ELEKTROFORESIS PADA GEL AGAROSE

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

Jumat, 28 Oktober 2014

Kelompok 3

Eka setiadi 4411412003

Rohmawati 4411412006
Litayani Dafrosa Sihaloho 4411412016
Laily Milatus 4411412034

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2014
I. TUJUAN
Untuk melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa menggunakan sampel isolasi DNA
menggunakan metode Dixit, PCI, dan metode KIT.

II. LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas
ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain
agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari
beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di
dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode).Makin
besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-
fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA
selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di
dalam larutan etidium bromid.
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip
dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh
gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran
molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan.
Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau
oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan
konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang
(cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda.
Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel
yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada
gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-
molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik
sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda
positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya.
Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran
(yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga
agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen
(misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan
bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul
sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru
Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel
berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel
difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif,
autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses
pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang
berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang
bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya
berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker)
yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk
menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut
pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat
dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel
berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose atau gel
poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis. Untuk dapat
divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium bromida
kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik,
DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan kecepatannya
tergantung dari :
a. Ukuran molekul DNA
b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga
muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan

III. PERMASALAHAN
a.Bagaimana mahasiswa mampu menjelaskan prinsip kerja elektroforesis gel agarose ?
b.Bagaimana mahasiswa mampu membedakan antara DNA dan RNA pada proses
elektroforesis.?

IV. ALAT DAN BAHAN

1. horizontal agarose gel electophoresis apparatus

2. sisir pembentuk sumur
3. power supply
4. microwave
5. UV transiluminator
6. Mikropipet ukuran 1-10 µl atau 2-20µl
7. Tip pipet kuning dan putih
8. Alat timbang
9. Parafilm
10. 1X buffer TAE
11. Ethidium bromide (EtBr)
12. Agarose
13. Loding dye
V. METODE

Elektroforesis horizontal menggunakan gel

agarose. Cara kerja

1.pembentukan gel agarose.
1.1 tentukan konsentrasi gel agarose yang diginginkan, misal konsentrasi 0,8% maka
banyaknya agarose yang kita timbang adalah sebanyak 0,4 gr.
1.2 Timbang agarose sesuai dengan kebutuhan, larutkan dalam 1X buffer TAE
( dalam labu erlenmeyer 50 ml), dan panaskan dalam microwave kurang lebih 1-2
menit, sampai mendidih dan larutan menjadi jernih
1.3 Larutan agarose didinginkan sampai kira-kira 60◦C dan tambahkan 5 µl EtBr,
campur sampai rata
1.4 Larutan dituang kedalam try dan pasang sisir pembentuk sumur, biarkan sampai
gel mengeras kurang lebih 30 menit.
1.5 Lepaskan sisir pelan-pelan, gel agarose siap digunakan.
2. proses elektroforesis.
2.1 letakkan try yang berisi gel agarose kedalam alat elektroforesis, tuangkan 1X
buffer TEA kedalam alat sampai gel agarose terendam
2.2 ambil sampel DNA menggunakan mikropipet kira-kira 4µl, letakkan / teteskan
pada parafilm dan tambahkan loding dye 1 µl, diaduk
2.3 ambil larutan DNA dengan mikropipet dan masukkan kedalam sumur gel agarose
2.4 setelah semua sampel DNA masuk dalam sumur, alat elektroforesis ditutup,
hubungkan dengan power suplly tegangan listrik yang digunakan biasanya 80-
100 volt. Proses elektroforesis siap dijalankan, lama elektroforesis tergantung
konsentrasi agarose dan ukuran DNA.
2.5 Setelah proses selesai, matikan arus listrik dan ambil try dengan menggunakan
sarung tangan, taruh diatas UV transiluminator untuk diamati didalam Geldoc atau
bisa didekomentasikan dengan fotopolaroid.

VI. PEMBAHASAN
Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti
NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan
polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan
senyawa polifenol dalam sel tumbuhan.2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol
dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang
kemudian akan terpisah dengan DNA Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh
kualitas DNA yang baik. Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase
pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi
DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA.. Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan
pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang mengkontaminasi.
Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5
sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan
mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH
larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi
larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan
purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah
aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk
mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan
penambahan inhibitor DNAase dan detergen.
Berdasarkan hasil percobaan isolasi DNA dengan menggunakan metode DIXIT, PCI,
dan metode KIT yang dilakukan untuk tujuan pemisahan molekul DNA menggunakan teknik
elektroforesis gel agarose.
Elektroforesis gel agarose adalah teknik pemisahan DNA dengan memanfaatkan
perbedaan laju pergerakannya di dalam medan listrik dengan menggunakan gel agarose
sebagai medium penyangga. Agarose merupakan suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan
polimer netral dan sedikit mengandung sulfat. Agarose dikenal sebagai fraksi pembentuk gel
dari agar-agar, dimana sifat-sifat gel yang dihasilkanya mendekati sifat-sifat gel yang ideal
untuk keperluan bidang bioteknologi. Agarose diekstrak dari rumput laut yang merupakan
polimer yang komponen monomer utamnya adalah D-galaktosa dan 3,6-anhidro-L-galaktosa.
Keuntungan menggunakan gel agarose adalah mempunyai kapasitas yang besar, mampu
memisahkan fragmen DNA dengan panjang antara 50 pb sampai 50.000 pb, mudah, cepat
dalam pembuatatannya, dan fragmen DNA yang diperoleh dari hasil pemisahannya dapat
diperoleh kembali untuk tujuan tertentu dalam keadaan tidak rusak .
Agarose murni terbentuk bubuk dan tidak larut dalam air (maupun Buffer) pada suhu
kamar namun larut pada air mendidih oleh karena itu untuk memurnikan gel agarose
digunakan microwave untuk melarutkan agarose dalam Buffer seperti yang dilakukan dalam
praktikum elektroforesis kali ini. Agarose mengalami polimerase. Polimer gula berikatan
silang satu sama lain dan menyebabkan perubahan dari larutan gel menjadi larutan dalam air
mendidih semakin padat gel yang akan terbentuk. Larutan tersebut harus ditunggu sampai
cukup hangat sebelum dimasukkan kedalam casting try. Elektroforesis merupakan proses
penyaringan, semakin besar fragmen DNA semakin mudah terjerat dalam matriks dan
migrasinya menjadi lambat sedangkan fragmen yang kecil akan semakin sulit terjerat dan
akan bergerak lebih cepat pada laju proporsional sesuai dengan ukurannya.
Dari hasil praktikum adanya DNA yang menunjukkan adanya pergerakan DNA
karena pada saat arus listrik diaplikasikan pada gel molekul yang bermuatan negatif akan
menuju elektroda positif dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda yang
bermuatan negatif, jadi ia bergerak menuju ke muatan positif. Yang perlu diperhatikan adalah
pemberian arus listrik pada gel agarose tidak bisa sembarangan karena jika terlalu besar,
dapat mengakibatkan panas yang akan mengubah bentuk pita DNA.
Berdasarkan hasil pengamatan hasil DNA pada Gel Doc. Tampak bahwa pada sumur gel
elektroforesis masih terdapat komponen RNA, tidak DNA saja yang teramati, hal ini dapat
diakibatkan karena kurangnya ketelitian saat memasukkan sampel kedalam sumur, dan
hasilnya juga tergantung dengan keberadaan DNA sendiri semakin besar molekul DNA maka
akan semakin lambat pergerakannya sehingga pada saat pembacaan hasil elektroforesis DNA
yang muatannya kecil lebih jelas dibandingkan dengan DNA yang bermuatan besar, hasil
elektroforesi juga tergantung pada tegangan listtrik yang digunakan semakin besar kuat arus
maka kecepatan running pada DNA akan semakin cepat, selain itu proses elektroforesi juga
tergantung pada keberadaan buffer yang digunakan, semakin tinggi konsenterasi buffer maka
akan menghambat proses motilitas DNA dan konsentrasi gel agarose juga berpengaruh
terhadap hasil elektroforesis karena semakin tinggi konsentrasi gel agarose maka pori-pori
gel yang terbentuk akan semakin kecil sehinnga sulit untuk ditembus DNA hal ini dapat
berpengaruh pada motilitas DNA. Berdasarkan hasil elektroforesi yang dilakukan oleh
kelompok kami diperoleh hasil yang kurang maksimal.

VII. KESIMPULAN

Dari hasil elektroforesis diatas dapat disimpulkan

1. Agarose tidak dapat larut dalam suhu kamar, tetapi dapat larut dalam air mendidih, Untuk
memperhatikan penggunaan EtBr dengan baik agar tidak merusak DNA karena
molekulnya berenergi tinggi dan bersifat karsinogenik . Dapat diketahui arah pergerakan
DNA, ukurannya dan kecepatanya menggunakan poses Elekroforesis gel agarose .
2. Setiap proses elektroforesis yang baik, maka akan diketahui keberadaan DNA dan tingkat
kemurniannya. Hasil akhir akan terlihat pada DNA pada gel agarose setelah elektroforesis.

DAFTAR PUSTAKA

Mustikaningtyas. 2014. Buku Ajar PraktikumBiologiMolekuler. Semarang: FMIPA UNNES

Saputra, Eka.2013. Laporan Praktikum Bioteknologi Transformasi Gen Ke Dalam E.coli dan
Isolat Plasmid Rekombinan. Haluoleo:FMIPA
Sitepu, Novina Jenny dan Lizza Mutia. 2012. Isolasi DNA manusia (epitelium mulut dan
Darah ).
Wibowo, Marlia Singgih.2014.Elektroforesis.School Of Pharmasy ITB . Bandung.