Aplikasi PCR untuk:

Identiffikasi Bakteri Indigenous Pereduksi Logam Berat Cr (VII) Dengan

Metode Molekuler di Sungai Cikijing Rancaekek, Jawa Barat

Bahan:
 Sampel bakteri diperoleh dari Sedimen dan Air dari Sungai Cikijing
Rancaekek Kabupaten Bandung Jawa Barat.
 Untuk Kultifasi/ Isolasi Bakteri:
- Aquades steril
- NaCl fisiologis
- Media Nutrien Agar
- Media Nurien Agar yang diperkaya K2CrO4 0,2 mg/L
 Untuk Tantang Bakteri Trehadap Logam Berat:
- Medium Cair Nutrien Broth (NB) yang telah diperkya K 2CrO4 dengan
konsentrasi masing-masing 50,150, 500, 1000, dan 1500 ppm.
 Untuk Uji Reduksi Bakteri:
- Medium Cair Nutrien Broth (NB) yang telah diperkya K 2CrO4 dengan
konsentrasi masing-masing 300,700, dan 1000 rpm.
- Kompleks Cr dari supernatan dengan komposisi:
 12,5 ml Aquades Ph 3
 250 µL Larutan Diphenil Charbazida 1g/400ml aseton
 Sampel yang sesuai dengan faktor pengenceran
 Untuk Identifikasi Molekuler dengan Primer 16S Rrna
Isolasi DNA Genom Bakeri:
- Hasil kultur Uji Reduksi Bakteri
- Larutan I (resuspension solution)
- Larutan II (lyis solution)
- Larutan III (neutralizing solution)
- Ethanol absolute
- Buffer TE
Amplifikasi DNA dengan PCR:
- Pimer 16S rRNA 9F (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG)
- Primer 1492R (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT)
- Komponen reaksi PCR:
 Nuclease Free Water 10,5 µL
 KAPA 2G FAST Master Mix 12,5 µL
 Primer forward
 Reverse @ 0,5 µL
 DNA template 1 µL
 Elektroforesis:
- EtBr
- Gel agarose 1% (bubuk agarosa 0,4 g dalam TBE 40ml (Thris-Borate
EDTA)
- 5 µL DNA hasil PCR
Analisis Bioinformatik:
- Tidak ada
Alat:
 Untuk Kultifasi/Isolasi Bakteri:
- Tabung reaksi
- Cawan petri
- Pipet Mohr
- Batang L
 Untuk Tantang Bakteri Trehadap Logam Berat:
- Inkobator shaker
- Spektrofotometer
 Untuk Uji Reduksi Bakteri:
- Inkobator shaker
- Sentrifuge
- Spektrofotometer
 Untuk Identifikasi Molekuler dengan Primer 16S Rrna
Isolasi DNA Genom Bakeri:
- Tabung Eppendorf
- Sentrifuge
- Vortex
- Microcentrifuge
- micropipette
- Tube
- Tip putih, kuning, biru
Amplifikasi DNA dengan PCR:
- Thermal Cycler
- Micropipette
- vort
Elektroforesis:
- Aparatus elektroforesis (tray, comb, chamber)
Analisis Bioinformatik:
- Perangkat Bioinformatik (bioedit)
Cara Kerja
Isolasi Sampel:
1. Siapkan alat dan bahan
2. Membuat pengenceran sampel pada tabung reaksi sampai 10 -4, 10-5, dan
10-6
3. Memindahkan 1ml biakan dari tabung pengencer ke atas media NA
ratakan dengan batang L, inkubasi pada suhu 300C selama 2-3 hari
4. Jika telah terlihat pertumbuhan bakteri, diambil single koloni secepatnya
dan goreskan/pindahkan kemedia NA yang baru
5. Jika telah terlihat pertumbuhan lanjutkan dengan pemurnian isolate
hingga benar-benar tidak ada isolate lain yang tumbuh
6. Setelah murni, Isolat dikultur dalam medium NA yang telah diperkaya
K2CrO4
7. Isolat diperkaya dalam media agar miring dan cawan petri untuk
dilakukan uji karakteristik isolat.

Uji Tantang Bakteri Terhadap Logam Berat:

1. Sampel isolat bakteri murni diinokulasikan dalam medium cair Nutrien
Broth (NB) yang telah diperkaya K2CrO4 dengan konsentrasi @ 50, 150,
500,1000, dan 1500 ppm
2. Inkubasi dalam incubator shaker selama 18 jam pada suhu 37 0C dengan
kecepatan 220 rpm
3. Masing-masing bakteri isolat diukur nilai OD dengan panjang gelombang
600nm pada spektrofotometer
4. Setelah diketahui ketahanan isolat terhadap logam berat berdasarkan
tingkat kepadatan, diambil yang tertinggi untuk dilanjut ke tahap uji
reduksi

Uji Reduksi Bakteri:

1. Isolat bakteri yang tahan Cr (VI), diinokulasi kedalam medium cair
Nutrien Broth (NB) yang telah diperkaya K2CrO4 dengan konsentrasi
300,700, dan 1000 ppm
2. Inkubasi dalam incubator shaker selama ±24 jam pada suhu 37 0C dengan
kecepatan 220 rpm
3. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit
4. Buat kompleks Cr dalam tabung reaksi dari supernatan dengan
komposisi: 12,5 ml Aquades Ph 3, 250 µL Larutan Diphenil Charbazida
1g/400ml aseton, Sampel yang sesuai dengan faktor pengenceran
5. Diukur absorbansi dalam spektrofotometer dengan panjang gelombang
540nm
6. Plotkan pada nilai kurva standar yang telah dibuat (y= 0,1057x + 0,0025)
7. Amati dan diperoleh beberapa isolate yang dapat mereduksi logam Cr,
lalu diteruskan identifikasi bakteri PCR dengan 16S rRNA
Identifikasi Molekuler dengan Primer 16S r RNA:
Isolasi DNA Genom Bakteri menggunakan metode Alkaline Lysis:
1. Setiap kultur dipindahkan kedalam tabung eppendorf 1,5 ml
2. Sentrifugasi selama 30 detik pada kecepatan 1200 rpm, buang
supernatannya
3. Tambahkan 100µL larutan I ke tiap tabung lalu diresuspensi dengan di
vortex
4. Tambahkan 200µL larutan II kedalm tiap tabung dicampur dengan cara
membolak balikkan tabung dan biarkan lisis terjadi selama 2-3 menit di
dalam es
5. Tambahkan 150µL larutan III ke tiap tabung (on ice) lalu divortex,
diamkan selama 3-5 menit didalam es
6. Sentrifugasi tabung dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit dalam
microcentrifuge
7. Ambil supernatan pindahkan kedalam tube baru ditambah ethanol
absolute 2x volume larutan alkalin lysis (± 900µL), lalu di vortex
8. Disentrifuge pada 12000 rpm selala 5 menit, buang supernatan
9. Tambahkan 1 ml etanol (EtOH) 70% dan sentrifugasi kembali selama 5
menit
10.Buang supernatannya dengan cara dibalikkan selama ±10 menit
11.Akan terlihat pelet DNA, keringkan lalu diresuspensi dalam 30 µL buffer
TE dan di-Flick kemudian disimpan pada suhu-200C

Amplifikasi DNA dengan PCR

1. Menggunakan primer 16S rRNA dan 1492R
2. Komponen reaksi PCR: Nuclease Free Water 10,5 µL, KAPA 2G FAST
Master Mix 12,5 µL, Primer forward , Reverse @ 0,5 µL, DNA template
1 µL
3. Pengaturan Program PCR: Pre-PCR (950C, 2 menit), denaturasi (950C, 30
detik), Annealing Primer (550C, 30 detik), Elongasi (750C, 1 menit), dan
post PCR (750C, 5 menit)
4. Jumlah siklus polimerisasi DNA sebanyak 30 kali

Elekrtoforesis:
1. Pembuatan gel agarosa 1%:
Mencampurkan bubuk agarosa sebanyak 0,4g dalam TBE 40 ml
(Thris-Borate EDTA)
Rendm gel agarose secara sub marine atau direndam seluruhnya dalam
running buffer (TBE)
2. Masukkan 5µL DNA hasil PCR dan penanda berat molekul kedlam
sumur-sumur gel
3. Gunakan Voltase 75 volt dengan kuat arus 100 mA selama 60 menit
Analisis Bioinformatik:
1. Didapat hsil Elektroforesis isolat DNA bakteri produk 16S r RNA
2. Lakukan purifikasi untuk mendapatkan sequencing DNA isolat bakteri
3. Analisis sequencing DNA dengan menggunakkan perangkat
bioinformatil(bioedit)
4. Cocokkan dengan data di NCBI melalui program BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool)

Hasil dan Pembahasan:

 Hasil Isolasi Bakteri

Dari kesepuluh isolat bakteri, terdiri dari 3 isolat yang bersumber dari
sampel air yaitu : A.3.4 ; A.2.1 dan A.3.3. Sedangkan sampel bakteri dari
sedimen berjumlah 7 isolat yaitu S.3.1.4 ; S.13.2.2 ; S.14.2 ; S.13.1.1 ; S.7.1 ;
S.143.1.1 dan s.13.2.1. Jumlah isolat dari sedimen lebih banyak dikarenakan
bakteri lebih banyak hidup pada substrat-substrat dari pada air yang lebih
cenderung mengalirkan bakteri
  Hasil Uji Tantang Bakteri Terhadap Cr (VI)

Hasil Optical Density (OD) menunjukkan tingkat kepadatan bakteri, nilai OD

600 nm isolat S.3.14 adalah yang terbesar yaitu 1,125 yang artinya isolat
tersebut tahan dan dapat beradaptasi terhadap konsentrasi 1500ppm, kemudian
OD A.3.3 ssebesar 0,366 ; dan OD A.2.1 sebesar 0,348.

 Hasil Uji Reduksi Bakteri Terhadap Cr (VI)

Pengurangan konsemtrasi Cr (VII) oleh bakteri pada tabel 3. Menunjukkan

bahwa isolat bakteri dari limbah tekstil efektif dalam menurunkan kada Cr
(VII). Dari hasil diatas terlihat bahwa presentase reduksi terbesar yaitu pada
bakteri A.3.3 yang bersumber dari air yaitu 314,56 ppm dengan presentase
reduksi 33,08% ; 799,4 ppm dengan presentase reduksi 89,94 % ; dan
1083,25 ppm dengan presentase reduksi rendah pada konsetrasi 314,56 ppm
yaitu 6,01%. Sedangkan konsentrasi yang lebih tinggi pada 799,4 ppm dan
1083,25 ppm memiliki presentase konsentrasi yang lebih besar yaitu 48,91%
dan 28,57%. Kemudian pada isolat bakteri dari sedimen yaitu S.3.14
cenderung lebih konstan daya reduksinya, ditunjukkan pada presentase
reduksi 314,56 ppm yaitu 28,57 %, dan 799,4 ppm presentasenya adalah
68.63 %, serta 1083,25 ppm hanya 20,96 %.
 Hasil Identifikasi Molekuler dengan Primer 16S r RNA:

Hasil akhir dari elektroforesis marker 1kb ladder menunjukkan pita DNA
kedua isolat bakteri A.3.3 dan S.3.14 berukuran 1500 bp.

 Hasil Analisis Bioinformatika

Gambar 2. Diatas merupakan hasil dari purifikasi yang menunjukkan pita

1500 bp pada kode DNA 1 yaitu isolat bakteri A.3.3 dan kode kode DNA 2
yaitu isolat bakteri S.3.14. Hasil purifikasi tersebut menunjukkan bahwa
produk PCR dapat dilanjutkan untuk sequencing.
 Analisis Bioinformatika
Data di www.ncbi.nih.nlm.gov melalui program BLAST menunjukkan
spesies bakteri untuk isolat A.3.3 adalah bacillus thuringiensisstrain IAM
12077 dengan nilai Query coverage 98 %. Sedangkan isolat S.3.14 adalah
Staphylococcus arlettae strain ATCC 43957dengan nilai query Coverage
99% dan keidentikan maksumim sebesar 96% (lampiran 7). Addinilia
(2012) menyatakan bahwa tingkat kesamaan nukleotida sekitar 80%
termasuk cukup tinggi.

Potensi Basillus thuringiensis  Potensi Staphylococcus

arlettae