PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bakteri  mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas.

Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain

mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan

kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam

kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka

dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah

satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal

itu untuk mempernudah proses identifikasi  bakteri.

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi

mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan

atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram.

Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak

digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat

diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan

sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris

untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram

positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel

mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan

denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua

yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 2

zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu

mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat

digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.

Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri

dapat berupa melihat morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi

bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni,dll. Semantara uji

biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya. Oleh

karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan

bakteri, morfologi koloni, dan uji biokimia sehingga dapat mempernudah

untuk isdentifikasi bakteri.

B. Rumusan Malasah

Adapun maksud dari praktikum ini adalah bagaimana melakukan

beberapa metode untuk pengecatan mikroba.

C. Maksud Praktikum

Adapun maksud dari praktikum ini adalah untuk mengetahui dan

memahami cara pewarnaan dan mengetahui morfologi bakteri dengan

menggunakan metode pengecatan sederhana, pengecatan negative dan

pengecatan gram.

D. Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui dan

memahami cara pewarnaan dan mengetahui morfologi bakteri dengan

menggunakan metode pengecatan sederhana, pengecatan negative dan

pengecatan gram.

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 3

E. Manfaat Praktikum

Adapun manfaat dari praktikum ini adalah dapat mengetahui cara

pewarnaan bakteri dengan metode pengecatan negatif, sederhana, dan

gram serta mengamati morfologi bakteri-bakteri tersebut agar dapat

membedakan bakteri gram positif dan negatif.

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 4

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

A. Teori Umum

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri

dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat

struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,

menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan

zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan

sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan

menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial

dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-

jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna

pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan

pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan

perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba

disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga

macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan

pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad

renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada

lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan

sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 5

sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan

diferensial (Pelczar & Chan, 2007).

Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua

golongan, yaitu: Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol

gentian violet) tetap bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak

ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna pertama  tidak

bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal:

air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya (Razali,

2007).

Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan

Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini,

berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan

ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting;

dinding sel bakteri Gram negatif  pada umumnnya lebih tipis dari yang

dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram

negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam

eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol

mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas

didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet

dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan.

Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan

permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram

negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan

jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 6

peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat

disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-

sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding

selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding

akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi,

sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa

struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat

tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali,

2007).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara

komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang

disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik

baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam

metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial

dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna

tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna

atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling

umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion

negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat

basa, warna terdapat pada ion positif (zat pewarna + Cl-) dan pada

pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna - Na+).

Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol

disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 7

dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif

dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna

basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna

basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh

muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat

pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar

belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang

yang berwarna (Volk, 2003).

Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri

terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram

positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang

dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar,

berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas.

Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci

tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila

komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan

tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna

dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna

pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan

terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang

biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin

(Volk, 2003).

Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi

pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 8

pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat

pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna.

Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama

pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga

menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki

dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan

sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan

bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga

memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram

terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat,

Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C

(Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades)

(Madigan, 2003).

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan

sebagai berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial

(pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk

melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan

kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri

(pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula

glikogen) dan  pewarnaan negatif  (Madigan, 2003).

Memurut Pelezar and Chan, 2007 secra morfologi sel bakteri

mempunyai bagian-bagian sebagai berikut:

1. Kapsul : lapisan tebal dari lendir yang membungkus sel. Fungsi

kapsul adalah melindungi sel dari kondisi lingkungan yang tidak

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
PENGECATAN MIKROOGANISMEPage | 9

menguntungkan sebagai sarana pengikat antar sel satu dengan yang

lainnya. Kapsul berhubungan dengan sifat patogenitas dimana

bakteri yang berkapsul biasanya bersifat patogen akan hilang/

berkurang. Hal ini terjadi karena kapsul melindungi bakteri dari dari

sistem imun tubuh, sehingga ketika bakteri masuk ke tubuh hospes,

sistem imun tubuh tidak mampu lelawan bakteri (Pelezar, 2007).

2. Dinding sel : bagian sel yang membungkus isi sel, terletak antara

kapsul dan membran sitoplasma dengan struktur sangat kaku. Tebal

sel 10-35mm. Fungsi dindiing sel adalah pelindung sel dari tekanan

osmosis, memberi bentuk pada sel, dan berperann dalam reproduksi

(Pelezar, 2007).

3. Membran sel/sitoplasma : lapisan tipis yang bersifat permiabel,

fungsinya untuk mengatur zat-zat masuk dan keluar sel (Pelezar,

2007).

4. Pili : benang-benag halus yang keluar dari dinding sel (seperti

filamen tetapi bukan flagela).Jumlah pili lebih banyak, lebih pendek,

dan lebih kecil dari flagella (Pelezar, 2007).

5. Flagela : alat gerak dari bakteri terdiri dari rambut tipis yang mencuat

menembus dinding sel dan bermula dari dasar tubuh, merupakan

suatu struktur granular yang tepat dibawah membran sel dalam

sitoplasma. Flagela terdiri dari tiga bagian yaitu tubuh dasar, struktur

seperti kait dan sehellai filamen panjang di luar dinding sel. Panjang

flagel: beberapa kali panjang sel, namun diameternya lebih kecil

daripada diameter ssel (10-20) (Pelezar, 2007).

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 10
PENGECATAN MIKROOGANISME

6. Kromoson : merupakan pembawa sifat yang diturunkan pada sel

anakan (Pelezar, 2007).

7. Krommosom : bakteri tidak terbentuk membran (DNA telanjang),

biasanya terdiri dari satu sel DNA yang sirkuler (Pelezar, 2007).

8. Plasmit : bahan genetk tambahan yang bersifat otonom (Pelezar,

2007).

9. Ribosom : tempat sintesis protein (Pelezar, 2007).

B. Uraian Bahan

1. Alkohol (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Aethanolum

Nama lain : Etanol/Alkohol

Pemerian : Cairan tak berwarna, jernih, mudah menguap dan

mudah bergerak; bau khas; rasa panas. Mudah

terbakar dengan memberikan nyala biru yang tidak

berasap.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya;

di tempat sejuk, jauh dari nyala api.

Kegunaan : Sebagai pembersih dan sebagai gram C pada

pengecatan gram.

2. Air suling (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Aqua Destillata

Nama lain : Air suling/aquadest

RM/BM : H2O/18,02

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 11
PENGECATAN MIKROOGANISME

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, dan

tidak mempunyai rasa

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai pembilas.

3. Aseton (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Aseton

RM : (CH3)2CO

Pemerian : Cairan jernih tidak berwarna, mudah menguap, bau

khas, mudah terbakar

Kelarutan : Mudah bercampur dengan air, dalam etanol

(95%) P, dengan eter P

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai komposisi cat C.

4. Amonium Okslat (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Amonium oksalat

Pemerian : Serbuk hablur atau hablur butiran; putih

Kelarutan : Larut dalam air

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai komposisi cat A.

5. Kristal Violet (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Kristal violet

Pemerian : Hablur berwarna hijau tua

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 12
PENGECATAN MIKROOGANISME

Kelarutan : Sukar larut dalam air; agak sukar larut dalam etanol

(95%) P dan dalam asam asetat glasial P.

Larutannya berwarna lembayung tua

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai cat utama atau gram A dalam pengecatan

gram

6. Iodium (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Iodum

Nama lain : Iodium

RM/BM : I/126,91

Pemerian : Keping atau butir, berat, mengkilat, seperti logam;

hitam kelabu; bau khas

Kelarutan : Larut dalam lebih kurang 3500 bagian air, dalam

13 bagian etanol (95%) P, dalam lebih kurang 80

bagian gliserol P dan dalam lebih kurang 4 bagian

karbondisulfida P; larut dalam kloroform P dan

dalam karbontetraklorida P

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan : Sebagai komposisi cat B.

7. Metilen Biru (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Methylthionini Chloridum

Nama lain : Biru metilen

RM / BM : C₁₆H₁₈CIN₃S.3H₂O / 373,90

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 13
PENGECATAN MIKROOGANISME

Pemerian : Hablur atau serbuk hablur hijau tua, berkilauan

seperti perunggu, tidak berbau atau praktis tidak

berbau. Stabil diudara; larutan dalam air dan dalam

etanol berwarna biru tua

Kelarutan : Larut dalam air dan dalam kloroform; agak sukar

larut dalam etanol

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai cat utama dalam pengecatan sederhana.

8. Nigrosin (Ditjen POM, 1979)

Nigrosin terdiri dari :

Nigrosin water soluble

Air suling

9. Safranin (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Safranin

Pemerian : Serbuk halus berwarna biru keunguan.

Kelarutan : Tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan : Sebagai komposisi cat D.

C. Uraian Mikroorganisme (www.itis.gov)

1. Bakteri Streptococcus mutans

Kingdom : Bacteria

Subkingdom : Posibacteria

Phylum : Firmicutes

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 14
PENGECATAN MIKROOGANISME

Class : Bacili

Ordo : Lactobacillales

Family : Streptococcaceae

Genus : Streptococcus

Spesies : Streptococcus mutans

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 15
PENGECATAN MIKROOGANISME

BAB III

KAJIAN PRAKTIKUM

A. Alat Yang Dipakai

Alat yang dipakai adalah batang pengaduk, dek gelas, gegep kayu,

lampu spiritus, mikroskop, objek gelas, ose bulat, pinset dan tabung

reaksi.

B. Bahan Yang Digunakan

Ada pun bahan yang digunakan yaitu aquadest, alkohol, kristal

violet (Gram A), Kalium Iodida (Gram B), Etil alkohol (Gram C), Safranin

(Gram D), Methylen blue dan Nigrosin.

C. Cara Kerja

1. Pengecatan Negatif

1) Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2) Diambil biakan murni bakteri dengan ose bulat dan letakkan

setetes nigrosin.

3) Speader slide digerakkan ke arah cat sampai ujung slide

menyentuh cat. Tunggu hingga cat menyebar di ujung keseluruh

ujung slide. Kemudian dorong slide ke ujung lainnya.

4) Amati dibawah mikroskop.

2. Pengecatan sederhana

1) Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2) Diteteskan dengan metilen biru dan biakan menggunakan ose

bulat selama 1 menit diatas objek gelas

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 16
PENGECATAN MIKROOGANISME

3) Bilas dengan aquadest secara perlahan

4) Sisa aquadest dilap dengan tissue.

5) Diamati dibawah mikroskop

3. Pengecatan gram

1) Disiapkan preparat olesan bakteri

2) Dikeringkan di udara, setelah kering difiksasi diatas lampu spiritus.

3) Ditetesi cat gram A sebanyak 2-3 tetes, dibiarkan 1 menit.

4) Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan di udara atau kertas

hisap.

5) Diteteskan larutan gram B, dibiarkan selama 1 menit.

6) Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

7) Diteteskan larutan gram C selama 30 detik dan dicuci

8) Diteteskan larutan gram D selama 30 detik.

9) Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dan diamati dengan

mikroskop.

10) Digambar hasil-hasil pengecatan tesebut.

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 17
PENGECATAN MIKROOGANISME

BAB IV

KAJIAN HASIL PRAKTIKUM

A. Hasil Praktikum

1) Data Pengamatan Pengecatan Sedehana

Pengamatan
bakteri memperlihatkan latar belakang

warna merah dan biru

2) Data Pengamatan Pengecatan Negatif

Pengamatan

Bakteri memperlihatkan latar belakang

warna merah berbentuk spiral.

3) Data Pengamatan Pengecatan Gram

Pengamatan
Bakteri mempertahankan warna safranin

yakni merah dan menunjukkan bahwa

merupakan bakteri gram negative berbentuk

batang.

B. Pembahasan

Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai

maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan

menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada

tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus

dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 18
PENGECATAN MIKROOGANISME

membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan

pengukuran yang akurat.

Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih.

Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu.

Pembersihan biasanya  menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian

di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri

murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri

tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan

dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri

akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu

per satu menjadi tidak jelas.

Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan

diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar

melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus

apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi

adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala

api.

Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A

(methylene blue) sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit.

Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan

cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian

bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi

kelebihan zat warna dari methylen blue.

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 19
PENGECATAN MIKROOGANISME

Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium.

Gram B merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas

pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh

bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut,

mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan

larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks.

Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna methylene blueakan larut

saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit untuk

dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka

pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).

Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk

melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan

biru dari komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena

mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap

mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan

ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram

negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga

meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue.Perlakuan ini

dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin

untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan

pengeringan.

Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D)

sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D

tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 20
PENGECATAN MIKROOGANISME

persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding sel.

Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan

warna bakteri berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan

oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga

safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua

berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay,

1994).  Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini

berwarna merah.  Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras.  Cat ini

berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target.  Cat

sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat

primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu

dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.

Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan

meninggalkan warna biru. Perbedaan respon terhadap mekanis

pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan

komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein

dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan

dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum

pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga

memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke

dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri

gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya

terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 21
PENGECATAN MIKROOGANISME

rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin

tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada

komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara

dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan

penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan

pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif

memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-

50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3

nm).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,

peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat

warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna,

kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.

sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.

Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini

merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi

bakteri jenis Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan

tergolong dalam bakteri gram positif. 

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 22
PENGECATAN MIKROOGANISME

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari praktikum pengaruh lingkungan terhadap pertumbuhan

mikroorganisme dapat disimpulkan bahwa:

1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat

digunakan untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram
positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan
klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda
dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan
berbeda.
2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna
methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini
mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan
warna methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini
mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
B. Saran

Ketelitian dan kebersihan dalam menjalankan praktikum harus di

perhatikan.

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 23
PENGECATAN MIKROOGANISME

DAFTAR PUSTAKA

Pelczar, Char, 2007, J. Jr., Dasar-Dasar Mikrobiologi, UI-Press, Jakarta

Madigan, 2003, Mikrobiologi Umum, MM-Press, Jakarta

Razali, 2000, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, PT. Gramedia , Jakarta

Umls, 2008, Analisi Mikroba di Laboratorium, PT. Raja Grafindo Persada,

Jakarta

Volk, 2003, Mikrobiologi Farmasi Dasar, Jurusan Farmasi Universitas

Hasanuddin : Makassar

Dirjen POM, (1979), Farmakope Indonesia, Edisi III, Depkes RI, Jakarta.

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 24
PENGECATAN MIKROOGANISME

LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema Kerja

1. Pengecatan negatif

Letakkan setetes nigrosin pada ujung gelas objek.

Masukkan Inokullum Dari Ose Ke Dalam Nigrosin, Campurkan

Ambil objek gelas lalu letakkan disebelah luar metylen blue dengan posisi

miring ( 30o).

Geser Secar Perlahan Hingga Membentuk Lapisan Tipis

Amati Di Bawah Mikroskop ( Gambar Bentuk Mikroorganismenya.)

2. Pengecatan gram

Preparat Olesan Bakteri Difiksasi

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 25
PENGECATAN MIKROOGANISME

Tambah 2 – 3 tetes gram a biarkan 1 menit.

Cuci dengan air mengalir, dan isap dengan tissue.

. Tetesi gram b dan biarkan 1 menit.

Cuci Dan Dikeringkan

Tetesi Gram C Biarkan 30 Detik

Cuci Dan Keringkan

Tetesi Gram D Biarkan 30 detik.

Cuci Dan Keringkan

Amati Warna Mikroba

Catatan : bakteri gram (+) = ungu

bakteri gram (-) = merah

3. Pengecatan sederhana

Ambil 1 Ose Suspensi Biakan Secara Aseptis Ratakan Diatas Gelas Objek

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123
 Page | 26
PENGECATAN MIKROOGANISME

Fiksasi

Tetesi Metilen Blue 1 – 2 Tetes Biarkan 1 – 2 Menit

Cuci dengan air mengalir

( sisanya dilap dengan tissue)

Amati Di Bawah Mikroskop

RATU TASHA HENANZA PUTRI HARSAN ARIFIN KASAN

15020150123