan dianalisis secara spekroskopi yang meliputi GC-MS, HR-
MS, FT-IR, UV, 1H NMR dan 13
C NMR. Metode sintesis yang lain juga akan
dicoba dengan menggunakan methyl iodida (CH3I), acetyl chlorida,
formaldehyde, acetaldehyde, benzaldehyde, diazomethane dengan berbagai
pelarut sebagai media reaksi seperti tetrahydrofuran, acetonitrile sampai diperoleh
senyawa Methyl eugenol dengan persentase tinggi (80 – 100%)

3.4.5 Nitrasi Metil Eugenol

Methyl eugenol (1 g), asam asetat (4 mL) dimasukkan dalam gelas kimia (25 mL)
diletakan dalam penangas es sambil diaduk dengan pengaduk magnetik.
Campuran yang terdiri dari 0.5ml 65% HNO3 dan 0.5ml H2SO4 ditambahkan tetes
demi tetes sampai terbentuk padatan warna kuning. Campuran diaduk terus
selama 45 menit dan dituangkan ke dalam aquades dingin (30 mL). Padatan
disaring dan dicuci dengan ethanol (2 × 5 mL). Residunya direkristalisasi dengan
pelarut ethanol. Hasil yang diperoleh diuji dengan KLT, GC-MS, HRMS, UV,
FT-IR dan NMR. Berbagai metode nitratasi akan diteliti dengan menggunakan
NH4NO3 dan KHSO4, NaNO3 dan KHSO4 sampai diperoleh senyawa Nitro
methyl eugenol sekitar 80 -90%.

3.4.6 Reduksi Nitro Metil Eugenol

Nitro methyl eugenol (500 mg) dilarutkan dengan campuran ethanol (10 mL) dan
asam khlorida pekat (10 mL) dan larutan direfluks dengan serbuk tin (Sn) (1g)
selama 2 jam. Ditambahkan lagi serbuk tin (1 g) dan HCl pekat (5 mL) dan
direfluk lagi selama 2 jam. Ethanolnya diuapkan dan liquor asamnya didinginkan
serta ditambahkan air (25 mL). Larutan dibasifikasi dengan ammoniak pekat
sampai terjadi endapan putih. Larutan disaring dan diekstrak dengan
dichloromethane (2 x 50 mL). Dichloromethane diuapkan dengan rotary
evaporator diperoleh produk dan dianalisis dengan GC-MS, Fourier Transform
Infrared (FTIR), dan NMR.

3.4.6 Sintesis Molekul Sulfonamida

Larutkan amino-methyleugenol (500 mg) dalam pyridin (20 mL) dan diaduk
selama 5 menit. Tambahkan asam chlorosulfonat (2 ml) tetes demi tetes dan
larutan diaduk dengan pengaduk magnetik selama 30 menit dan selanjutnya
direfluks 15 menit. Kemudian diuapkan dengan rotary evaporator dan ditambah
10 ml air, dibasakan sampai PH 8 dengan 1 M NaOH dan diekstraksi dengan
dichloromethana. Fase organik selanjutnya dikeringkan dengan sodium carbonat
unhydrous, kemudian disaring dan diuapkan dengan rotary evaporator. Hasil
yang diperoleh diuji dengan KLT, GC-MS, HRMS, FT-IR, UV, dan NMR.