1.

Ruang laboratorium kultur jaringan pada agrotek meliputi :

a. Ruang Persiapan
Ruang persiapan digunakan sebagai tempat untuk mempersiapkan eksplan, medium, dan
alat-alat. Ruang persiapan dibagi menjadi beberapa ruangan kecil yaitu: alat dan medium,
alat-alat gelas, bahan-bahan kimia dan pembuatan media, ruang timbang dan ruang stok,
dan tempat pencucian. Ruang persiapan ini terletak di paling depan diantara ruangan yang
lain. Hal ini dikarenakan bahwa perlu dibutuhkan satu ruang yang kurang steril untuk
mempersiapkan segala keperluan yang akan digunakan dalam proses kultur jaringan,
diletakkan di paling depan dekat pintu karena untuk menjaga kesterilan ruang yang berada
didalam yang dalam proses kultur jaringan ruang tersebut harus benar benar steril.

b. Ruang Transfer
Ruang transfer merupakan ruang di mana pekerjaan aseptik dilakukan. Dalam ruangan ini
dilakukan kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplan dalam media.
Ruangan ini sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, serta terpisah dan tersekat
dengan ruangan lain. Penggunaan AC sangat dianjurkan dalam ruangan ini. di dalamnya
terdapat laminar air flow/enkas, dissecting, mikroskop, alat diseksi (pisau bedah/scapel,
pinset, spatula, dan gunting) , lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, Hand sprayer
yang berisi alkohol 70 % ,Lampu bunsen dan timbangan kecil.

c. Ruang kultur
ruang yang paling besar dibanding dengan ruangan yang lain. Ruangan ini harus dijaga
kebersihannya dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar masuknya orang-orang
yang tidak berkepentingan. Ruangan ini berisi rak-rak kultur yang berfungsi untuk
menampung botol-botol kultur yang berisi tanaman. Rak ini juga dilengkapi dengan
lampu-lampu sebagai sumber cahaya bagi tanaman kultur. Selain rak kultur, ruang kultur
juga harus dilengkapi dengan AC, pengukur suhu dan kelembapan, serta timer yang
digunakan untuk menghidup-kan dan mematikan lampu secara otomatis.

d. Ruang stok
Ruangan ini berfungsi sebagai ruang untuk menyimpan media tanam yang sudah di
autoklaf. Ruang stok sebaiknya dingin dan gelap, serta kebersihannya harus dijaga. Media
tanam akan diinkubasi pada ruang ini selama 3 hari sebelum digunakan. Hal ini untuk
mengetahui kondisi media tanam apakah steril atau ter-kontaminasi jamur/bakteri. Apabila
media terkontaminasi, sebaiknya segera dikeluarkan dan diautoklaf selama 1 jam pada
tekanan 0.14 Mpa.
 e. Ruang Timbang/Bahan Kimia
Ruang ini berisi stok bahan-bahan kimia, timbangan analitik, magnetik stirer dan lemari
es. Semua kegiatan penimbangan bahan kimia dan pembuatan larutan stok dilakukan di
ruangan ini.

2. Peralatan yang dibutuhkan dalam kultur jaringan meliputi :

timbangan analitik, enkas/LAF, lemari es (lart stok, garam2 anorganik, vitamin dan
hormon); hot plate & magnetic stirrer; bunsen burner dengan kaki tiga; oven; pengukur pH;
autoklaf dan berbagai alat gelas standart ( labu takar, pipet, erlenmeyer, gelas piala, pengaduk
gelas, wadah kultur, petridish); alat untuk mencuci; rak-rak pengering; lemari untuk alat-alat,
bahan kimia serta bahan2 lain (aluminium foil, kertas timbang, karet gelang dll.); alat-alat
diseksi (spatula, pisau, scalpel, pinset); centrifuge; dan kereta dorong (cart)

3. Teknik sterilisasi lab kultur

Sterilisasi pada kultur jaringan sangatlah penting demi menjaganya ke aseptisan ruang kultur,
media kultur serta peralatan yang digunakan dalam kultur jaringan. Sterilisisasi sendiri
bertujuan untuk mencegah terjadinya denaturasi protein dan untuk menonaktifkan sel ataupun
mikroorganisme lain selain yang ditujukan untuk tumbuh. seperti: cendawan, dan bakteri-
bakteri.

a. Sterilisasi Ruang:
1) Sapu bersih lantai dan dinding ruang transfer dengan sapu yabg telah di sediakan
2) Pel lantai dengan larutan desinfektan (alkohol 90%-70% larutan phenol, dll)
3) Semprot diding ruang dengan alkohol 95-70% tau cukup dengan lampu UV(Ultra
Violet) bila ada selam satu jam sebelum ruang tersebut di pergunaan
4) Di dalam sterilisisasi ruangan, untuk semua ruangan kultur jaringan di bersihakan dan di
gunakan alkohol 70% dan di semprot dengan formalin 5% ke seluruh ruangan tersebut.

b. Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan Lain.

Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara
pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut
harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan
terdekomposisi pada suhu 170Oc

sterilisasi alat gelas standar

1) Botol dicuci bersih dengan sabun cair menggunakan spons dan sikat hingga bersih lalu
bilas dengan air bersih
2) Botol dikering anginkan dengan menggunakan lap bersih, susun rapi kedalam oven
 3) Lalu masukkan ke dalam autoclave pada suhu 121o C selama 60 menit pada tekanan
175 psi (pound per square inch)
4) Untuk botol-botol yang mempunyai tutup autoclaveable,jangan ditutup terlalu kencang
karena selama pemanasan terjadi pemuaian
5) Alat-alat yang disterilkan sebelum pemanasan adalah pinset,gunting,kertas saring,
petridish,botol kosong,pipet
6) Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kantong plastik yang disealer sebelum
dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium foil tidak dianjurkan sebagai pembungkus
karena uap air tidak dapat masuk kedalam pembungkus.
7) Alat-alat seperti pinset,gunting,gagang scalpel dibungkus dengan plastik yang telah
disealer
8) Petridish dan tutup botol disterilkan dengan pembungkus plastik yang sudah disealer
9) Selanjutnya autoclave dibuka dan peralatan yang telah disterilisasi diambil
10) Kering anginkan semua peralatan,simpan dengan rapid an ditempat yang bersih

c. Sterilisasi Media

Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan
filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi
dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil
atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile)
harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu
121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan
adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit.

d. Sterilisasi Bahan Tanaman

Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit. Meskipun bermacam
tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila
eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan
disinfektan, karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang
ekstrim. Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu perendaman dalam
larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan
disterilisasi. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat
membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya
sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas
dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. Semua permukaan eksplan yang
disteriliasi harus terendam dalam sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril
sekurang-kurangnya tiga kali.