Nama : Farhan Hidayatullah

NIM : 1607112170
Prodi : Teknik Kimia S1 A 16
Ringkasan Example 2.3 Pembuatan Plasminogen Jaringan Aktivator (tPA)
Dalam bidang farmasi, memikirkan produksi dari plasminogen activator,
yang mana merupakan enzim yang sangat kuat yang bisa memicu proteolytic
(memecah protein untuk membentuk zat yang lebih sederhana) degradasi
gumpalan darah yang menyebabkan stroke dan serangan jantung. Sejak
pertengahan 1980-an Genentech, perusahaan AS, telah memproduksi activator
plasminogen jaringan (PA), yang mereka jual seharga $2.000 per dosis 100 mg
pada awal 2000an, dengan penjualan tahunan $300 juta/tahun. Mengingat bahwa
paten mereka ditetapkan kadaluwarsa pada tahun 2003, Genentech
mengembangkan generasi baru, kunci makanan dan administrasi obat (FDA) yang
disetujui. Activator plasminogen disebut TNK-tPA, yang lebih mudah dan lebih
baik untuk digunakan oleh dokter. Dengan pasar yang berkembang cepat tim
perancangan merumuskan ada dua alternatif potensial:
Alternatif pertama: Bentuk generik tPA tidak dapat bersaing dengan
TNK-tPA di Amerika Serikat maka akan mungkin untuk memasarkan tPA generik
berbiaya rendah di pasar luar negeri.
Alternatif kedua: Mengingat kemungkinan bahwa penggantian biaya
perawatan kesehatan yang lebih rendah diterima oleh rumah sakit di Amerika
Serikat, mungkin masuk akal untuk mengembangkan proses serupa yang dapat
bersaing secara menguntungkan dengan TNK-tPA di Amerika Serikat.

Gambar 2.8 Skematik dari tPA

 Tissue Plasminogen Activator (tPA) adalah protein terapi rekombinan
yang terdiri dari 562 asam amino, seperti yang ditunjukkan secara skematis pada
Gambar 2.8. pada gambar tersebut tPA diproduksi menggunakan sel dari
rekombinasi gen. untuk menghilangkan gumpalan darah, tPA mengaktifkan
plasminogen menjadi plasmin, enzim yang melarutkan fibrin yang menahan
gumpalan darah ditempatnya. Dengan cara ini, aliran darah terbentuk kembali
setelah penyumbatan gumpalan larut, efek penting bagi pasien yang menderita
serangan jantung atau stroke. Contoh ini menunjukkan langkah-langkah dalam
mensintesis proses untuk mengatasi tantangan yang ditimbulkan oleh peluang
yang disarankan dalam alternatif 1: yaitu, untuk memproduksi bentuk-bentuk tPA
yang lebih murah yang dapat dijual seharga $200 per dosis 100 mg. Hal ini
mengarah pada proses batch yang melibatkan banyak unit proses kecil yang harus
dijadwalkan untuk memproduksi tPA, daripada proses berskala besar yang
berkesinambungan untuk membuat vinil klorida.

Gambar 2.9 Masalah Proses Sintesis

Pada gambar 2.9 ditunjukkan, tPA diproduksi menggunakan sel mamalia
yang memiliki tPA-DNA sebagai bagian dari konten genetik. Dalam operasi
bioreaksi aerobik, sel tPA-CHO tumbuh dalam media nutrisi, media HyQ PF-
CHO-Hyclone, campuran nutrisi, garam, asam amino, insulin. Factor
pertumbuhan, dan transferring, khusus untuk pertumbuhan sel CHO. Bahan-bahan
lain termasuk air steril, udara, dan CO2. Selain tPA, endotoksin dapat menjadi
kontaminan produk, yang harus dihilangkan karena mereka menimbulkan
berbagai peradangan tanggapan pada hewan. Produk samping lainnya termasuk
puing sel, air limbah, dan emisi gas, terutama N2 dari udara, O2 yang tidak
dikonsumsi dari udara, dan CO2, yang mengatur pH. Sumber data penting, di
Selain yang diambil di laboratorium biokimia, adalah paten A.S., diajukan oleh
Genentech (Goeddel et al., 1988).
Langkah 1 Hilangkan Perbedaan dalam Jenis Molekul: Dalam pembuatan
dari makromolekul seperti tPA melalui pertumbuhan sel, serangkaian reaksi kimia
yang kompleks sering diperkirakan oleh reaksi global yang dipahami jauh lebih
sedikit daripada reaksi yang jelas untuk pembuatan sederhana monomer, seperti
vinil klorida. Dalam hal reaksi global terhadap pembuatan tPA, dua jalur reaksi
utama disediakan oleh ahli biokimia, sebagai berikut.
1. Sel mamalia. Ke dalam sel CHO, tPA-DNA urutan harus dimasukkan dan
diekspresikan. Hasilnya sel tPA-CHO adalah sel CHO yang dipilih secara khusus
banyak salinan tPA-DNA yang dimasukkan ke dalam genomnya, dan yang
mengeluarkan tPA tingkat tinggi. Penyisipan tPA-DNA ini langkah dirangkum
dalam reaksi:
tPA - DNA urutan + sel CHO tPA dengan ekspresi tertinggi - sel
CHO

Produk dari "persiapan katalis" ini adalah stok induk sel tPA-CHO, yang
disiapkan di laboratorium dan disimpan dalam 1-mL alikuot pada –70∘C untuk
digunakan sebagai inokulum bioreaksi:
tPA – sel CHO +HyQPF – media CHO + O2 Jumlah sel meningkat
Sebagai sel tumbuh dalam budidaya aerobik ini pada tingkat 0,39 × 106
sel ∕ (ml-hari), oksigen dari udara dikonsumsi pada laju 0,2 × 10-12 mol O2 ∕ (sel-
jam), dan tPA diproduksi pada tingkat 50 pikogram tPA ∕ (sel-hari). Yang terakhir
disekresikan secara bertahap ke dalam larutan media cair. Catatan reaksi itu (2,8)
dilakukan sekali selama penelitian dan fase pengembangan. Awalnya, 1–10 mg
tPA-DNA ditambahkan ke 106 sel untuk menghasilkan beberapa sel tPA-CHO
dalam banyak sel CHO yang tidak dimodifikasi. Setelah pemilihan yang cermat,
satu sel tPA-CHO (sel "pendiri") dipilih dan diamplifikasi untuk menghasilkan
sekitar 2 × 106 sel ∕ mL dalam 10-100 L. Sel-sel ini dibekukan dalam alikuot.
2. Sel Bakteri. Alternatif yang menjanjikan adalah memasukkan Urutan tPA-
DNA ke dalam genom Escherichia coli (E. coli) sel, seperti yang dirangkum oleh
reaksi:
tPA - Urutan DNA + sel E.coli → tPA berekspresi tinggi yang dipilih - Sel E. coli
Kemudian, tPA-E. sel bakteri coli, yang tumbuh di laboratorium, dibekukan
dalam alikuol pada –70∘C untuk digunakan sebagai inokulum untuk reaksi
fermentasi:
tPA - sel E. coli + media serbuk + O2 → peningkatan jumlah sel
Fermentasi batch tPA – E. coli dapat menghasilkan 5–50 mg tPA / L-kaldu saat
panen. Escherichia coli mungkin diperlukan gangguan untuk melepaskan tPA,
yang kemudian lebih sulit terpisah. Haruskah suatu proses disintesis berdasarkan
ini jalur reaksi, data laju reaksi dari laboratorium akan dibutuhkan. Tidak seperti
sel CHO, sel E. coli tidak menambahkan gula kelompok (glikosilasi) menjadi tPA.
Seperti sel CHO, tPA-E. sel coli diproduksi dan dibekukan selama penelitian dan
fase pengembangan.

Gambar 2.10 Operasi reaksi menggunakan sel mamalia CHO

Kembali ke jalur reaksi dengan sel CHO, menggunakan data laboratorium,
operasi reaksi dimasukkan ke dalam flowheet, seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 2.10. Pada tingkat produksi 80 kg/tahun tPA, lab melaporkan bahwa
bahan-bahan berikut dikonsumsi dan produk limbah diproduksi:
Bahan-bahan kg/tahun Limbah kg/tahun
Sel tPA-CHO Small Endotoxin 0.155

HyQ PF-CHO media 22,975 Sel Debris 22,896

Air 178,250 Air Limbah 178,250

Udara 1,604 Emisi Gas 4,036

(N2, O2, CO2)

CO2 296
Tabel 2.5 Asumsi Biaya dari Produksi Kimia atau yang Penjualan
Kimia kg/kg tPA Limbah
tPA 1 2,000,000

HyQ PF-CHO media bubuk 287.2 233

Air untuk Injeksi 2,228 0,12

Udara 20.1 1,742

CO2 3,7 1,447

Sel tPA-CHO - -

Operasi reaksi menyediakan sink untuk sel tPA-CHO dari penyimpanan

dingin pada –70∘C, dan media HyQ PF-CHO dalam air, udara, dan karbon
dioksida. Efluennya merupakan sumber tPA, di 122 kg tahun, endotoksin, puing-
puing sel, air, nitrogen, dan karbondioksida. Ketika dipisahkan, spesies ini adalah
sumber untuk produk tenggelam dari lembar alur. Perhatikan bahwa gabungan
pertumbuhan sel dan operasi produksi tPA berlangsung pada suhu 37∘C, 1 atm,
dan pH = 7.3. Yang terakhir dicapai oleh NaHCO3 di media bubuk, dengan fine-
tuning oleh manipulasi laju aliran CO2.
Sebelum menerima jalur reaksi potensial, penting untuk memeriksa
potensi ekonomi, yaitu perbedaannya antara pendapatan penjualan dan biaya
bahan. Untuk mencapai ini, harga jual tPA diproyeksikan (mis., $ 200 per dosis
100 mg), dan biaya bahan diproyeksikan, dengan perkiraan sering diperoleh dari
pemasok. Daftar perkiraan biaya biasanya ditunjukkan pada Tabel 2.5. Biaya air
untuk injeksi (WFI) didasarkan berdasarkan perkiraan biaya sterilisasi air kota (12
sen ∕ kg = 45 sen ∕ gal = 450 ∕ 1.000 gal, yang jauh lebih tinggi dari biaya khas air
proses = $ 0,80 ∕1, 000 gal). Biaya udara dan karbon dioksida yang disterilkan
adalah untuk silinder industri gas terkompresi. Biaya dari sel tPA-CHO tidak
termasuk, karena dikaitkan dengan biaya penelitian, yang selanjutnya
diperkirakan sebagai biaya operasional.
Menggunakan biaya ini, potensi ekonomi atau EP di estimasikan:
EP=2,000,000−287.2× 233−2.228 × 0.12−3.7 ×1,447−201.1× 1,742=$ 1,892,000/kgtPA
 Jelas, ini sangat tinggi untuk tPA, sejenis obat-obatan. Namun, potensi
ekonomi tidak memperhitungkan biaya operasi, yang meliputi biaya penelitian,
biaya utilitas, dan biaya investasi, dan tinggi untuk pemisahan yang melibatkan
agen pemisah massa yang mahal. Dengan potensi ekonomi yang menjanjikan,
hasil proses sintesis dengan kecepatan yang dipercepat.
Langkah 2 Mendistribusikan Bahan Kimia: Pada langkah ini, sumber dan
tenggelam untuk setiap spesies pada Gambar 2.10 dicocokkan sehingga total laju
aliran massa ke dalam operasi reaksi sama dengan aliran massa beri peringkat. Ini
sering memerlukan pengenalan operasi pencampuran, seperti yang diilustrasikan
dalam contoh sebelumnya untuk vinil klorida. Dalam hal ini, hanya satu operasi
pencampuran yang diperkenalkan, dimana media bubuk HyQ PF-CHO dicampur
dengan air, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.11. Jika tidak, sumber dan
bak cuci adalah cocok secara langsung. Namun, efluen dari pertumbuhan sel,
reaktor produksi tPA harus dipisahkan sebelum spesiesnya cocok dengan sink
produk.

Gambar 2.11 Flowsheet yang menunjukkan distribusi dari kimia untuk proses
tPA
 Gambar 2.12 Flowsheet operasi pemisahan dari proses tPA

Langkah 3 Hilangkan Perbedaan dalam Komposisi: Untuk sebagian besar

distribusi bahan kimia, ada perbedaan komposisi antara aliran dipisahkan dan
tenggelam ke mana spesies ini terkirim. Jelas, pada Gambar 2.11, efluen dari sel
pertumbuhan, reaktor produksi tPA harus dipisahkan. Ada banyak kemungkinan
sistem pemisahan, dengan satu disediakan pada Gambar 2.12. Di sini, limbah
reaktor dikirim ke pemisah untuk pemulihan emisi gas dari campuran cair, dengan
yang terakhir dikirim ke centrifuge untuk menghilangkan puing sel basah dari
media panen atau kaldu yang diklarifikasi. Perhatikan itu karena protein
kehilangan aktivitas mereka pada suhu di atas ∼0OC, itu centrifuge, dan semua
operasi pemisahan lainnya, dioperasikan di 4OC, sedikit di atas titik beku air.
Panen media dicampur dengan arginin hidroklorida, asam amino:

yang mencegah tPA dari agregasi diri. Catat itu 45.870 kg / tahun menyediakan
konsentrasi 2,0 molar, yaitu cukup untuk mencegah agregasi.
 Campuran yang dihasilkan dikirim ke microfilters untuk dihilangkan
sejumlah besar air limbah, yang melewati filter. Untuk langkah ini, pemisah
alternatif, seperti filtrasi gel dan resin Acticlean Etox (oleh Sterogene), harus
dipertimbangkan. Retentate dari filter, yang berisi tPA, protein lain, endotoksin,
arginin hidroklorida, dan beberapa lainnya air, dikirim ke operasi kromatografi
afinitas. Sini, tPA secara selektif teradsorpsi pada resin (mis., diaktifkan-CNBr
Sepharose, oleh Amersham Biotech). Resin kemudian dielusi dengan glisin, asam
amino asetat:

Dari pengukuran laboratorium, 575 kg / tahun glisin sudah cukup untuk

proses elusi. Setelah kolom dielusi, itu diseimbangkan dengan campuran 289,5
kg/tahun buffer fosfat solusi (PBS) dan 1.403,0 kg ∕ tahun NaCl, dengan jumlah
ditentukan di lab.
Solusi tPA yang dihasilkan dikirim ke penghapusan endotoksin kolom di
mana endotoksin diserap secara selektif resin (mis., Acticlean Etox oleh
Sterogene). Kolom ini dicuci dengan campuran 364,8 kg ∕ tahun NaOH dan 9.235
kg air per tahun untuk menghilangkan endotoksin. Limbah cair stream disaring
mikro untuk menghilangkan puing-puing sel yang tidak melewati filter.
Kemudian, air limbah dibuang di operasi pengeringan beku untuk menyediakan
tPA dalam bentuk bubuk.
Langkah 4 Hilangkan Perbedaan Suhu, Tekanan, dan Fase: Dalam
pembuatan tPA, bahannya adalah diasumsikan tersedia pada 20OC, air dicampur
dengan HyQ PF-CHO serbuk media pada 4OC, budidaya (produksi sel operasi)
terjadi pada 37OC, dan pemisahan terjadi pada 4OC. Panas eksotermik dari
kultivasi dihilangkan di 37OC. Hanya perubahan tekanan kecil terjadi dan dapat
diabaikan pada tahap sintesis proses ini. Demikian pula, tidak ada fase-perubahan
operasi ditambahkan ke lembar alir. Karenanya, hanya sedikit operasi perubahan
suhu ditambahkan pada Gambar 2.12, dengan lembar kerja yang dihasilkan
ditunjukkan pada Gambar 2.13.
 Gambar 2.13 Flowsheet dengan operasi perubahan suhu dalam tPA proses.
Langkah 5 Tugas Integrasi: Pada tahap ini dalam sintesis, berbagai item
peralatan dipilih, sering menggabungkan dua atau lebih operasi yang berdekatan
menjadi item peralatan tunggal; yaitu di integrasi tugas. Keputusan kunci pertama
melibatkan apakah akan beroperasi dalam mode kontinu atau batch. Untuk
throughput kecil, seperti 80 kg tahun tPA, keputusannya hampir selalu beroperasi
dalam mode batch. Pilihan ukuran batch dan peralatan, dan waktu batch, biasanya
didasarkan pada operasi paling lambat, biasanya proses budidaya (atau
fermentasi). Untuk tPA, itu ditentukan dengan menggunakan tingkat pertumbuhan
eksperimental tPA-CHO sel [0,39 × 106sel ∕ (mL-hari)], sel inlet dan outlet
konsentrasi, dan tingkat eksperimental pertumbuhan tPA [50 pg tPA ∕ (hari sel)],
di mana pg ≡ pikogram ≡ 10-12 g. Satu pendekatan diperlihatkan selanjutnya
dalam Sub-Contoh 2.3.1.

Sub-Contoh 2.3.1 Estimasi Waktu Batch dan Ukuran Vesel

Untuk hampir semua budidaya sel, banyak pembudidaya diperlukan.
Seperti yang ditunjukkan pada Langkah 1 dari sintesis proses ini, 1 L inokulum
ditanam di laboratorium, mengandung sel tPA-CHO di 2 × 106sel ∕ mL.
Selanjutnya, sel diencerkan dan tumbuh secara progresif kapal yang lebih besar.
Di setiap kapal, mereka diencerkan ke konsentrasi di luar itu tingkat pertumbuhan
eksperimental dapat dicapai sel tPA-CHO, pada urutan 105 sel ∕ mL. Lalu mereka
diizinkan tumbuh pada konsentrasi yang dibatasi oleh kepadatan berlebih, pada
urutan 3 × 106sel ∕ mL untuk sel tPA-CHO. Seperti yang akan ditampilkan dalam
integrasi tugas ini, pembudidaya terakhir menghasilkan hampir semua produk
tPA. Konsekuensinya, itulah basisnya untuk pemilihan ukuran batch dan
peralatan, dan waktu batch. Untuk konsentrasi pembatas tipikal
cmin = 2 × 105 sel ∕ mL
cmax = 3 × 106 sel ∕ mL
waktu budidaya diperkirakan:
10 6 cell 105 cell
3× −2 ×
mL mL
6
=7.2hari ≅ 7 hari
10 cell
0.39 ×
mL
Menambah 7 hari untuk memuat, membersihkan, dan mensterilkan kapal,
total 14 hari diperlukan. Selanjutnya, 50 batch setiap tahun diasumsikan. Pada dua
minggu per batch, dua kapal batch yang beroperasi secara paralel diperlukan;
bahwa adalah, dua kereta batch, masing-masing memproduksi 25 batch per tahun
dibutuhkan. Untuk menghasilkan 80 kg tPA ∕ tahun, ukuran batch adalah:
80 kg tPA kg tPA
=1.6
50 batch batch
Diperlukan satu asumsi terakhir. Di awal desain, sebelum rincian kereta
pemisah dipertimbangkan, 40% kehilangan tPA diasumsikan dalam operasi
pemisahan. Karenanya, 1,6×1,4 = 2,24 kg∕batch harus diproduksi dalam budidaya.
Akhirnya, pada konsentrasi rata-rata (2×105+3×106)∕2 sel∕mL = 1,6×106
sel∕mL, pertumbuhan tPA per batch adalah:
gtPA 6 cell pgtPA 1 gtPA
2,240 =V ×1.6 ×10 ×50 × 12 ×7 hari
batch mL cell−day 10 pgtPA
di mana V adalah volume batch dalam pembudidaya ketiga. Didapat, V =
4×106 mL∕batch = 4.000 L∕batch. Untuk tujuan ini, 5.000 L kapal konvensional
digunakan.

Sub-Contoh 2.3.2 Pertumbuhan Inokulum di Laboratorium

Setelah 1-mL alikuot dicairkan dan ditambahkan ke kultivator 1-L, itu
diencerkan ke konsentrasi:
1mL cell cell
1,000 mL (
× 2 ×106
mL )
=2 ×103
mL
Kemudian, waktu batch lab-pembudidaya adalah:
 cell cell
2× 106 −2× 103
mL mL
=5.12 hari ≅ 5 hari
6 cell
0.39 ×10
mL−day
dan pertumbuhan tPA adalah:
gtPA cell pgtPA 1 pgtPA
0.25 =1,000 mL × 106 ×50 × 12 ×5 hari
batch mL cell−day 10 pgtPA
sebagian kecil dari pertumbuhan tPA di seluruh proses budidaya.
Perhatikan bahwa ke labu 1-L, media HyQ PF-CHO ditambahkan, bersama
dengan air ultra-murni, udara, dan CO2, untuk menghasilkan 1,2 kg in batch
inokulum.

POHON SINTESIS
Untuk proses tPA, skema pohon sintesis ditunjukkan pada Gambar 2.14.
Dalam sintesis desain, insinyur berusaha untuk mengidentifikasi yang paling
menjanjikan, menghilangkan alternatif yang paling tidak menjanjikan dengan
inspeksi, sedapat mungkin. Awalnya, aturan heuristik membantu untuk membuat
pilihan. Akhirnya, metode algoritmik yang melibatkan optimisasi dapat
diperkenalkan untuk memeriksa heuristik dan mengidentifikasi alternatif yang
lebih menjanjikan. Namun, harus ditekankan bahwa jendela desain, dimulai
selama Fase 1 dan 2 dari uji klinis, kecil, biasanya dalam urutan 12-16 bulan,
sebelum Fase 3 dimulai. Akibatnya, penekanan biasanya ditempatkan pada
perkembangan yang cepat dari desain, dan kurang pada optimasi desain.
Dinyatakan berbeda, untuk obat-obatan mahal, itu jauh lebih penting menjadi
yang pertama memasarkan daripada mencapai penghematan yang relatif kecil di
investasi modal atau biaya operasi untuk pabrik melalui desain optimasi.
Gambar 2.14 Pohon sintesis terbalik untuk produksi tPA.