Bab 2

Dasar Teoritis Lapisan Tipis Kromatografi (KLT)

2.1 Kromatografi Planar dan Kolom

Dalam kromatografi kolom jumlah sampel yang ditentukan disuntikkan ke dalam aliran fase
gerak. Campuran sampel dan fase seluler kemudian dimigrasikan melalui kolom. Jika kondisi
pemisahan diatur sedemikian rupa sehingga tingkat migrasi komponen sampel berbeda maka
diperoleh pemisahan. Seringkali menjadi target senyawa (analit) harus dipisahkan dari semua
senyawa lain yang ada disampel, dalam hal ini hanya cukup untuk memilih kondisi di mana
analit tingkat migrasi berbeda dari semua senyawa lainnya. Dalam sistem yang dipilih dengan
benar,semua senyawa akan meninggalkan kolom satu demi satu dan kemudian bergerak melalui
detektor. Sinyal mereka, oleh karena itu, terdaftar secara berurutan sebagai sebuah kromatogram.
Metode kromatografi kolom selalu bekerja secara berurutan. Ketika sampel disuntikkan,
pemisahan kromatografi terjadi dan diukur. Jenis kromatografi ini dikenal sebagai “Kromatografi
Online”.

Metode kromatografi kolom yang berbeda dapat dibedakan dengan metode mereka
sistem fase. Kromatografi gas menggunakan gas inert seperti nitrogen atau helium sebagai fase
seluler. Dalam kromatografi cair, fase gerak adalah cairan dengan a komposisi konstan atau
bervariasi diubah selama proses pemisahan. Pemisahan menggunakan komposisi fase gerak
konstan dikenal sebagai pemisahan isokratik. Jika komposisi fase gerak bervariasi selama
pemisahan ini disebut pemisahan gradien. Pompa digunakan untuk memindahkan fase gerak
melalui kolom pada kecepatan yang sesuai. Pemisahan dioptimalkan dengan terlebih dahulu
memilih kolom yang sesuai dan kemudian memvariasikan komposisi fase seluler untuk
mencapai resolusi yang diinginkan dalam waktu yang dapat diterima.

Untuk pemisahan planar seperti TLC, sampel yang berbeda biasanya diterapkan pada fase
diam sebelum dihubungi oleh fase gerak yang mulai bermigrasi melewatinya ke arah yang pasti.
Pergerakan fase seluler melalui fase diam disebut sebagai langkah pengembangan. Setelah
pengembangan fase gerak dihilangkan dengan penguapan dan deteksi dilakukan dalam fase
diam. Catatan respon detektor diplot terhadap pemisahan jarak disebut densitogram.

Pemisahan dengan kromatografi planar terjadi secara paralel kontras dengan pendekatan
berurutan dari kromatografi kolom. Situasi ini memiliki kelebihan dan kerugiannya: proses
berurutan seperti memfasilitasi kromatografi kolom otomatisasi di mana protokol tetap umumnya
digunakan untuk sejumlah sampel.

Pemisahan kromatografi planar lebih fleksibel tetapi tidak mudah diotomatisasi, dan
urutan langkah-langkah manual yang biasa digunakan membuat validasi metode lebih sulit dan
telah menyebabkan, misalnya, pada kenyataan bahwa industri farmasi hampir tidak pernah
menggunakan kromatografi planar untuk memeriksa produk obat (Gbr. 2.1).
 Perbedaan penting lainnya antara kromatografi planar dan kromatografi kolom terletak
pada penggunaan fase diam yang lebih fleksibel. Fase diam baru diperlukan untuk setiap
pemisahan dalam kromatografi planar, sehingga mencegah kontaminasi silang dari satu sampel
ke yang lain. Sehingga sampel bahkan sangat terkontaminasi dapat diterapkan pada fase diam
tanpa pembersihan sampel. Komponen sampel biasanya tidak diabaikan selama deteksi karena
seluruh pemisahan dapat terjadi dipindai. Kromatografi kolom hanya mengukur zat-zat yang
meninggalkan kolom.
Z
f solvent
35 front

30

Z6 compound

25
No. 6

20

Z5

15

10

sample
Z0

application
0

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Immersion

line
-log(R) (475 nm)

gambar. 2.1 Pemisahan enam pewarna (CAMAG III mix, no. 032.8003), dengan densitogram
yang relevan,di piring SiO2, dikembangkan dengan toluena. Dengan meningkatnya nilai Rf:
Ciba F-II (violet),indophenol (biru nila), merah ariabel (merah), biru sudan II (biru), sudan IV
(merah kirmizi) dan(6) N, N-dimethylaminobenzene (kuning)
Yang tersisa di kolom mungkin mudah dilupakan. Itu juga sulit untuk mengamati dekomposisi
pada kolom selama proses pemisahan.
 Perbedaan yang signifikan antara kedua metode pemisahan terletak pada metode tersebut
deteksi. Dalam kromatografi kolom, sampel ditentukan dalam ponsel fase dan ini membatasi
jumlah cairan yang bisa digunakan. Kromatografi cair adalah didominasi oleh pemisahan fase
terbalik di mana 90% atau lebih dari pemisahan menggunakan fase gerak yang terdiri dari
asetonitril atau metanol dalam air atau air penyangga. Dalam TLC, fase seluler dihapus sebelum
deteksi, sehingga tidak dapat mengganggu dengan pengukuran. Di sisi lain, deteksi sekarang
dilakukan di Internet fase diam, yang merupakan media buram, yang mengarah ke kompromi
sendiri dengan cara di mana pendeteksian difasilitasi atau dihalangi.

Pada prinsipnya, proses kromatografi kolom dan planar berbeda metode pemisahan,
masing-masing dengan kekuatan dan kelemahannya sendiri. Banyak orang lihat tidak adanya
persaingan antara TLC dan HPLC, tetapi kedua metode ini dapat diterapkan sebagaimana tepat
karena mereka saling melengkapi.

2.2 Aliran Kapiler TLC

Perbedaan signifikan antara HPLC dan TLC terletak pada cara ponsel fase menembus fase diam.
Dalam HPLC, gradien tekanan dikenakan kolom bertanggung jawab untuk aliran fase gerak,
tetapi dalam TLC klasik fase gerak bergerak melalui lapisan oleh kekuatan kapiler. Dalam buku
teks TLC banyak variasi dari pendekatan TLC klasik dijelaskan [1-11]. Ini termasuk a seluruh
rangkaian proses di mana aliran dipaksa melalui lapisan dan disebut untuk secara kolektif
sebagai metode aliran paksa. Jika aliran fase gerak dipertahankan melalui lapisan dengan
menempatkan medan listrik melintasi lapisan metode tersebut disebut menjadi kromatografi
elektro-planar (EPC). Dapat dianalogikan dengan HPLC disegel pada permukaan yang biasanya
terbuka dan tekanan yang digunakan untuk menggerakkan fase gerak melalui lapisan oleh
serangkaian metode secara kolektif disebut sebagai overpressure kromatografi lapis atau
kromatografi laminar kinerja optimal (OPLC). Ada juga metode tambahan seperti kromatografi
planar rotasi (RPC), di mana aliran fase gerak diinduksi oleh gaya sentrifugal. Semua metode
yang disebutkan di atas tidak akan dibahas lebih lanjut di sini, karena kami akan berkonsentrasi
pada metode TLC klasik, di mana kekuatan kapiler mengontrol aliran fase gerak.

Dalam TLC, fase diam berpori dapat dimodelkan sebagai bundel yang sangat kapiler
halus, di mana kohesi fase gerak secara khusus lebih unggul daripada adhesi dinding kapiler.
Ketegangan permukaan fase gerak dengan demikian terasa berkurang, menciptakan perbedaan
tekanan yang mendorong cairan melalui kapiler. Jenis aliran fase gerak dalam TLC dikenal
sebagai TLC kapiler, untuk membedakannya dari TLC aliran paksa.

Aliran fase gerak ke atas terhenti di ruang vertikal ketika tekanan balik statis yang
disebabkan oleh fluida naik sama dengan permukaan kekuatan ketegangan. Selama
pengembangan di ruang horisontal, hanya itu 2.2 Alur Kapiler TLC 15 meningkatkan kekuatan
gesekan yang membuat aliran kapiler berhenti setelah beberapa saat. Dalam kasus pelat TLC
dicelupkan, posisi depan pelarut bergerak cepat pada awalnya dan kemudian secara bertahap
melambat. Total jarak (Zf) yang bergerak depan adalah a fungsi akar kuadrat dari waktu:

Zf=√ xt

Faktor proporsionalitas w dikenal sebagai konstanta aliran. Hubungan ini

mengungkapkan fakta bahwa aliran kapiler tidak konstan. Hubungan ini bukan valid ketika fase
gerak menguap dari permukaan lapisan atau mengembun dari fase uap. Dalam mengembangkan
kamar dengan volume gas yang besar, ini selalu terjadi. Adsorpsi dan desorpsi komponen fase
gerak oleh lapisan kemudian bervariasi dengan cara yang rumit. Untuk mendapatkan migrasi
fase seluler yang dapat direproduksi, penting untuk menggunakan kamar-kamar yang sedang
berkembang dengan ruang gas sesedikit mungkin.Dalam ruang yang lebih besar, penguapan fase
gerak dapat secara efektif ditekan dengan menjenuhkan ruang gas dengan fase gerak sebelum
mengembangkan Piring TLC.

Ungkapan berikut untuk konstanta aliran mempertimbangkan kedua gesekan internal

yang disebabkan oleh aliran kapiler dan tekanan balik statis dari fase gerak naik, tetapi bukan
pertukaran uap [6,11,12]:

γ
X =2k0dp cos ϑ
ŋ

Dengan

K0=konstanta permiabel(6,8x 10-3)

Dp=ukuran partikel rata-rata fasa diam

ŋ=viskositas fasa gerak

γ =¿tegangan permukaan(permeabilitas)

cos ϑ=sudut pembasahan

Semakin tinggi viskositas dan semakin rendah tegangan permukaan g dari ponsel fase,
semakin lambat bagian depan akan bergerak (Gbr. 2.2). Viskositas dan tegangan permukaan
hasil bagi disebut sebagai faktor permeasi. Faktor permeasi memberikan ukuran standar
kecepatan depan fase gerak. Semakin besar permeasi Faktornya, semakin cepat fase ponsel akan
mengalir melalui lapisan. Permeation faktor untuk di-isopropil eter adalah 9,1, sedangkan untuk
1-propanol adalah 1,05. Di-isopropil ether bermigrasi tiga kali lebih cepat dari 1-propanol:
 Ada sedikit perbedaan dalam waktu yang dibutuhkan untuk pengembangan antara a
piring horisontal dan vertikal. Jika jarak pengembangan Zf diukur pada berbagai interval dan
diplot sebagai (Z2 f) melawan waktu, hasilnya membentuk serangkaian garis lurus (Gbr. 2.3).

Untuk fase gerak polaritas rendah, cosinus dari sudut kontak biasanya sekitar satu dan
karena itu dapat diabaikan dalam hubungan di atas. Ini tidak berlaku untuk lapisan yang terikat
secara kimiawi seperti RP-18 tempat kosinus sudut kontak dapat berada dikurangi menjadi nol
dalam kasus ekstrim. Ketika lapisan tidak lagi basah oleh ponsel fase, kekuatan kapiler tidak
memadai untuk aliran, tetapi ini dapat dibalik jika a surfaktan ditambahkan ke fase gerak berair
[6]. Persamaan (2.3) menunjukkan a laju aliran yang lebih rendah untuk lapisan yang dibuat dari
partikel yang lebih kecil. Bagian depan bergerak lebih pendek jarak per unit waktu.
Pengembangan pada pelat HPTLC dengan partikel rata-rata ukuran dp <10 mm lebih lama dari
pelat TLC dengan diameter partikel rata-rata sekitar 40 mm.
2.3 Ekuilibrium Distribusi TLC

Setelah sampel diterapkan ke pelat TLC, piring ditempatkan di kontak dengan fase seluler dan
pengembangannya dimulai. Selama pengembangan, zat diterapkan pada pelat didistribusikan
antara dua fase yang berbeda, stasioner dan fase seluler. Komponen sampel berinteraksi dengan
stasioner dan fase gerak sesuai dengan apakah mekanisme didominasi oleh adsorpsi atau proses
penyerapan. Dalam kasus pertama mekanisme ini disebut kromatografi adsorpsi dan dalam kasus
kedua kromatografi partisi.

2.3.1 Kromatografi Adsorpsi

Adsorpsi adalah sifat khas dari permukaan, terutama permukaan padat. Adsorpsi dalam TLC
terjadi pada permukaan partikel fase diam, yang berhubungan dengan fase ponsel. Kekuatan
yang terlibat dalam adsorpsi proses adalah kekuatan van der Walls, interaksi tipe dipol, dan
kompleksasi interaksi seperti ikatan hidrogen.

Untuk pemisahan kromatografi, proses adsorpsi harus dapat dibalik dan hanya
melibatkan interaksi fisik. Pada lapisan oksida anorganik semakin kutub kelompok senyawa
memiliki semakin kuat diserap. Struktur senyawa dan suhu sistem juga berperan dalam adsorpsi.
Faktor sterik mempengaruhi luasnya interaksi dengan situs aktif di permukaan lapisan dan suhu
yang lebih tinggi cenderung melemahkan interaksi kutub secara umum karena gerakan yang
lebih besar spesies yang teradsorpsi. Keseimbangan interaksi adsorpsi pada suhu konstan hanya
bergantung pada konsentrasi zat terlarut pada permukaan adsorben dan konsentrasinya dalam
fase gerak. Rasio konsentrasi kesetimbangan suatu zat dalam fase diam dan bergerak adalah
koefisien distribusi K untuk adsorpsi kromatografi, juga dikenal sebagai koefisien partisi ulang
[6]:

g ¿
CS( )¿
K= g g
cm( )
cm 3

Dimana

K=koefisien repartisi

Cs=konsentrasi fasa diam

Cm=konsentrasi fasa gerak

Koefisien partisi ulang memiliki dimensi cm3/ g [6].

Ketika konsentrasi zat terlarut dalam fase sorbing secara logaritmik menurun dengan konsentrasi
dalam fase gerak, situasinya digambarkan sebagai isoterm menurut Feundlich. Jika ada
hubungan linier antara jumlah zat yang diserap dan konsentrasi dalam fase cair, dan jika itu
menunjukkan efek saturasi karena semua pusat adsorpsi tercakup, ini dijelaskan sebagai isoterm
Langmuir. Kedua proses menghasilkan isoterm adsorpsi cekung.

Tidak masalah seperti apa hubungan itu, aspek yang penting adalah untuk bekerja di
wilayah linier isoterm, yang akan menghasilkan berbentuk Gaussian puncak. Zona asimetris
akan menghasilkan konsentrasi yang lebih tinggi, dalam kisaran hubungan melengkung. Fase
diam adalah kelebihan beban di sini, jadi fase bergerak tidak dapat mengikat lebih banyak zat
terlarut meskipun konsentrasi meningkat. Non-teradsorpsi zat terlarut akan bermigrasi melalui
fase diam lebih cepat dari yang diharapkan, sebuah fenomena dikenal sebagai "tailing" karena
zat ini menelusuri garis di belakangnya seperti ekor (Gbr. 2.4).

Di daerah cekung isoterm adsorpsi, lebih banyak zat diadsorpsi oleh fase diam daripada
di daerah linier isoterm. Ini case digambarkan sebagai "fronting". Dalam kromatografi adsorpsi,
fase diam

umumnya terdiri dari silika gel, aluminium oksida, kieselguhr, atau magnesium silikat.

Gambar 2.4 Representasi hubungan antara bentuk titik dan isoterm sorpsi.(a) Profil Gaussian, (b)
garis depan, dan (c) tailing [9]

Zat-zat ini semuanya polar dan dapat dengan mudah menyimpan air dalam kondisi yang
diaktifkan. Fase semacam itu dapat dikeringkan dengan pemanasan, sehingga melepaskan dan
mengaktifkan kembali yang aktif situs fase diam. Sebagai gantinya, air secara efektif
menonaktifkan alat tulis tahap. Dalam kromatografi adsorpsi, adsorpsi air dengan cepat
mengarah ke fase kelebihan beban, menjelaskan mengapa sejumlah kecil air dapat menyebabkan
signifikan perubahan perilaku retensi selama kromatografi adsorpsi.
2.3.2 Kromatografi Partisi

Pada pertengahan 1930-an, Martin mengembangkan alat untuk melawan arus ekstraksi, untuk
memisahkan zat dengan sifat serupa dengan mendistribusikannya antara dua pelarut tak larut.
Bekerja dengan Synge pada tahun 1940, ia memperhatikan hal itu pemisahan campuran dapat
dilakukan ketika hanya satu cairan diimobilisasi dan yang lain mengalir di atasnya. Martin dan
Synge gel silika jenuh dengan air dan memungkinkan kloroform mengalir melalui fase diam ini.
Di dalam cara, mereka mampu memisahkan zat yang sangat mirip satu sama lain. Mirip dengan
silika gel, selulosa, kieselguhr, dan aluminium oksida dapat menyerap air dan dengan demikian
bertindak sebagai fase diam dalam kromatografi partisi. Sampel didistribusikan antara air dan
fase gerak organik menurut distribusi Nernst hukum. Dari pengamatan ini hanya langkah kecil ke
kertas kromatografi, di mana fase diam terdiri dari air yang diimobilisasi oleh selulosa. Konsep
kertas kromatografi diterbitkan oleh kedua peneliti pada tahun 1943.

Dalam kromatografi partisi, pemisahan tergantung pada kelarutan relatif komponen

sampel dalam dua pelarut tak bercampur dibawa ke kontak satu sama lain menurut hukum
distribusi Nernst:

cs vm ms
K= =
cm vs mm

Dimana

K=koefisien partisi

Cs=konsentrasi fasa diam

Cm=konsentrasi fasa gerak

Vs.m=volume fasa diam atau fasa gerak

Ms.m=massa fasa diam dan fasa gerak

Hukum Nernst menunjukkan bahwa hasil bagi antara konsentrasi masing-masing

substansi dalam fase gerak (cm) dan fase diam (cs) pada waktu tertentu suhu adalah konstanta,
yang disebut koefisien partisi. Yang disebutkan di atas ketergantungan massa dari koefisien
partisi adalah hasil dari konsentrasi definisi:

n m/M
C= =
V V

Dimana

n=

M=massa molar
 Karena suatu zat didistribusikan antara fase bergerak dan stasioner, maka jumlah zat n
juga bisa berarti massa m. Pada kenyataannya, koefisien partisi K tidak tergantung pada
konsentrasi total zat yang menghasilkan isoterm linier. Jenis distribusi ini disebut fungsi Nernst.
Namun, jika disosiasi atau asosiasi terjadi pada kedua fase, seperti transfer proton asam / basa
atau kompleks formasi yang menghasilkan penyimpangan cembung atau cekung dari distribusi
Nernst, kemudian zona tailing atau garis depan diamati dalam kromatografi partisi planar. Jadi
kisaran dari K =1 hingga K =10 ideal untuk kromatografi partisi.

Fitur dominan dalam kromatografi adsorpsi adalah fenomena permukaan, dan dalam
kromatografi partisi, peran yang menentukan dimainkan oleh distribusi. antara dua fase cair.
Oleh karena itu, dalam kromatografi adsorpsi, jenisnya, posisi, dan jumlah kelompok fungsional
zat terlarut mengontrol pemisahan, sementara polaritas keseluruhan zat terlarut memainkan peran
yang sama dalam kromatografi partisi. Namun, tidak ada perbedaan yang sangat jelas antara
kedua metode. Misalnya, fase gel silika berlapis cair dapat memiliki situs adsorpsi kosong, yang
dapat bertindak sebagai pusat adsorpsi. Dalam fase yang disebut "ujung-capped", pusat-pusat
aktif adsorpsi sebagian diblokir oleh reaksi kimia. Sebagai contoh, fase selulosa bekerja dengan
menggunakan air yang terikat permukaan sebagai fase diam. Jika sebuah lapisan selulosa kering
digunakan untuk pemisahan, selulosa utamanya berfungsi sebagai fase adsorpsi dan dengan
demikian mengeringkan fase gerak. Jadi asam amino pada a lapisan selulosa kering dapat
dipisahkan dengan baik di bagian pemisahan pertama tetapi kemudian "Dioleskan" di yang
kedua. Ini karena air diperlukan untuk pembentukan fase diam tidak lagi tersedia dari fase gerak.
Terikat secara kimiawi fase aminopropil berperilaku seperti fase distribusi hidrofilik. Ponsel
asam fase memprotonasi gugus NH2, membentuk pusat kationik. Fase diam yang dimodifikasi
ini kemudian bertindak sebagai penukar ion permukaan-aktif.

Lapisan sianopropil yang berikatan secara kimia menunjukkan sifat yang sangat
ambivalen sehubungan dengan mekanisme retensi. Pemisahan dengan kromatografi adsorpsi
diamati dengan fase seluler polaritas rendah. Dengan fase gerak yang mengandung air
mekanisme retensi berubah menjadi kromatografi partisi fase terbalik. Karena untuk perilaku
ambivalen ini, lapisan cyanopropyl sangat sesuai untuk 2D pemisahan (Gbr. 2.5).

Apakah kromatografi partisi atau adsorpsi terlibat dalam pemisahan akhir? kurang
penting. Pertanyaan vitalnya adalah apakah pemisahan itu dapat dipercaya direproduksi.
Densitogram dengan puncak simetris memverifikasi bahwa pemisahan terjadi di wilayah linear
isoterm di mana reproduksibilitas yang dapat diterima dapat diharapkan.
Dengan demikian, nilai distribusi selalu dapat dihitung dalam kasus puncak simetris; tidak
relevan apakah ini dikaitkan dengan kromatografi partisi atau adsorpsi. Cara terbaik untuk
mendefinisikan nilai distribusi ini adalah melalui massa zat yang ditemukan di fase diam (ms)
dan fase gerak (mm):

ns ms vs
K= = =k
nm mm vm

Ekspresi distribusi k disebut faktor retensi dan terhubung ke koefisien distribusi melalui rasio
fase untuk sistem.

2.4 Faktor Retardasi (Rf)

2.4.1 Faktor Empiris Rf

Faktor Rf digunakan untuk evaluasi kualitatif pemisahan TLC. Ini adalah hasil bagi dari jarak
zona zat dari asal sampel ke depan fase seluler (zf). Secara historis, Goppelsr € oder adalah orang
pertama yang menggunakan Rf ini nilai (terkait dengan ekspresi depan) untuk mengkarakterisasi
pemisahan planar:

zs
Rf≡
zf −z 0

Dimana

Zs= jarak zona zat dari asal sampel (mm)

Zf= jarak migrasi depan pelarut (mm)

z0 =jarak antara garis imersi dan asal sampel (mm)

 Menurut definisi, nilai Rf tidak boleh melebihi 1. Untuk menghindari titik desimal, Rf
nilai kadang-kadang dikalikan dengan 100 dan kemudian digambarkan sebagai nilai hRf. Nilai
faktor retardasi dalam sistem pemisahan yang diberikan pada suhu konstan sepenuhnya
tergantung pada sifat karakteristik dari zat yang dipisahkan. ini penting untuk keperluan
identifikasi bahwa nilai Rf akurat dan dapat diproduksi kembali, tetapi ini sulit untuk dicapai,
karena hampir tidak mungkin untuk mengendalikan semua kondisi eksperimental yang
memengaruhi proses pemisahan (Gbr. 2.6).

Masalah ini dihindari dengan mendefinisikan faktor keterbelakangan untuk zat standar (Rst)
yang telah dipisahkan dalam sistem:

Zs
Rst =
Zst

Dimana

Zs= jarak zona zat dari asal sampel (mm)

Zst=jarak zona standar zat dari asal sampel(mm)

2.4.2 Termodinamika factor Rf

Sementara hanya nilai Rf empiris yang dapat diberikan dari densitogram, nilai Rf termodinamika
(juga dikenal sebagai nilai Rf sebenarnya) dengan benar mewakili perilaku zat dalam sistem
pemisahan. Termodinamika nilai Rf didefinisikan sebagai fraksi waktu analit dilarutkan dalam
ponsel fase (tm) dalam kaitannya dengan total waktu pengembangan (tms):
tm
Rf=
tm+ts
Dimana

tm=waktu fasa gerak

ts=waktu fasa diam

Hubungan antara massa zat di ponsel dan stasioner fase tidak tergantung waktu. Dengan asumsi
distribusi konstan antara fase, distribusi massa untuk analit dijelaskan oleh

mm
Rf=
mm+ms

dimana

mm=massa sampel fasa gerak

ms=masa sampel fasa diam

Mengembalikan ke definisi konsentrasi (c=n / V=m / MV), mengikuti itu

vm
cm . vm
Rf= = cs
cm. vm+ cs . vs vm+ . vs
cm

Dimana

Cs.m=konsentrasi fasa diam atau gerak

Vs.m=volume fasa diam atau fasa gerak

Jika hubungan koefisien partisi diterapkan untuk persamaan ini, hasilnya adalah disebut
persamaan Martin – Synge:

1
1
Rf= kvs =
1+ 1+ k
vm

Dimana

K=koefisien partisi

k factor retensi

Nilai Rf yang diukur secara empiris hanya identik dengan termodinamika Rf bernilai jika
salah satu dari kondisi berikut dapat diterapkan:

- Jika rasio fase tetap konstan untuk seluruh lapisan

- Jika komposisi fase seluler tidak berubah selama pengembangan

- Jika fase diam bebas dari pelarut sebelum pengembangan

- Jika kecepatan depan pelarut sama dengan kecepatan fase gerak di tempat posisi

Tetapi kondisi ini tidak pernah terpenuhi di dunia nyata. Karena itu yang diamati Nilai Rf akan
selalu lebih kecil dari Rf "benar" atau termodinamika Nilai. Rf nilai mulai dari 62 hingga 100%
dari Rf termodinamik nilai dikutip dalam literatur yang relevan. Perkiraan yang masuk akal
untuk termodinamika Rf Nilai adalah diperoleh dengan mengalikan nilai Rf yang diamati dengan
1,1. Apalagi di sini nilai Rf-nya digunakan tanpa membedakan antara nilai "terukur" atau
"termodinamika".Jika tidak disebutkan lebih lanjut, singkatan Rf diambil untuk berarti yang
diukur dengan benar Nilai Rf identik dengan nilai termodinamika.

2.5 Komposisi Fase gerak

Komposisi fase gerak jarang konstan pada seluruh jarak pemisahan. Beberapa penyimpangan
hampir selalu diamati di dekat asal sampel dan depan pelarut. Karena itu hanya gunakan nilai Rf
yang diukur dalam kisaran 0,05-0,9 saat solvasi selektif dari fase stasioner yang mengarah ke
demixing tidak menjadi masalah.Distribusi komponen-komponen campuran fasa ponsel ternary
yang diamati pada lapisan gel silika ditunjukkan pada Gambar. 2.7. Fase seluler terdiri dari
polaritas rendah mesitylene dan polar benzyl alkohol (dicampur dengan etil asetat). Pada 40 mm
jarak pemisahan gradien depan mesitylene dapat diamati dengan penurunan dalam konsentrasi
benzyl alkohol. Penjelasannya sederhana. Relatif konsentrasi mesitylene dalam fase gerak
meningkat dengan mengorbankan benzyl alkohol; semakin banyak polar benzil alkohol diserap
secara selektif oleh situs aktif pada lapisan gel silika. Mesitylene, yang kurang teradsorpsi
dengan silika gel, diperkaya dalam fase gerak dan membentuk gradien di bagian depan pelarut.
Ini menggambarkan suatu fitur penting dari pemisahan menggunakan mode pengembangan:
 Gambar 2.7 menunjukkan kromatografi adsorpsi khas dengan pengembangan fase
normal, yaitu, dengan komposisi fase gerak yang kurang polar daripada fase diam. Zat polaritas
rendah bermigrasi dalam pelarut polaritas rendah gradien depan. Dengan demikian beberapa
pemisahan dapat menghasilkan sinyal depan yang kuat yang disebabkan oleh komponen sampel
polaritas rendah yang bermigrasi dalam gradien depan pelarut. Gambar 2.7 menunjukkan bahwa
konsentrasi alkohol benzil dalam fase gerak turun dengan cepat pada jarak pemisahan 40 mm.
Mesitylene agak mudah menguap mengumpulkan di depan. Dalam sistem ini komposisi fasa
gerak konstan hanya terjadi hingga jarak pemisahan 40 mm. Dalam fase ponsel ini nilai Rf lebih
tinggi dari 0,85 tidak berarti karena zat yang tidak dipisah di wilayah ini bergerak bersama
gradien depan pelarut.

Dapat juga disimpulkan dari Gambar 2.7 bahwa semua zat dengan nilai Rf <0,85 telah
dikuasai oleh gradien polaritas rendah di bagian depan pelarut. Karena itu semuanya substansi
dengan jarak pemisahan kurang dari 40 mm telah menghabiskan waktu bermigrasi dalam gradien
depan pelarut. Ini menjelaskan mengapa nilai Rf yang diukur berbeda dari Rf termodinamika
yang "benar" 0 nilai.

Gambar 2.8 mengilustrasikan plot tipikal komposisi untuk fase gerak terner mengandung
metanol dalam pemisahan fase normal menggunakan lapisan gel silika octadecylsiloxanebonded.
Fase gerak terdiri dari volume mesitylene yang sama dan benzyl alkohol dalam metanol. Dalam
hal ini adalah mesitylene, yang memiliki yang lebih tinggi afinitas untuk fase stasioner polaritas
rendah RP-18 dari benzyl alkohol dan secara selektif diserap dari fase gerak oleh lapisan.
Komponen utama dari fase gerak adalah metanol yang relatif polar, yang membersihkan benzyl

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

0 10 20 30 40 50 60 70

Separation distance (mm)

alkohol menghasilkan gradien depan pelarut yang luas. Di bawah kondisi ini, kutub zat tetap
tidak terpisahkan dalam gradien depan. Mesitylene kecil sinyal di depan puncak alkohol benzyl
menunjukkan mesitylene menguap, yang diserap oleh lapisan dan sekarang diserap oleh bagian
depan pelarut yang bergerak.

Perubahan komposisi fase gerak dapat dilihat di bawah jarak pemisahan 5 mm. Di sini, proporsi
mesitylene dalam fase gerak kurang dari pada campuran pelarut asli. Mesitylene diperkaya pada
5 mm pertama stasioner fase sementara konsentrasi benzyl alkohol berkurang. Setelah jarak
pemisahan sekitar 5 mm keseimbangan baru antara fase membentuk fase gerak konstan
komposisi. Ini menjelaskan mengapa nilai Rf di bawah 0,1 dan di atas 0,85 seharusnya tidak
digunakan untuk karakterisasi zat

2.6 Transfer Pemisahan TLC ke Kolom

Nilai Rf mencirikan jarak migrasi analit untuk kondisi berkaitan dengan TLC. Namun, suatu zat
hanya bisa bergerak sementara terlarut dalam fase gerak; kalau tidak tetap di tempatnya. Jika
suatu zat memiliki Nilai Rf 0,2, maka harus menghabiskan 1/5 dari waktu pengembangan di
ponsel fase dan 4/5 dari waktu pengembangan dalam fase stasioner. Nilai untuk faktor retensi k
dengan demikian dihitung dengan k ¼ 4. Hubungan yang disebutkan di atas antara Rf Nilai 0 dan
faktor retensi harus valid untuk sampai pada Rf Nilai 0,2:

1 tm
Rf= =
k +1 tm+ts

Nilai Rf adalah konstanta spesifik analit untuk stasioner dan seluler tertentu kombinasi fase.
Dengan demikian, teknik layer dan kolom memiliki retensi yang sama faktor, seperti yang
ditunjukkan oleh persamaan:

ts 1−Rf
Rf= =
tm Rf

Mentransfer kondisi pemisahan dari pemisahan planar ke HPLC memiliki keunggulan praktis
karena pemisahan TLC lebih cepat, secara umum, dan lebih murah daripada pemisahan yang
tidak dioptimalkan oleh HPLC. Prasyarat untuk mentransfer retensi data dari TLC ke
kromatografi kolom adalah koefisien distribusi harus identik di kedua sistem. Ini adalah
kasusnya, ketika menggunakan stasioner yang sama dan fase seluler. Persamaan Martin – Synge
(2.6), ditetapkan sesuai dengan partisi koefisien, hasil

1−Rf Vm
K=
Rf Vs

Jika koefisien distribusi TLC dan HPLC disetel sama dan jika Vm mewakili volume fase gerak
dan W berat sorben, hubungan berikut hasil antara pemisahan TLC dan HPLC:
 {VmW K } ={VmW 1−Rf
HPLC
Rf } TLC

dari transformasi rumus martin-synge nilai Rf pada TLC sama dengan factor retensi HPLC .jika
Vm /W maka

vm

Khplc =
{ w }
TLC
1−Rf

{vmw }HPLC Rf
Jika berat fase diam dan volume fase gerak adalah dikenal, Rf Nilai 0 yang ditentukan
oleh TLC dapat digunakan untuk menghitung retensi faktor yang diharapkan untuk pemisahan
HPLC. Untuk menghindari penentuan berat dan volume, sistem pemisahan dapat dikalibrasi
dengan membuat percobaan hubungan antara pemisahan TLC dan HPLC untuk serangkaian
standar dan menggunakan informasi ini untuk memprediksi pemisahan HPLC untuk zat lain
setelah TLC data telah diperoleh [13].

2.7 Nilai Rm Termodinamika

Nilai Rf tidak linier terkait dengan sifat struktural a molekul. Namun, korelasi linear dengan
struktur ada jika bentuk logaritmik dari nilai Rf digunakan. Nilai Rm ini diperkenalkan pada
1950 oleh BateSmith dan Westall [14]:

Rm =lg ( Rf1 −1 )=lg(k)

Ekspresi untuk nilai Rm ketika dimasukkan dalam persamaan Martin-Synge (2.8) hasil

vs
Rm=lg +lg k
vm

Dengan menerapkan persamaan ∆ μ °= RT ln K = 2. 3RTlg K untuk potensi kimia, itu memberi

hubungan Martin yang penting:

vs ∆ μ °
Rm =lg +
vm 2.3 RT

Potensial kimia ∆ μ °menggambarkan perubahan energi bebas yang dihasilkan dari transfer satu
mol analit dalam kondisi standar antara fase. Martin hubungan didasarkan pada pertimbangan
termodinamika dan berlaku untuk adsorpsi serta kromatografi partisi. Martin menjelaskan
pemisahan yang luar biasa kekuatan kromatografi dengan menggunakan persamaan ini. Jika
hanya dua molekul sedikit berbeda, misalnya, berbeda hanya dalam satu elemen struktur, mereka
perbedaan potensi kimia sebanding dengan elemen struktural. Ini menjelaskan mengapa molekul
besar dengan perbedaan struktural kecil dapat dipisahkan. Untuk pemisahan, perbedaan
struktural individu adalah penting, bukan relatif perbedaan [7].

Persamaan Martin berfungsi sebagai dasar untuk hubungan struktur-retensi kuantitatif.

Dalam kasus ideal, potensi kimia suatu zat adalah jumlah dari kontribusi parsial elemen
strukturalnya (atom, kelompok fungsional, dan obligasi). Nilai substansi Rm dapat dihitung dari
zat homolog sebagai a kelipatan dari struktur dasar, seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 2.9
untuk alifatik yang berbeda asam karboksilat. Jika nilai Rm anggota diketahui, maka nilai Rm
selanjutnya untuk anggota tambahan dapat disimpulkan.

2.8 Ketergantungan Suhu Pemisahan TLC

Pengaruh suhu pada pemisahan lapisan tipis relatif lemah dibandingkan dengan pengaruh lain.
Perubahan suhu memiliki efek nyata pada komposisi kesetimbangan fase gerak dalam kontak
dengan fase diam. Konstanta distribusi bergantung pada suhu seperti halnya isoterm sorpsi.
Lebih tinggi suhu mendukung penguapan komponen yang lebih mudah menguap dari ponsel fase
ke fase gas serta mengurangi viskositas fase gerak. Lebih lanjut, kandungan air yang bergantung
pada suhu memainkan fase uap peran penting dalam kromatografi adsorpsi. Ini adalah fakta yang
terkenal bahwa TLC pemisahan berdasarkan adsorpsi pada umumnya stabil dan berjalan dengan
baik pada suhu sedang

zona iklim tetapi merupakan bencana total pada hari-hari musim panas di daerah tropis. Udara
tinggi kelembaban jelas membuat perbedaan dan ada efek suhu juga. Oleh karena itu, faktor-
faktor yang bergantung pada suhu di atas saling bersaing satu sama lain membuatnya hampir
mustahil untuk secara tepat memprediksi efek perubahan suhu terhadap pemisahan TLC.
Hubungan Martin menggabungkan suhu dan Nilai Rm dalam persamaan tunggal di mana nilai
Rm meningkat seiring suhu berkurang. Dengan demikian nilai-nilai Rf harus meningkat ketika
suhu menurun pada konstanta kelembaban absolut untuk fase gas [6]. Pada kelembaban relatif
konstan, nilai Rf yang diamati naik dengan penurunan suhu. Dengan demikian, dapat
disimpulkan bahwa semakin tinggi suhunya, semakin rendah aktivitas fase stasioner. Bahkan,
viskositas fase gerak menurun pada suhu yang lebih tinggi, sehingga meningkatkan kecepatan
konstan. Ini menghasilkan pemisahan pusat zona yang lebih tinggi tetapi dengan peningkatan
diameter tempat. Oleh karena itu, tidak ada argumen substantif yang mendukung kinerja
Pemisahan TLC pada suhu yang lebih tinggi. Di sisi lain, ada beberapa pemisahan hanya berhasil
pada suhu rendah. Misalnya pemisahan polycyclic hidrokarbon aromatik pada lapisan gel silika
diresapi kafein pada -20 °C [16, 17]. Singkatnya, dapat dinyatakan bahwa perubahan suhu di
wilayah 10 °C menyebabkan sedikit atau tidak ada perubahan dalam proses pemisahan, asalkan
kelembaban sistem dijaga konstan. Dalam praktiknya, ini berarti laboratorium perlu
melakukannya mempertahankan suhu sedang untuk melakukan pemisahan TLC.

2.9 Pertimbangan Teoritis Lanjut

Pemisahan kromatografi ditentukan oleh kombinasi kinetik dan sifat termodinamika. Sifat
termodinamika bertanggung jawab atas perilaku retensi dan selektivitas. Properti kinetik
menentukan perluasan zona selama pemisahan [18].

Proses pemisahan kromatografi dapat dibandingkan dengan cairan-cair distribusi dalam corong
pisah, kecuali bahwa keseimbangan antara fase terjadi beberapa ribu kali dalam pemisahan
kromatografi. Selain itu, dalam a pemisahan kromatografi fase gerak melewati fase diam
sedangkan dua fase hanya dibawa ke dalam kontak dan dipisahkan secara khas percobaan
distribusi cair-cair. Dalam kromatografi kolom, suatu zat adalah didistribusikan secara permanen
antara kedua fase tetapi hanya bergerak ketika di ponsel tahap. Simulasi proses ini, ditransfer ke
TLC, mengarah ke sampel bergerak melalui lapisan TLC dalam bentuk distribusi binominal.
Asumsi bahwa sejumlah analit n diterapkan pada lapisan TLC sebelum menghubungi fase gerak,
jumlah total zat terkonsentrasi di zona kecil dan fase seluler belum memiliki kontak dengan
sampel, situasi ini diwakili oleh persamaan

0 n fasa gerak
{}
=
n n fasa diam
=n(γ + β ¿ °

Nominator dalam persamaan ini mewakili fase gerak dan penyebut fase diam. Arti dari γ dan β
akan dijelaskan di bawah ini. Kesetimbangan belum ditetapkan antara dua fase, karena semua
sampel n masih terletak di zona awal fase diam. Setelah menambahkan fase seluler, beberapa
sampel didistribusikan antara fase diam dan bergerak, menurut masing-masing faktor retensi.
Faktor nS mengacu pada jumlah zat yang tersisa di fase diam dan nm dengan jumlah yang
dilarutkan dalam fase gerak. Ini saat ungkapan berikut ini valid untuk substansi dalam fase diam:

ns=knm
Karena jumlah sampel dilestarikan, maka harus didistribusikan di antara keduanyafase, dan
ungkapan berikut ini juga valid:

n= ns +nm

Jika persamaan atas diganti dengan yang lebih rendah, ini mengarah ke ekspresi

n= nm(k+1)

dan setelah penataan ulang, itu menjadi

1
nm= n≡ βn
(k + 1)

Dari sampel yang diterapkan n, fraksi bn akan pindah ke fase gerak. Itu persamaan di bawah ini
mewakili fraksi jumlah sampel n, yang tetap dalam fase diam:

k
ns=knm= n≡ γn
(k + 1)

Fraksi sampel amobil yang tetap dalam fase diam diberikan oleh gn. Ekspresi untuk β dan γ
memungkinkan deskripsi pemisahan yang lebih pendek proses. Menurut definisi, fraksiβ
mengubah fase sementara fraksi γ tetap di belakang, sehingga mengarah ke β +γ =¿ 1.

Pada langkah berikutnya, fase seluler baru menghubungi zona sampel mendorong fraksi nb
molekul sampel ke area pelat yang bersih. Fraksi ng dari sampel diimobilisasi oleh fase diam dan
tidak bergerak. Setelah yang pertama keseimbangan, situasinya direpresentasikan sebagai
berikut:

{nγ0 + nβ0 }= nnfasa gerak

fasa diam
=n(γ + β ¿ 1

Kesetimbangan selanjutnya dapat digambarkan sebagai berikut. Fraksi n di ponsel dan fase diam
akan didistribusikan sesuai dengan faktor retensi mereka. Dari jumlah zat yang tersisa dalam fase
diam, fraksi β dari jumlah nγ akan pindah ke fase seluler (i.e β nγ ), sedangkan fraksi γ dari nγ
(i.e.γ nγ ) tetap pada asal sampel pada fase diam. Dari substansi jumlah n β dalam fase gerak,
fraksi γ akan pindah ke fase diam (i.e γ nβ), sedangkan fraksi β dari nβ tetap dalam fase gerak.
Jika selanjutnya bersih fase gerak diperkenalkan, maka kita miliki

βnβ n fasa gerak

{ γnγ0 + βnγ
γnβ 0 } n fasa diam
+ = =n(γ + β ¿ 2

Jika fraksi individual n dari fase diam dan bergerak adalah disimpulkan pada akhir tiga
tahap keseimbangan yang dijelaskan di atas, hasilnya dapat diwakili oleh ekspresi binominal.
Bentuk persisnya tergantung pada sejumlah tahap kesetimbangan. Untuk x jumlah keseimbangan
hasilnya diwakili oleh n(β +γ ¿ x

Setelah banyak keseimbangan, gambar yang berguna tentang distribusi sampel pada TLC
hasil lapisan. Untuk faktor retensi rendah (k≅ 1 ¿dan untuk jumlah tak terbatas equilibria,
distribusi binominal bergabung menjadi distribusi tipe Guassian

1 2

F(x)=n e−(x−zs)/2 σ
√ 2 πxγβ
Sudah sering dikatakan bahwa zat bergerak di sepanjang pelat TLC sebagai urutanZona
berbentuk gaussian. Pernyataan ini hanya dapat dianggap sebagai perkiraan, karenabahkan pelat
TLC terpanjang tidak memiliki kapasitas untuk memungkinkan jumlah tak terbatastahapan
kesetimbangan. Oleh karena itu, puncak TLC yang direkam dalam densitogram adalah
benardigambarkan sebagai fungsi binominal. Meskipun demikian, fungsi Gauss masih tetap pada
perkiraan yang memuaskan untuk banyak pemisahan TLC menggunakan kinerja tinggi lapisan.
Distribusi jumlah zat n sebagai distribusi Gaussian,ditandai dengan nilai rata-rata zS dan varian
σ , didefinisikan sebagai berikut:

1 2

f(x)=n e−( x−zs )2 /2 σ

σ √2 π

Untuk x = zS fungsi-e adalah 1 dan fungsi Gaussian mendekati maksimum ketinggian f (zS) =
(1/σ √ 2 π ¿ x 1 ¿ .Nilai zS dari puncak dalam densitogram harus diambil di mana sinyal mencapai
nilai tertinggi. Lebar distribusi Gaussian didefinisikan sebagai jarak antara median puncak yang
direkam dan titik belok. Pengukuran lebar ini digambarkan sebagai standar deviasi puncak.
Kuadrat dari deviasi standar disebut varians (σ 2 ).

Gambar 2.10 mengilustrasikan distribusi jumlah kafein yang konstan di jarak migrasi
yang berbeda. Kafein dioleskan ke piring, direkam (puncak sempit di awal), mengembangkan
jarak pendek, dan kemudian direkam lagi. Proses ini diulang sembilan kali. Perhatikan bahwa
sinyal kafein melebar setiap pengembangan. Jika kuadrat dari jarak pemisahan (zS) dibagi
dengan varians, ini pada awalnya akan menghasilkan nilai yang lebih atau kurang konstan

z 2 s ( xγ ) 2 γ
= =x =xk≡ N '
σ 2 s xγβ β

Produk dari faktor retensi k dan jumlah langkah distribusi memberikan nilai konstan x yang
menunjukkan efisiensi serta migrasi
jarak dalam pemisahan TLC. Produk efisiensi dan jarak migrasi ini disebut "bilangan real pelat
teoritis" dan diwakili oleh simbol N0 . Jika hubungan dirumuskan sesuai dengan standar deviasi
puncak direkam dalam densitogram, ini menghasilkan persamaan berikut:

1
σs= zs
√N '
Ungkapan ini secara umum valid dan berarti bahwa lebar puncak (2σ S) meningkat dengan jarak
migrasi yang lebih panjang, seperti yang ditunjukkan dengan jelas pada Gambar 2.10. Jadi begini
bahwa sistem kromatografi hanya dapat memisahkan sejumlah sampel karena jarak pemisahan
yang tak terhingga panjang akan menyebabkan puncak yang sangat luas.

Ungkapan "jumlah pelat teoritis" atau "nomor pelat" di kolom kromatografi mengacu
pada panjang kolom yang sesuai dengan tahap kesetimbangan tunggal. Nomor pelat dalam
kromatografi kolom dapat dihitung secara langsung dari kromatogram karena setiap zat, terlepas
dari waktu retensinya, harus bermigrasi dengan jarak yang sama yang ditentukan oleh panjang
kolom. Sebaliknya, masing-masing substansi yang terpisah dalam TLC telah dikaitkan dengan
itu jarak migrasi yang berbeda didefinisikan sebagai sebagian kecil dari jarak migrasi depan
pelarut. Oleh karena itu, dalam kromatografi lapis tipis, jumlah pelat maksimum N ditentukan
pada pelarut posisi depan harus dikoreksi untuk setiap zat dalam kromatogram oleh fraksi jarak
migrasi depan pelarut yang mereka migrasi menggunakan Nilai Rf [6,11]:

N’=NRf

jika nilai lebar puncak di dasar untuk puncak Gaussian digunakan, dengan w = 4σ (atau lebih
tepatnya, W=2X1.96σ ), hubungan berikut ini valid:

ZS 2 2
ZS
N’= ( ) ( )
σS
=16
WB

N’ menjelaskan nomor pelat teoritis untuk setiap zat yang sesuai dengan fraksi dari
nomor pelat untuk jarak migrasi depan pelarut yang masing-masing substansi bermigrasi.
 Nomor pelat pada jarak migrasi depan pelarut N mewakili nilai maksimum yang mungkin
untuk pemisahan itu. Ini adalah nilai yang meningkat karena pemisahan tidak dapat dicapai pada
bagian depan pelarut di mana N dihitung:

1 ZS 2 (zt−z 0)
N= ( )
Rf σS
=16zs
w2 B

Untuk zat-zat yang berada pada posisi aplikasi sampel tidak ada interaksi dengan fase
seluler, dan jarak migrasi adalah nol. Untuk mereka zat yang bermigrasi pada bagian depan
pelarut tidak ada interaksi dengan stasioner fase, dan jumlah langkah-langkah keseimbangan
karena itu nol. Dalam kedua kasus, ini akan membuat N atau N’ nol juga. Nilai untuk N lebih
besar dari nol hanya untuk zat dengan nilai Rf dalam kisaran 0 <Rf <1. Hanya pemisahan
kromatografi terjadi ketika kinerja pemisahan sistem selain dari nol.

Gambar 2.11 menunjukkan pemisahan enam pewarna, menunjukkan peningkatan puncak

lebar dengan meningkatnya jarak migrasi zS. Densitogram memungkinkan lebar puncak pada
jarak pangkalan dan migrasi yang akan diekstraksi untuk perhitungan nomor pelat
gunakan (2.16) (lihat Gambar 2.12). Nomor pelat hingga 5.000 dicapai dalam TLC. Piring nomor
hingga 300.000 telah dijelaskan untuk HPLC [6], meskipun nomor plat <25.000 lebih tipikal
untuk kolom dalam penggunaan umum.

Simpangan baku puncak sering ditentukan oleh lebar puncak setengahtinggi daripada
lebar puncak di pangkalan. Ketinggian puncak Gaussian adalah dijelaskan oleh faktor kedepan
fungsi(1/σ √ 2 π ) Fungsi Gaussian nilai pada tinggi puncak median HP / 2 diberikan oleh

Hp 1 1 2

= = e−( x2)/ 2σ
2 2 σ √2 π σ √ 2 π

Sehingga dapat disimpulkan bahwa

2 x2
2=e ( x ) 2/ 2 σ dan ln2=
2 σ2

Lebar puncak di setengah ketinggian, berjalan dari -x ke +x. Jadi

w 2 H =8 σ 2 ln 2=5,545 σ 2

Hubungan untuk nomor pelat juga dapat ditulis dalam bentuk berikut ketika lebar puncak di
setengah tinggi digunakan sebagai pengganti pengganti standar deviasi untuk puncak Gaussian
yang direkam dalam densitogram:

(zt−z 0)
N=5.545zs
W2H

2.10 Indeks yang Mencirikan Pemisahan dan Resolusi

Bagaimana pemisahan dapat ditingkatkan? Tentu saja Anda ingin memisahkan a substansi dari
semua komponen sampel lain sehingga dapat dikuantifikasi dengan benar. Untuk tujuan ini,
sistem kromatografi harus dipilih yang menyediakan diferensiasi yang cukup dari nilai Rf dari
masing-masing zat. Pada penyelesaian langkah pengembangan zona substansi menempati ruang
yang ditentukan oleh jarak migrasi depan pelarut yang ditandai oleh lokasi (nilai Rf) dan a
distribusi yang kira-kira diwakili oleh fungsi Gaussian. Karena dispersi, zona individu
menempati ruang pada lapisan yang tergantung pada zona mereka Nilai Rf dan sifat sistem.

Luas puncak distribusi Gaussian sebanding dengan jumlah zat yang terkandung di dalam
spot. Lebar puncak pada dasar (wB) dari puncak Gaussian adalah a ukuran ruang yang ditempati
oleh zona yang dipindai di pelat TLC. Ini bisa dihitung untuk zat individu dengan menggunakan
jarak zS menurut

4
WB= zs
√ NRt
Resolusi, RS, dari dua kurva Gaussian yang berdekatan (dua puncak) didefinisikan oleh
quotients dari perbedaan antara dua sinyal maksimum (zS1 dan zS2) dan rata-rata aritmatika
lebar puncaknya di pangkalan (wB1 dan wB2):

zs 2−zs 1 ZS 2−ZS 1 ZS 2−ZS 1

=2 =
Rs= WB 1+WB 2 WB 1+WB 2 2(σ 1+σ 2)
2

Untuk RS = 0,5 jarak antara puncak adalah σ 1+σ 2 ≈ 2 σ-disebut “2σ pemisahan". Dua puncak
masih saling tumpang tindih sekitar 20%. Namun demikian dua komponen masih bisa dikenali.
Pada resolusi 1, puncaknya hampir benar-benar terpisah. Profil puncak hanya tumpang tindih
sebesar 3%, sesuai dengan 4σ pemisahan (Gbr. 2.13).

Resolusi 1,25 sudah cukup untuk pengukuran kuantitatif dengan memindai densitometri.
Resolusi lebih besar dari 1,5 tidak perlu untuk mengukur puncak yang tumpang tindih karena
tumpang tindih puncak kurang dari 0,3%. Tentu saja ini saja berlaku untuk puncak simetris yang
melekat pada profil Guassian. Dalam hal fronting atau puncak tailing, pemisahan 10σ diperlukan
untuk kuantifikasi yang andal, yang sesuai dengan resolusi RS =2.5.

Dari definisi nilai Rf, zS =Rf(zf- z0)dan dengan penyederhanaan σ 1≈ σ 2 ≈ σ ekspresi untuk
resolusi dapat diubah menjadi

( Rf 1−Rf 2 ) (zf −z 0)
Rs=
4σ

Dengan (zf –z0)=zS1 = Rf1 dan aplikasi dari (2.14), berikut itu
 (Rf 2−Rf 1) zs 1 Rf 1 1
Rs=
Rf 1 4σ
= (
Rf 2 4 )
−1 √ NRf

Nilai Rf dihitung dari nilai rata-rata Rf1 dan Rf2. Mengingat bahwa Rf = 1 /(1+k) itu mengikuti
itu

1
Rs= √ NRf (k1-k2)Rf2= 1 √ NRf (k 1−k 2) k2Rf2
4 4 k2

Menggunakan ekspresi untuk faktor retensi zat kedua k2 =(1-Rf2)/Rf2, persamaan Snyder untuk
resolusi dalam TLC diperoleh [6, 19, 20]:

1 k1
Rs=
4 (
√ NRf (1-Rf2) −1
k2 )
Menurut persamaan Snyder, resolusi dua zat dipengaruhi oleh tiga faktor:

(a) Istilah pertama dalam persamaan Snyder menggambarkan kualitas lapisan. Ini adalah
ditandai dengan nomor pelat NRF dan didominasi oleh kontribusi difusi ke perluasan zona untuk
lapisan yang disiapkan dengan baik. Resolusi bisa ditingkatkan dengan peningkatan jumlah pelat
tetapi hanya sebanding dengan kuadrat akar NRf. Peningkatan nilai Rf diperkirakan akan
meningkatkan resolusi dua bermigrasi dengan erat puncak tetapi ini tidak terjadi karena resolusi
melewati a maksimum di sekitar nilai Rf 0,3. Ini karena lawannya kontribusi dari dua istilah
pertama dalam (2.21).

(b) Istilah kedua dalam (2.21) bertentangan dengan pengertian yang pertama. Semakin besar Rf
nilai, semakin rendah resolusi dua zona bermigrasi erat. Semua zat bagian depan pelarut
memiliki nilai Rf satu dan resolusi RS = 0. Semua zat yang bermigrasi di wilayah yang dekat
dengan bagian depan pelarut miliki sejumlah interaksi dengan fase diam dan probabilitas
pemisahan mereka rendah.

(c) Istilah selektivitas tergantung pada rasio faktor retensi. Lebih besar perbedaan untuk faktor
retensi, semakin tinggi selektivitas kromatografi dan semakin tinggi resolusi. Istilah selektivitas
adalah ukuran dari kemampuan sistem pemisahan untuk membedakan antara dua zat oleh
kemampuan mereka untuk interaksi antarmolekul yang berbeda di ponsel dan fase diam.
Persamaan (2.21) juga dapat diartikan berbeda. Dua istilah pertama (a dan b) menggambarkan
"resolusi potensial" dari sistem TLC. Ini juga merupakan ukuran umum kinerja pemisahan
variabel lokal dari sistem kromatografi di a jarak migrasi tertentu. Dapat digunakan untuk
menghitung resolusi aktual (RS) dari sepasang zat, dengan mengalikan istilah a dan b dengan
istilah c [6]. Oleh mengadopsi singkatan Q2 = Rf (1-Rf)2 istilah a dan b dari (2.21) dapat
dijelaskan sebagai berikut (dengan Rf   Rf2):

NQ2=NRf(1-Rf)2=√ NRf (1-Rf)2

Produk NQ2 sebanding dengan resolusi kuadrat dan dikenal sebagai "Nomor plat efektif". Jika
Rf2 digantikan oleh faktor retensi, persamaan di atas dapat dituliskan sebagai
2
1 K2
(
NQ2= 1−
1+ K 2)2=N ' (
1+ K 2 )
Variasi nomor pelat efektif dengan nilai Rf dievaluasi secara grafis pada Gambar 2.14.

Menurut Gambar 2.14, nomor plat efektif tertinggi diperoleh dengan Rf nilai sekitar 0,33.
Pemisahan yang memuaskan hanya dicapai di wilayah Rf dari 0,05 menjadi sekitar 0,9. Untuk
pemisahan kritis, sistem harus disesuaikan demikian bahwa pasangan kritis memiliki nilai Rf
rata-rata sekitar 0,33. Dalam TLC itu sangat sulit untuk meningkatkan kualitas pelat (diwakili
oleh pffi N) dengan faktor lebih dari 2–3. Namun, selektivitas dapat ditingkatkan dengan faktor
10-50 hingga a pilihan cerdas dari fase mobile dan stasioner. Dalam praktiknya, biasanya lebih
produktif untuk mengoptimalkan komposisi fase gerak untuk stasioner yang dipilih fase [6].

2.11 Perluasan Zona dalam Kromatografi Planar

Kita dapat membedakan antara tiga proses berbeda yang berkontribusi pada zona memperluas
dalam TLC, umumnya disebut sebagai istilah A, B, atau C [6, 20, 22-30].

2.11.1 Istilah A
Istilah A ditentukan oleh heterogenitas layer, yang dihasilkan dari variasi dalam kepadatan
pengepakan lokal, distribusi ukuran dan bentuk partikel, dan keberadaan aditif dalam lapisan
seperti pengikat dan indikator visualisasi. Heterogenitas lapisan bertanggung jawab atas
heterogenitas aliran. Aliran lebih lambat melalui sistem porositas internal daripada melalui ruang
antarpartikel [6]. Efek ini disebut difusi Eddy dan berbanding lurus dengan partikel diameter.
Guiochon dan Siouffi adalah peneliti pertama yang menggantikan istilah itu Difusi Eddy (dari
pendekatan Giddings) untuk proses yang jauh lebih lambat kromatografi cair. Mereka juga
menggunakan konstan Knox tanpa dimensi untuk menggambarkan kualitas pengemasan lapisan
[6]:
3
2 √ Dp 4
σ xA= A 3
√ dmRf t
2.11.2 Istilah B

Molekul sampel dalam fase gerak berdifusi ke segala arah. Berdasarkan Hukum difusi Einstein,
zona zat melebar seiring waktu, sebagaimana ditentukan oleh koefisien difusi. Perluasan zona
dalam fase seluler, dinyatakan sebagai varian s2 , dapat ditulis sebagai

σ 2=2Dmt

Perluasan zona longitudinal (σ x), yaitu zona yang menyebar dalam aliran arah, dihitung dari
perluasan zona karena difusi, dikoreksi ke menjelaskan ruang yang ditempati oleh partikel
sorben yang tak dapat ditembus, labirin faktor, dan memperkenalkan faktor retardasi untuk
memperhitungkan fraksi waktu pemisahan yang dihabiskan sampel dalam fase seluler:

σ 2 xB =2DmtγmRft =BDmRft

Situasi serupa juga berlaku untuk standar deviasi transversal yang melintasi arah aliran.

Kromatografi partisi membutuhkan kontribusi lebih lanjut untuk menjelaskan perluasan zona
longitudinal [20, 22-27]. Fraksi sampel dalam stasioner terlarut fase dengan koefisien difusi (Ds)
dan faktor labirin untuk stasioner fase (ls) secara perlahan akan bertukar dengan sampel dalam
fase gerak yang menghasilkan perluasan zona longitudinal tambahan diungkapkan oleh [28]

1−Rf
(
σ 2 xB= γmDm+
Rf )
γsDs Rft

Hubungan ini menunjukkan bahwa dalam partisi TLC, zona memperluas dari hasil difusi dari
kontribusi yang terjadi di ponsel dan stasioner fase. Dalam arah pengembangan, zona
memperluas dengan peningkatan nilai Rf dipengaruhi oleh difusi dalam fase diam terlarut [6]. Ini
menghasilkan pembentukan zona elips. Untuk nilai Rf yang lebih kecil ada beberapa
persimpangan antara fase diam dan bergerak dan zona tetap bulat atau padat. Pada nilai Rf yang
lebih tinggi, substansi memiliki beberapa simpang susun dengan fase diam dan menghabiskan
sebagian besar waktunya dalam fase gerak, dan karenanya sulit berdifusi ke dalam pori fase
diam. Perluasan zona bergantung hampir secara eksklusif pada difusi dalam fase gerak, dengan
zona sampel membentuk sirkus difus

2.11.3 Istilah C

Istilah C bertanggung jawab atas keterlambatan yang disebabkan oleh proses transfer massal
selama sorpsi dan desorpsi molekul terlarut. Ini berbanding terbalik dengan pemisahan waktu
dan koefisien difusi dan sebanding dengan kuadrat partikel diameter [26]:

2 d2 p
σ xC =C
DmRft

Jumlah semua variasi kemudian menggambarkan total varian zona proses perluasan:

σ 2 s=σ 2 xA+ σ 2 xB +σ 2 xC

2.11.4 Ketinggian Plat Lokal H

Seperti yang telah disebutkan, N (nomor pelat untuk panjang pemisahan lengkap)
menggambarkan kapasitas pemisahan sistem kromatografi, mis. semakin besar N adalah,
semakin banyak zat yang bisa dipisahkan. Alih-alih memberikan nomor plat, itu sxC memperluas
zona proses non-equilibrium ukuran partikel dp Koefisien difusi Dm dalam fase gerak (cm2 / s) t
tinggi pelat lokal H sering diberikan sebagai karakteristik pemisahan kromatografi. Ini diperoleh
dengan membagi jarak pemisahan total dengan N [6]:

ZF−Z 0 zf −z 0 σ 2 s
H≡ =Rfσ 2 s =
N z 2s zs

Ekspresi H mewakili fraksi (imajiner) dari panjang pelat yang, dalam teori, satu langkah
keseimbangan dalam pemisahan dicapai [6]. "H nilai ”dienkapsulasi dalam akronim HETP
(ketinggian setara dengan pelat teoritis).

2.11.5 Persamaan van Deemter

Persamaan van Deemter menggambarkan hubungan antara ketinggian lempeng lokal H dan
faktor individu yang menyebabkan perluasan zona. Persamaan ini adalah awalnya dikembangkan
untuk kromatografi gas dan kemudian digunakan dalam kromatografi cair. Guiochon dan Siouffi
menerbitkan adaptasi untuk TLC [6, 28]. Persamaan ini menggambarkan hubungan antara difusi
molekuler, transportasi massa, dan ketinggian pelat lokal H. Ini memungkinkan kecepatan
optimal untuk diperkirakan dalam kolom kromatografi dan jarak pemisahan optimal dalam TLC.
Persamaannya juga memungkinkan kita untuk memprediksi partikel dan diameter pori mana
yang menghasilkan pemisahan optimal kinerja untuk fase diam. Oleh karena itu persamaan van
Deemter yang dimodifikasi membuat kontribusi yang menentukan keberhasilan pengembangan
lapisan HPTLC.

Kecepatan depan pelarut, yang sesuai dengan kecepatan fase gerak lokal untuk zona
sampel, dihitung sesuai dengan definisi umum kecepatan:

zf −z 0
U=
t

Mengingat (zf-z0) =zS / Rf berikut ini valid:

zf −z 0 zs
Rft=Rf =
u u

Dibagi oleh zS, jumlah semua variasi dapat digambarkan sebagai ketinggian pelat lokal:

σ 2 S σ 2 XA + σ 2 XB+ σ 2 XC
H= =
ZS ZS

Persamaan van Deemter yang dimodifikasi yang dirancang untuk kromatografi adsorpsi dapat
ditulis sebagai berikut [28]:

dp 1 /3 BDm d 2 p u
H=ADp ( dm )
u +
u
+C
Dm

Konstan A mencirikan kualitas fase diam, B difusi aksial, dan C ketahanan terhadap transportasi
massa dalam lapisan. Nilai H terutama tergantung pada u (kecepatan fase gerak). Jika fase gerak
bergerak perlahan melalui lapisan, difusi mendominasi; memperluas zona pemisah menghasilkan
pemisahan yang buruk. Jika fase seluler juga bergerak cepat melalui lapisan, keseimbangan tidak
sepenuhnya mapan dan lagi miskin hasil pemisahan. Untuk pemisahan apa pun ada kecepatan
fase gerak optimal sesuai dengan nilai minimum untuk H. Situasi optimal ini tergantung tegas
pada ukuran partikel (dp) lapisan. Menurut Giddings [30], istilah pertama (istilah A) di van
Deemter Persamaan menggambarkan difusi Eddy dan transportasi massa dalam fase gerak. Ini
difusi ke segala arah disebabkan oleh berbagai kecepatan aliran lokal yang berbeda di fase diam.
Penyebab yang biasa adalah geometri partikel yang bervariasi dari kemasan. Itu semakin
seragam kemasan fase diam, semakin rendah nilai konstanta A. Kontribusi lebih lanjut untuk
difusi eddy muncul dari perbedaan kecepatan lokal di dalam layer. Gradien kecepatan ada dalam
saluran antarpartikel, dengan a perbedaan yang lebih besar antara kecepatan aliran di tengah dan
di sisi yang lebih besar saluran daripada di saluran yang lebih sempit. Partikel yang lebih kecil
meningkatkan aliran yang lebih halus ada sedikit difusi. Tentu saja, seseorang tidak dapat terus
mengurangi ukuran partikel saluran akan menjadi terlalu sempit dan mudah diblokir

Istilah kedua dari persamaan van Deemter (istilah B) menggambarkan efek dari fase
gerak difusi molekuler. Istilah ini sudah dibahas dalam bagian tentang "perluasan zona di TLC".
Kecepatan fase seluler berbanding terbalik sebanding dengan perluasan zona. Sebagai akibatnya,
kontribusi dari istilah B untuk perluasan zona berkurang dengan meningkatnya kecepatan fase
gerak. Di TLC, zona pelebaran paling terlihat untuk jarak pemisahan yang lebih panjang dan
pada Rf yang lebih tinggi nilai-nilai. Ini adalah konsekuensi dari penggunaan kekuatan kapiler
untuk mempromosikan dan mempertahankan aliran fase gerak dan merupakan kerugian yang
cukup besar untuk TLC dibandingkan dengan sistem kolom yang diatur secara pneumatik.

Ekspresi ketiga dalam persamaan van Deemter yang dimodifikasi (istilah C)

memperhitungkan pertimbangan bahwa adsorpsi dan desorpsi sampel dari fase diam butuh
waktu. Beberapa molekul diadsorpsi dan oleh karena itu tetap pada posisinya sementara yang
lain bergerak maju dengan fase gerak, menghasilkan dispersi zona dalam aliran arah. Karena
efek ini juga terhubung dengan permukaan pengemasan, maka secara langsung tergantung pada
diameter partikel kuadrat. Selanjutnya, ia juga mempertimbangkan itu molekul dalam lapisan
tipis dapat bergerak ke permukaan lapisan lebih cepat dari pada lapisan lebih tebal. Proses
pembubaran kembali yang lebih cepat juga mengurangi dispersi [18].

2.12 Kondisi Pemisahan Optimal dalam TLC

Dalam GC atau HPLC, kecepatan fase gerak optimal dihitung sebagai H minimum nilai dari
hubungan van Deemter. Sayangnya, seperti yang ditunjukkan Geiss dengan benar [6], kecepatan
fase gerak untuk TLC tidak konstan dan, sebagai konsekuensinya, the nilai H tergantung pada
posisi masing-masing zona dalam kromatogram. Karena itu menyatakan kecepatan fase gerak
optimal tidak relevan untuk TLC. Namun demikian Ketergantungan lokasi ketinggian plat lokal
dapat dihilangkan dengan membuat yang baru nilai (H / zf) untuk ketinggian pelat lokal. Jika
hasil bagi ini untuk ketinggian pelat lokal adalah terintegrasi untuk ruang antara titik aplikasi
sampel dan bagian depan pelarut jarak migrasi (dari z0 ke zf) tinggi plat HM rata-rata yang
diperoleh adalah independen dari kecepatan fase gerak tetapi bukan konstanta kecepatan aliran
w. Geiss menyebut ungkapan ini "tinggi pelat rata-rata yang diamati", yang merupakan jumlah
semua ketinggian lempeng lokal melewati selama pengembangan [6]. Ekspresi TLC untuk
persamaan van Deemter lokal harus diintegrasikan ke seluruh pemisahan jarak

Istilah A dan istilah C dapat diminimalkan dengan dp kecil. Difusi koefisien sampel
dalam fase gerak (Dm) sulit untuk dioptimalkan karena itu muncul di nominator dari term kedua
serta di penyebut yang pertama dan istilah ketiga. Kontribusi utama dari difusi muncul dalam
istilah B.
 Menurut hukum difusi Einstein, batas zona akan berkembang dalam semua arah waktu t
oleh 2Dmt. Akibatnya, pemisahan harus cukup cepat untuk meminimalkan perluasan pita.
Sayangnya, aliran fase seluler terhalang oleh partikel kecil dalam fase diam, yang mengurangi A
dan D istilah dan memperbesar istilah B. Menggunakan fase gerak dengan konstanta difusi kecil
akan membatasi perluasan zona sebanyak mungkin [6]. Konstanta kecepatan kecil juga
mengurangi pengaruh persyaratan B dan C. Selain itu, perlu dicatat bahwa untuk z0 nilai
mendekati nol ekspresi logaritmik cenderung ke nilai yang sangat besar. Itu jarak antara garis
perendaman dan zona aplikasi sampel tidak boleh terlalu pendek. Menurut Saunders dan Snyder
[6, 31], hubungan optimal untuk zf ke z0 harus berada di antara 7 dan 33. Seperti ditunjukkan
dalam (2.25) dan Gambar 2.15, HM mencapai nilai minimum untuk a panjang pengembangan
tetap. Untuk nilai z0 = 1 cm, pengembangan optimal
130

TLC

capillary flow
110

90 HPTLC
(micron)

capillary flow

70
Height

TLC

50 forced flow
Plate

HPTLC
30
forced flow

10

0 2 4 6 8 10 12

Solvent Front Migration (cm)

panjang untuk pemisahan TLC adalah antara 7 dan 15 cm [18]. Demikian standar Stahl nilai
untuk TLC klasik: z0 = 1 cm dan zf =10 cm [6] dipilih dengan sangat baik. Seperti ditunjukkan
pada Gambar. 2.15, panjang pengembangan optimal untuk HPTLC adalah sekitar 4 cm [18]
Ketinggian plat minimum untuk pemisahan aliran kapiler selalu lebih tinggi daripada untuk
aliran paksa. Pelat HPTLC dengan partikel lebih kecil dari yang disediakan pelat TLC pemisahan
yang lebih baik, tetapi jarak pengembangan 5 cm tidak boleh terlampaui (Tabel 2.1) [33].
Kesimpulan apa yang bisa ditarik dari (2.25)? Situasi yang ideal adalah mempertahankan a aliran
konstan untuk seluruh jarak pemisahan, suatu kondisi yang hanya terpenuhi dalam Optimal
Performance Laminar Chromatography (OPLC). Namun selanjutnya perincian tentang metode
khusus ini tidak akan dibahas di sini. Poin praktis yang penting adalah pentingnya bekerja
dengan pelat TLC dengan a distribusi ukuran partikel kecil. Ini dapat dicapai dengan
menggunakan kinerja tinggi piring lapisan tipis. Selain itu, fase diam harus dikemas secara
homogen, yang berpendapat menentang mempersiapkan piring sendiri dan untuk membeli secara
industry produk yang diproduksi.

Jika memungkinkan seseorang juga harus menggunakan pelarut dengan difusi rendah agar
meminimalkan perluasan zona. Bagaimanapun, pembangunan harus selalu terjadi melebihi jarak
pemisahan optimal [6]. Belenkii merekomendasikan menggunakan piring dengan dp =10 mm
dan panjang pengembangan zf = 10 cm untuk bahan yang rendah berat dan lapisan molekul
dengan dp =5 mm dan panjang pengembangan zf= 5 cm untuk zat dengan berat molekul lebih
tinggi [12].

Istilah D diminimalkan jika sampel yang akan dipisahkan memiliki stasioner yang besar
koefisien difusi fase (Ds). Ini lebih sering terjadi pada kromatografi partisi daripada dalam
kromatografi adsorpsi.

Plot Van Deemter untuk lapisan yang disiapkan dengan partikel yang berukuran lebih kecil dari
10 mm terus meningkat garis bukannya kurva hiperbolik khas. Jelas, hanya itu Istilah B (karena
difusi molekul dalam fase gerak) berkontribusi pada perluasan puncak untuk lapisan-lapisan ini.
Semua kontribusi lain untuk perluasan pita dapat diabaikan.

Jadi HM untuk ukuran partikel kecil (dp <10 mm) dikurangi menjadi sebagai berikut [28]:

bx
Hm= ( zf −z 0)
x

Persamaan ini menunjukkan bahwa ketinggian pelat rendah hanya dapat dicapai untuk
pemisahan jarak pendek. Oleh karena itu piring dengan partikel yang lebih besar harus
digunakan untuk pemisahan jarak yang lebih jauh. Secara umum, setelah memilih piring materi
dan fase ponsel yang optimal, analis hanya dapat meningkatkan pemisahan dengan memilih
panjang pengembangan optimal.

2.13 Nomor Pemisahan

Metode pemisahan yang secara memuaskan memisahkan banyak zat harus dinilai lebih tinggi
dari sistem pemisahan yang hanya dapat memisahkan beberapa zat. Itu nomor pemisahan yang
diperkenalkan oleh Kaiser memberikan dasar untuk evaluasi kapasitas pemisahan sistem
kromatografi [32]. Nomor pemisahan menjelaskan jumlah zona yang dapat dipisahkan dengan
resolusi 4s. Dalam TLC ini sesuai dengan situasi di mana jarak antara dua puncak yang
berdekatan dalam a densitogram sama dengan jumlah lebar puncaknya di setengah tinggi. Lebar
puncak pada setengah tinggi, wH dapat dinyatakan sebagai fungsi linear dari panjang
pengembangan. Untuk menghitung angka pemisahan untuk TLC, Kaiser menggunakan lebar
puncak rata-rata di nilai setengah tinggi diperoleh dengan menjumlahkan lebar puncak pada
setengah tinggi untuk sampel zona di asal dan zona sampel di bagian depan pelarut diperoleh
dengan ekstrapolasi dari serangkaian lebar puncak nyata yang direkam dalam densitogram:

Wh=1/2(wh start+wh front)

Jarak pemisahan efektif rata-rata dihitung sebagai

Zm=1/2(zf-z0)

dengan definisi untuk nomor pemisahan (SN)

zm
SN≡
wh

Nomor pemisahan menggambarkan jumlah zona yang dipisahkan pada jarak pemisahan (zf - z0).
Untuk menghitung angka pemisahan, lebar puncaknya setengah tinggi dapat ditentukan sesuai
dengan hubungannya

N’= ( ZSσS )=5,545 WZ22HSS

yang mengusulkan hubungan linier antara jarak pemisahan dan puncak lebar setengah tinggi:

Dye Separation distance (mm) WH (mm)

Ciba F-II 0.92 0.73

Indophenol 2.57 0.83

 Ariabel red 6.96 1.01

Sudan blue 9.53 1.10

Sudan IV 16.9 1.83

Dimethyl-aminobenzene 24.9 2.11

Front 34.8

Sebagai contoh perhitungan, pemisahan campuran pewarna pada silika gel (Gbr. 2.11)
memberikan nilai-nilai berikut: Kemiringan plot lebar puncak di setengah ketinggian terhadap
pemisahan jarak menghasilkan kemiringan a = 0,0611 (Gbr. 2.16). Mencegat, dihitung sebagai
puncak

lebar setengah tinggi wH (mulai), adalah 0,64 mm. Jumlah pelat asli dihitung dari kemiringan
sebagai

5,545 zf −z 0
N’= =5.545
a2 wh front−wH START

yang memperhitungkan perluasan zona akun selama proses pemisahan.

5.545 5.545
N’= = =1,486
a2 0,061092

Lebar puncak pada setengah tinggi untuk senyawa yang bermigrasi dengan bagian depan pelarut

Dengan jarak pemisahan total eksperimental (zf-z0) =38 mm, mengikuti hal itu

WH front=2.77 mm

Menggabungkan (2.26) dan (2.27) dengan 5.545 = 4ln (4) memberikan ekspresi untuk
nomor pemisahan [32]:

1 N real . WH front −wh start

SN=
√
2 ln ( 4 ) WH front+ WH start
−1

Untuk campuran pewarna diperoleh angka pemisahan SN ¼ 9, nilai yang cukup khas untuk TLC.
Nomor pemisahan maksimum dicapai dengan membuat aplikasi zona sekecil mungkin. Dengan
sistem pemisahan yang dipilih, tidak lagi mungkin untuk mempengaruhi difusi sampel. Namun,
geometri spot dapat dioptimalkan dengan menggunakan peralatan yang sesuai.

2.14 Tinggi Plat Nyata

Teori perluasan zona didasarkan pada asumsi bahwa zona itu tidak realistis perluasan hanya
tergantung pada proses yang terjadi pengembangan. Untuk menjelaskan perluasan zona tak
terhindarkan selama aplikasi sampel, ketinggian pelat harus dikoreksi untuk perluasan zona
selama aplikasi sampel. Ini digambarkan sebagai nyata tinggi pelat Hreal. Kaiser menyarankan
metode sederhana dan praktis untuk menentukan ketinggian plat nyata [29-32]. Lebar puncak
analit pada setengah tinggi (wHS) dihitung sebagai jumlah lebar aplikasi pada setengah tinggi
(wH) dan lebar sinyal (wHreal) disebabkan oleh pengembangan kromatografi:

Wh real=Wh(start)+wHS

Untuk ketinggian pelat asli

zf −zo
H real=
N ' real

dan menggantikan N’ nyata

( wH front−wH start ) 2
H real=
5.545( zf −zo)

Dalam hal campuran pewarna CAMAG, tinggi pelat asli dihitung sebagai Hreal ¼ 23,5 mm.
Untuk membandingkan metode TLC, pelat nyata ditentukan secara eksperimental ketinggian
harus dikutip sesuai dengan (2.30).

REFERENSI
1. Fried B, Sherma J (1999) Thin layer chromatography – techniques & applications. Dekker,
New York

2. Fried B, Sherma J (eds) (1996) Practical thin layer chromatography: a multidisci-plinary

approach. CRC, Boca Raton

3. Poole CF (2001) In: Nyiredy Sz (ed) Planar chromatography. A retrospective view for the
third millennium. Springer, Budapest

4. Sherma J, Fried B (eds) (1995) Handbook of thin-layer chromatography, 2nd edn. Dekker,
New York

5. Grinberg N (1990) Modern thin layer chromatography. Dekker, New York

6. Geiss F (1987) Fundamentals of thin layer chromatography. Huethig, New York

7. Poole CF (2003) The essence of chromatography. Elsevier, Amsterdam

8. Hahn-Deinstrop E (2007) Applied thin layer chromatography: best practice & avoidance of
mistakes, 2nd edn. Wiley, New York

9. Wagner H, Bladt S (1996) Plant drug analysis – thin layer chromatography atlas. Springer,
New York

10.Frey HP, Zieloff K (1993) Quantitative and qualitative thin layer chromatography
(Grundlagen and Praxis). Chemie, Weinheim

11.Kraus Lj, Koch A, Hoffstetter-Kuhn S (1995) Thin layer chromatography. Springer, Berlin

12.Belenkii B, Kurenbin O, Litvinova L, Gankina E (1990) A new approach to optimization in

TLC. J Planar Chromatogr 3:340–347

13.Reuke S, Hauck HE (1995) Thin-layer chromatography as a pilot technique for HPLC

demonstrated with pesticide samples. Fresenius J Anal Chem 351:739–744

14.Bate-Smith EC, Westall RG (1950) Chromatographic behavior and chemical structure in

some naturally occurring phenolic substances. Biochim Biophys Acta 4:427-440, 2. The tea
catechins 441–444

15.Canic´ VD, Perisˇic´-Janjic´ NU (1974) Separation of aliphatic and aromatic organic acids on
starch thin-layers. Chromatographic behaviour and chemical structure. Z Anal Chem 270:16–
19

16.Funk W, Gl€uck V, Schuch B, Donnevert G (1989) Polynuclear aromatic hydrocarbons

(PAHs): charge transfer chromatography and fluorimetric determination. J Planar
Chromatogr 2:28–32

17.Funk W, Donnevert G, Schuch B, Gl€uck V, Becker J (1989) Quantitative HPTLC

determina-tion of six polynuclear aromatic hydrocarbons (PAH) in water. J Planar
Chromatogr 2:317–319
18.Poole CF, Fernando WPN (1992) Some musings on the measurement and interpretation of
theoretical plate height in thin layer chromatography. J Planar Chromatogr 5:323–333

19.Snyder LR (1968) Principles of adsorption chromatography. Dekker, New York

20.Guiochon G, Bressolle F, Siouffi A (1979) Study of the performance of thin-layer chromatog-

raphy IV. Optimization of experimental conditions. J Chromatogr Sci 17:368–386

21.J€anchen D (1977) In Zlatkis A, Kaiser RE (eds) HPTLC – high performance thin-layer

chromatography. Elsevier, Amsterdam, pp 129–145

22.Guiochon G, Siouffi A, Engelhardt H, Hala´z I (1978) Study of the performance of thin-layer

chromatography I. A phenomenological approach. J Chromatogr Sci 16:152–157

23.Guiochon G, Siouffi A (1978) Study of the performance of thin-layer chromatography II.

Band broadening and the plate height equation. J Chromatogr Sci 16:470–481

24.Guiochon G, Siouffi A (1978) Study of the performance of thin-layer chromatography III.

Flow velocity of the mobile phase. J Chromatogr Sci 16:598–609

25.Guiochon G, K€or€osi G, Siouffi A (1980) Study of the performance of thin-layer

chromatogra-phy V. Flow rate in reversed phase plates. J Chromatogr Sci 18:324–329

26.Belenkii BG, Nesterov VV, Gaukina ES, Semirnov MM (1967) A dynamic theory of thin
layer chromatography. J Chromatogr 31:360–368