LAPORAN PRAKTIKUM KEHALALAN OBAT DAN MAKANAN

“ISOLASI DNA”

Disusun Oleh:

Kelompok 4C

1. Rahmah Dinda Purnama 11171020000060

2. Annisa Fadhilah 11171020000061
3. Fatimah Nur Fauziyah 11171020000062
4. Nadya Shafira 11171020000063
5. Listiani Oktaviani 11171020000064

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2019/2020
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Menurut Kamus Besar Bahasa Indonesia, bakso merupakan jenis makanan yang dapat terbuat dari
udang, daging dan ikan yang dibuat dengan cara dicincang lalu dihaluskan bersama tepung kanji
dan putih telur, biasanya dibentuk bulat-bulat. Definisi lain menyebutkan bakso daging adalah
produk makanan yang diolah menjadi bentuk bulatan umumnya, dengan kadar daging tidak kurang
dari 50%, pati dengan atau tanpa bumbu BTP (bahan tambahan pangan) yang dibolehkan.
Pada umumnya jenis bakso yang lebih sering dikonsumsi oleh masyarakat adalah bakso
sapi. Namun harga daging sapi yang mahal, membuat beberapa pedagang mengoplos daging sapi
dengan daging yang lebih murah seperti daging babi.
Isolasi DNA merupakan tahap awal yang harus dilakukan untuk menganalisis suatu DNA.
Keberhasilan proses isolasi DNA sangat menentukan hasil analisisnya. Prinsip dasar eksraksi
DNA/isolasi DNA adalah pemisahan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Pada proses
isolasi yang harus diperhatikan yaitu komposisi dari buffer ekstraksi dan pH, hal tersebut penting
karena jika komposisimya tidak sesuai, DNA akan terdegradasi (Maftuchah et al., 2014).
Fungsi larutan buffer yaitu menjaga struktur DNA selama tahap isolasi dan purifikasi,
memudahkan dalam penghilangan senyawa protein dan RNA serta mencegah degradasi DNA oleh
enzim. Fungsi larutan buffer dapat dioptimalkan dengan meningkatkan konsentrasi, pH, kekuatan
ion dan deterjen. Salahsatu contoh dari deterjen pekat yaitu SDS (Sodium Doecyl Sulphate) yang
berperan sebagai penghambat semua aktivitas enzim nuclease yang ada selama proses ekstraksi,
yang mana enzim ini merupakan enzim pendegradasi DNA (Nugroho dan Dwi, 2017). Aktivitas
enzim nuclease juga dapat dihambat dengan menambahkan buffer yang mengandung sodium sitrat
dan EDTA karena senyawa tersebut akan berikatan dengan Ca2+ dan Mg+ yang merupakan
kofaktor bagi DNase (Buwono, 2018).

1.2 Tujuan

1. Mahasiswa mampu melakukan uji isolasi DNA pada daging babi

 BAB II

Landasan Teori

2.1 Dasar Teori

Ada tiga prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu penghancuran sel (lisis), pemisahan DNA dari
padatan seperti selulosa dan protein (ekstraksi) dan permunian DNA.
1. Penghancuran Sel (lisis)
Penghancuran sel dilakukan untuk mengeluarkan organel-organel yang ada
didalam sel. Tahap penghancuran ini dapat dilakukan dengan cara fisika seperti menghaluskan
sampel menggunakan mortar dan pistil dalam nitrogen cair atau menggunakan metode
freezing-thawing dan iradiasi. Cara lainnyamyakni cara kimiawi dengan menggunakan
senyawa deterjen yang sifatnya melarutkan lipid pada membran sel sehingga mengakibatkan
destabilisasi membran sel. Cara enzimatik yakni menggunakan proteinase K yang akan
melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai
polipeptida dalam sel (Nugroho dan Dwi, 2017).
2. Pemisahan DNA (ekstraksi)
Tahap ekstraksi ini dilakukan untuk memisahkan DNA dari bahan-bahan lain
seperti RNA dan protein. Proteolitik (Proteinase K) digunakan untuk menghilangkan
kontaminasi pada larutan DNA dan untuk menghilangkan kontaminasi RNA digunakan enzim
RNAase (ribonuklease). Selanjutnya dilakukan pengendapan DNA dengan proses sentrifugasi
yang akan mengendapkan asam nukleat dengan penambahan etanol dingin. Tahap terakhir
pellet yang terbentuk dilarutkan kembali dengan buffer yang mengandung SDW (Nugroho
dan Dwi, 2017).
3. Pemurnian DNA
Pellet DNA yang telah terbentuk selanjutnya dimurnikan dengan menambahkan
etanol. Adanya kandungan garam (kation monovalent seperti Na+), pada suhu -200C etanol
absolut mampu mengendapkan DNA dengan baik (Radji, 2011).
 BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah mortar, pipet mikro, tip, lemari pendingin 4°C, mesin PCR,
tabung mikrosentrifus 1,5 ml, rak tabung, mesin sentrifugasi, timbangan, vorteks, microwave,
spatula, pisau, elektroforesis tray, chamber elektroforesis, scanner, comb, gel documentation. Alat
gelas yang digunakan adalah gelas ukur, labu Erlenmeyer (100 ml & 250 ml), gelas Beaker (250
ml), dan tabung penyimpanan bahan (50 ml, 100 ml, 250 ml & 500 ml).
Bahan yang digunakan yaitu TE (Tris-Cl & EDTA) pH 8.0, etanol 70%, isopropanol,
potassium acetate solution, DNase-free RNase, Proteinase K, buffer PCR LA Taq, agarosa, buffer
1xTAE, sybr safe 1x, loading dye dan dH2O.

3.2 Prosedur Kerja

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard® Genomic DNA Purification Kit
(Promega).
1. Preparasi Jaringan Hewan dan Pelisisan Sel
Sebanyak 20 mg daging sapi segar, daging babi segar, dan sampel sosis sapi dihancurkan
sampai halus menggunakan pisau steril, lumpang alu dan blender. Masing-masing daging
dan sampel dimasukkan ke dalam mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600
μlNuclei Lysis Solution. Masing-masing campuran tersebut dihomogenkan selama 10 detik
kemudian diinkubasi pada suhu 650C selama 30 menit.
2. Degradasi RNA dan Presipitasi Protein
Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3 μl larutan RNAse lalu
diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 200
μlProtein Precipitation Solution dan divortex, kemudian didiamkan dalam ice selama 5
menit lalu disentrifugasi dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit.
3. Presipitasi dan Pelarutan DNA
Supernatan yang terbentuk ditambahkan 600 μl isopropanol kemudiandihomogenkan lalu
disentrifugasidengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Endapan yang terbentuk
ditambahkan 600 μl etanol 70% kemudian dihomogenkan lalu disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan etanol
70% lalu endapan di keringkan selama 15 menit kemudian ditambahkan 100
μlDNARehydration Solution, selanjutnya didiamkan selama 1 jam pada suhu 650C dan
disimpan pada suhu 40C.
 BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Hasil Isolasi Konsentrasi dan Kemurnian DNA

Konsentrasi Kemurnian
No Isolat DNA
(ng/µl) (A260/A280)
Daging Segar
1. Daging Sapi 28,563 1,64
2. Daging Babi 76,635 1,49
Sampel Bakso
1. Bakso AW 8 30,810 1,68
2. Bakso BB 9 167,235 1,59
3. Bakso CR 10 33,659 1,61
4. Bakso WL 11 29,742 1,62
5. Bakso GN 12 10,580 1,60
6. Bakso R 13 33,462 1,65
7. Bakso WS 14 34,350 1,59

4.2 Pembahasan

Isolasi DNA dilakukan dari gelatin babi dan sapi dengan cara mengekstraksi nya. Metode
yang dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan menggunakan kit komersial High Pure PCR Template
preparation (Roche) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). Prinsip metode
tersebut inti nya sama yaitu penghancuran membrane sel (cell lysis) pemurniaan sel debris dan
protein (purifikasi) dan presipitasi DNA (Muladno, 2010 dan Roche, 2007).

Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation terdiri dari lima larutan yang terpisah
dan memiliki spesifikasi masing-masing prinsip dari kit ini adalah DNA sampel di absorpsi oleh
Silikon Dioksida (SiO2) yang terdapat dalam filter tube dan selama pencucian dan pemusingan
DNA tetap terikat dengan fiber glass sehingga ini dapat meminimalisir kehilangan DNA pada saat
isolasi DNA (Izzah, 2014 dan Roche, 2007).

Metode isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation dengan
mengalami modifikasi pada jumlah volume penggunaan Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, dan
Proteinase K. peningkatan jumlah volume penggunaan bahan tersebut berdasarkan arahan dari
protokol kit Roche apabila dalam penggunaan prosedur isolasi tidak memberikan hasil yang
memuaskan. Modifikasi pada penggunaan bahan tersbut di dasarkan pada peran masing-masing
yaitu Tissue Lysis Buffer sebagai penghancur membrane sel di karenakan ada nya EDTA sehingga
dengan penambahan jumlah penggunanya maka semakin besar sel yang hancur akibatnya semakin
banyak pula DNA yang keluar dari sel, Binding Buffer berperan dalam ikatan DNA dan silicon
dioksida sehingga dengan menambahkan jumlah volume pemakaiannya maka semakin banyak
DNA yang terikat kuat, dan proteinase K yang mermpunyai peran untuk menghilangkan protein
sehingga dengan begitu ketika jumlah proteinase K ditingkatkan maka jumlah kontaminan protein
dalam isolate DNA semakin kecil.

Keunggulan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation adalah
sederhana dan ekonomis. Dikatakan sederhana karena dalam pengerjaannya tidak rumit (proses
presipitasi dihilangkan) dan aman (resiko terpapar bahan toksik dapat dihindari seperti tidak
adanya kloroform dan deterjen). Metode ini juga relative ekonomis karena tidak membutuhkan
banyak pelarut namun kandungannya lengkap yang menjadi kelemahan dari metode ini adalah
relatif lama dalam pengerjaan nya karena waktu proses lisis sel yang dilakukan overnight dan
hanya dapat digunakan untuk beberapa reaksi saja.

Hasil isolate DNA kemudian dianalisis nilai kemurnian dan konsentrasinya menggunakan
spektrofotometri UV DeNovix yang memiliki limit deteksi 10 pg/µl (DeNovix, 2018). Analisis
tersebut dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dimana DNA dapat menyerap
cahaya UV pada panjang gelombang 260 nm dan kontaminan protein akan menyerap pada panjang
gelombang 280 nm (Fatchiyah et al., 2011), dari kedua nilai tersebut akan didapat rasio angka
yang menunjukkan kemurnian DNA terhadap protein. Isolat DNA murni dikatakan murni apabila
nilai kemurniannya antara 1,8-2,0 untuk A260/280 (Sambrook J, 2006).

Hasil analisis DNA daging sapi yang diperoleh yaitu konsentrasi sebesar 28,563 ng/µl
dengan kemurnian 1,64 dan daging babi yaitu konsetrasi sebesar 76,635 ng/µl dengan kemurnian
1,49. Kemudian, konsentrasi sampel bakso yang diperoleh berturut-turut yaitu 30,810 ng/µl (bakso
8); 167,235 ng/µl (bakso 9); 33,659 ng/µl (bakso 10); 29,742 ng/µl (bakso 11); 10,580 (bakso 12);
33,462 ng/µl (bakso 13) dan 34,350 ng/µl (bakso 14). Terdapat perbedaan konsentrasi yang
berbeda-beda. Selanjutnya nilai kemurnian berturut-turut yaitu 1,68 (bakso 8); 1,59 (bakso 9); 1,61
(bakso 10); 1,62 (bakso 11); 1,60 (bakso 12); 1,65 (bakso 13) dan 1,59 (bakso 14).

Hasil pengukuran nilai kemurnian tersebut, menunjukkan bahwa isolate DNA daging sapi,
daging babi dan sampel bakso masih terkandung pengotor lain yang ditunjukkan dengan hasil nilai
rasio A260/A280 yaitu dibawah 1,8. Hal tersebut, dapat disebabkan oleh beberapa factor, seperti
perubahan pH dalam larutan sampel DNA yang akan menghasilkan rasio kemurnian bervariasi
(NanoDrop, 2007) dan kemungkinan karena proses pencucian menggunakan isopropanol
(Akhmad, 2016). Namun, hasil isolate DNA tersebut yang memiliki nilai diatas 1,0 masih dapat
diterima dan dilanjutkan ke proses menggunakan real-time PCR (Kusumadewi et al., 2012).
 BAB V

KESIMPULAN

1. Prinsip menggunakan metode kit komersial High Pure PCR Template preparation (Roche)
dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yaitu penghancuran membrane
sel (cell lysis) pemurniaan sel debris dan protein (purifikasi) dan presipitasi DNA.
2. Keunggulan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation adalah
sederhana, pengerjaannya tidak rumit dan aman serta ekonomis karena tidak membutuhkan
banyak pelarut.
3. kelemahan dari metode ini adalah relatif lama dalam pengerjaan nya karena waktu proses
lisis sel yang dilakukan overnight dan hanya dapat digunakan untuk beberapa reaksi saja.
4. konsentrasi sampel bakso yang diperoleh berturut-turut yaitu 30,810 ng/µl (bakso 8);
167,235 ng/µl (bakso 9); 33,659 ng/µl (bakso 10); 29,742 ng/µl (bakso 11); 10,580 (bakso
12); 33,462 ng/µl (bakso 13) dan 34,350 ng/µl (bakso 14).
5. nilai kemurnian yang diperoleh berturut-turut yaitu 1,68 (bakso 8); 1,59 (bakso 9); 1,61
(bakso 10); 1,62 (bakso 11); 1,60 (bakso 12); 1,65 (bakso 13) dan 1,59 (bakso 14).
6. isolate DNA daging sapi, daging babi dan sampel bakso masih terkandung pengotor lain
yang ditunjukkan dengan hasil nilai rasio A260/A280 yaitu dibawah 1,8. Namun, hasil
isolate DNA tersebut yang memiliki nilai diatas 1,0 masih dapat diterima dan dilanjutkan
ke proses menggunakan real-time PCR
 DAFTAR PUSTAKA

Akhmad, M. A. 2016. Pengembangan Analisis Listeria monocytogenes untuk Jajanan Pempek

dengan Real-time PCR. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Fatchiyah. 2011. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Izzah, A.N. (2014). Perbandingan antara metode SYBR Green dan Metode Hydrolisis Probe
dalam Analisis DNA gelatin sapi dan babi dengan menggunakan real-time PCR.
Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.

Kusumadewi. 2013. Analisis DNA Jaringan Lunak Manusia yang Terpapar Formalin dalam
Interval Waktu 1 Bulan Selama 6 Bulan pada Lokus D13S317 dengan Metode STR-
PCR. Surabaya: JBP Vol. 14 No. 2:115-121.

Maftuchah., Winaya, A., Zainudin, A. 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi Molekular.
Sleman: Deepublish Publisher.
Muladno, (2010). Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi kedua. Bogor: IPB press

NanoDrop. 2007. ND-1000 Spectrophotometer V3.5 User’s Manual.

Nugrohi, E.D., Dwi, A.R. 2017. Pengantar Bioteknologi (Teori dan Aplikasi). Ed. 1, Cet.1.
Yogyakarta: Deepublish
Radji, M. 2011. Rekayasa Genetika. Jakarta: ISBN: 978-602-8674-40-9

Rahmawati, Putri. (2012). Analisis cemaran babi pada produk dendeng sapi yang beredar
diwilayah ciputat dengan menggunakan metode amplifikasi DNA menggunakan real-
time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Sambrook, J. 2006. The Condensed Protocols from Molecular Cloning: a Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.