PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK II

HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY(HPLC)

Oleh

Nama : Hendriko
NIM : 18035064
Prodi : Pendidikan Kimia
Anggota Kelompok : 1. Elide sufra yeni
2. herpadora yulika
3. ruseli fitri manayu
Dosen : Alizar, S.Pd, M.Sc, Ph. D
Asisten Dosen : 1. Ridho Hermawan
2. Fransiska Adella

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG
2020
 HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY(HPLC)

1. Pengenalan HPLC:jelaskan teori dan kegunaannya

Jawab:

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi,
campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media
porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran
kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai
pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ (tidak
bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran
tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam” dan
cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan
bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan
dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada.
(hendayana,2006)

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran

yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua
fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa
gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi).

Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan
teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode
pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya
melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan  menggunakan
teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 )

HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia
untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu
pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa
LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan
untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan
kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih
kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, Day. 2002 ).
 Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif
bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu
sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat
tersebut dalam sample (Riyadi, 2009).

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan
teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam
kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya,
perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar,
oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva
kalibrasi (Cupritabu, 2010)

Kromatografi cair berperforma tinggi merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat
cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada
umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat tertentu.

Kegunaan HPLC:
a. HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri
b. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak,misalnya minyak terpenoid
tinggi ,segala senyawa jenis feol ,alkaoid
c. HPLC digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spectrum uv atau
spectrum sinar tampak
d. Banyak digunakan pada industry farmasi dan pestisida
e. Dapat memisahkan dan menganalisis vitamin yang larut dalam air
f. Untuk analisis anion nitrat

2. Bahagian/komponen utama dari HPLC

Jawab:
 Komponen:

1. Fasa gerak
2. Sample
3. Detector
4. Kolom
5. Pompa
6. Injector
7. wadah

3. fasa diam dan fasa gerak yang digunakan

jawab:
fasa diam :  hidrokarbon alkil non polar seperti rantai C-8 atau C-18 yang terikat pada
basis silika.
Fasa gerak :pelarut yang mempunyai tekanan yang tinggi

4. komponen utama instrument HPLC

jawab:

1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut

Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi.
Idealnya, pelarut khusus yang memang sudah memenuhi standard untuk HPLC
dipergunakan untuk hasil yang lebih akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah
penyimpanan fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung 

2. Pompa

Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, pompa yang digunakan dalam HPLC
haruslah pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam reservoir
menuju kolom fase diam dan melewati detektor. Tekanan yang digunakan beragam
tergantung dari dimensi kolom, ukuran partikel fase diam, serta laju alir dan komposisi
dari fase gerak yang akan dipakai.

3. Injektor

Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi
dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem injeksi
otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam kisaran
volume 0.1-100 mL.
   4. Sampel

Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat bening dan tidak ada
endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan sebelum dianalisis, misalnya dengan
melakukan filtrasi sampel. Preparasi lain dapat pula dilakukan sesuai kebutuhan seperti
mengatur konsentrasi sampel, desalting, dan lain-lain.

 5. Kolom HPLC

Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai fase diam. Di dalam kolom
akan terjadi pemisahan komponen sampel yang kemudian dapat dihitung waktu retensi
masing-masing komponennya oleh detektor. Waktu retensi adalah waktu yang
dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju detektor.
Waktu retensi dihitung dari saat sampel diinjeksikan hingga puncak pembacaan
maksimum pada detektor. Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu yang berbeda
sehingga masing-masing konsentrasinya dapat dihitung.
Kolom HPLC tersedia dalam panjang serta packing material yang berbeda-beda
tergantung dari jenis HPLC yang hendak digunakan. Packing material merupakan
material yang diisikan ke dalam kolom sebagai fase diam. Packing material yang sering
digunakan biasanya yang berbasis silika, baik silika yang tidak dimodifikasi maupun
yang telah termodifikasi seperti oktadesil silika (ODS) yang memiliki lapisan C18.

 6. Detektor

5. cara preparasian HPLC

jawab:

PREPARASI SAMPEL

•    Sampel harus dalam bentuk larutan.

•    Untuk skala analisis sampel dalam μL, konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak
boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi maksimal adalah sekitar
40 ppm.

PREPARASI FASA GERAK

•    Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC.
Untuk air, digunakan akuabidest.

•    Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore kemudian diawagaskan

(didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.
 •    Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan, untuk
menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.

•    Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang digunakan.

6. Prinsip kerja HPLC dalam pemisahan

Jawab:
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.
Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.

7. Beri contoh pemisahan dengan kromatografi kolom

Jawab:

1)   HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
2)   Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3)   Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4)   Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5)   Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6)   Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
7) Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan
golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol,
alkaloid, lipid dan gula.
8) HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas
campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan
golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.
8. agaimana membedakan suatu zat dengan zat lain berdasarkan grafik yang dihasilkan
HPLC

Jawab:

HPLC dapat menganalisis secara kualitatif dan kuantitatif.pada proses kualitatif cara yang
paling umum untuk mengindentifikasi adalah dengan melihat retention time(RT).peak yang
mempunyai RT yang sama dengan standard uumnya adalah peak milik analat .selain melihat
RT hal lain yang perlu dilihat adalah spectrum 3D dari signal kromatogram.zat yang sama
akan mempunyai spectrum 3D yang juga sama.sehingga jika spectrum 3D antara dua zat
berbeda ,maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan ,meskipun
memiliki RT yang sama.

9. Tuliskan beda HPLC dengan kromatografi kertas.

Jawab:

HPLC:

1. Menggunakan detektor
2. Menggunakan pelarut dengan tekanan tinggi
3. Menggunakan alat yang bertekana tinggi
4. Menggunakan sinar uv

Kromatografi kertas:
1. Menggunakan kertas
2. perlu penjenuhan sebelum digunakan
3. warna yang didapat kan bisa dilihat dengan jelas
4. Bisa dengan metode ascending
 DAFTAR PUSTAKA

Cupritabu, 2010. Menghitung Kadar Parasetamol dalam Obat dengan

HPLC. http://cuprittrappedonlab.blogspot.com. 27 maret 2020

Day, R.A., A.L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.

Hendayana, Sumar. (2006) . KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforensis

Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.

Riyadi, W. 2009. Identifikasi signal kromatogram HPLC. http://wahyuriyadi.blogspot.com. 27

maret 2020

Wiji,dkk.2010.kromatografi.Bandung : UPI.