Proeeedings Seminar Pendayagunaan Reaktor Nllldir Bandung, 26-27 September 1990

PPTN-BATAN
Untllk Kesejahteraan Masyarakat

PENENTUAN KARAKTERISTIKA ANTIBODI T4

UNTUK BAHAN PEREAKSI RIA
Ratnawati Kukuh , Pringgo Soedigdo
Pus at Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional

AJBSfRAK
PENENTUAN KARAKTERISTIKA ANTIBODI T4 UNTUK BAHAN PEREAKSI RIA.
Agar antiserum dapat digunakan untuk keperluan RIA maka harus memenuhi beberapa
persyaratan yaitu mengandung antibodi dengan kespesifikan tinggi, cukup peka pada daerah
kerja yang diinginkan serta mempunyai titer yang tinggi. Untuk men~i apakah antiserum
T4 yang dihasilkan dapat digunakan untuk keperluan RIAmaka pada penelitian ini dilaku-
kan 1.\iikarakteristika antiserum yaitu dengan menentukan nilai aviditas dan kespesifikan.
Kespesifikan dievaluasi dengan mempelajari reaksi silang antiserum T4 terhadap berbagai
senyawa yaitu 3,3,S-triiodo-L-tironina (Tg), diiodotironina (3,S-T2), 3-iodo-L-tirosina (MIT),
3,S-diiodo-L-tirosina (DIT).Hasil analisis menuDjukkan bahwa anti- serum T4 yang diha-
silkan cukup spesifik untuk penentuan RIA. Aviditas antiserum atau harga K ditentukan
dengan menggunakan kurva Scatchard yang menuDjukkan hubungan antara perbandingan
fraksi terikat terhadap fraksi bebas (BIF) dan jumlah antigen terikat. Dari hasil percobaan
diperoleh nilai K sebesar 3,6 x 1071/mol untuk kelinci 2,S3 kg dan 2,9 x 1071/mol untuk kelinci
2,39 kg. Limit deteksi yang dapat dicapai dengan antibodi T4 adalah 2,8 x 10,8 molll dan 3,4
x 10,8 molll berturut-turut untuk kelinci dengan berat 2,S3 kg dan kelinci dengan berat 2,39
kg. Dari hasil seluruh percobaan dapat disimpulkan bahwa antiserum T4 yang dihasilkan
cukup memenuhi persyaratan untuk digunakan sebagai bahan pereaksi RIA. Hasil penelitian
ini diharapkan akan sangat berguna bagi produksi kit T4 buatan dalam negeri.
AJBSTRACT
DETERMINATION OF· THE CHARACTERISTICS OF T4 ANTIBODY FOR
RADIOIMMUNOASSAY. Antisera for radioimmunoassay should meet a number of
requirements such as having high spesificity, adequate sensitivity in the desired working
range and high titre. In order to test the suitability of the T4 antiserum produced, the
characteristics of the antiserum was studied by determining avidity and specificity. The
specificity was evaluated through cross-reaction studies of the T4 antiserum with several
compounds,i.e. 3,3,S-triiodo-L-thyronine (T2), diiodothyronine (3,S-T2), 3 iodo-L-tyrosine
(MIT), 3,5-diiodo-L-tyrosine (DIT).The analytical results showed that the T4 antiserum
produced is sufficiently specific for radioimmunoassay. The avidity or K value was calculated
from Scatchard's plot which shows the relationship between the ratio of bound and free
fractions and the amount of bound antigen. A K value of 3.6 x 1071/mole was obtained for the
rabbit weighing 2.53 kg and 2.9 x 1071/mole for the one weighing 2.39 kg. The detection limits
were found to be 2.8 x 10,8 molell and 3.4 x 10,8 molell respectively for the two rabbits. It can
be concluded that the T4 antiserum produced meet requirement for radioimmunoassay and
should make a significant contribution for the local production ofT4 kits.
PENDAHULUAN
Antiserum adalah salah satu komponen antiserum dapat digunakan untuk keperluan
te:rpenting dalam kit RIA. Agar antiserum da- RIA maka dalam penelitian ini dilakukan pe-
pat digunakan untuk keperluan RIA maka ha- nentuan karakteristika antiserum lainnya.
rus memenuhi beberapa persyaratan yaitu Kespesifikan adalah kemampuan antibodi
ml:!ngandung antibodi dengan kespesifikan dan untuk bereaksi dengan antigen yang dimaksud,
aviditas yang tinggi, cukup peka pada daerah tanpa disertai reaksi dengan antigen yang lain.
keIja yang diinginkan serta mempunyai titer Umumnya kespesifikan ini tidak bersifat
yang tinggi [1,2]. mutlak, sehingga antibodi dapat bereaksi de-
Antiserum tidak dapat diseleksi atas da- ngan molekul lain yang strukturnya mengan-
sar titer semata- mata. Antiserum dengan titer dung persamaan dengan analit yang bersang-
yang tinggi belum tentu memenuhi persyaratan kutan. Jika dalam plasma tidak terdapat se-
untuk keperluan RIA. Untuk menguji apakah nyawa lain yang mempunyai struktur yang se-

1
Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor Nuklir Bandung, 26·27 Septemb~r 1990
Untuk Kesejahteraan Masyarakat PP1'N·BA1'AN

rupa dengan senyawa yang harus ditentukan dengan ukuran 50 !!l,100!!1, 500 !!l,dan 1000!!1,
konsentrasinya, maka dapat diharapkan tidak dan tabung reaksi.
akan ada gangguan dari zat lain. Akan tetapi TATAKERJA
bagi banyak senya wayang mempunyai arti pen-
ting secara biologis, terdapat sejumlah senyawa Pembuatan kurva baku dengan berbagai variasi
lain dengan struktur kimiawi yang serupa. Bia- pengenceran
sanya kita tidak menginginkan senyawa terse- Mula-mula dilakukan pembuatan kurva
but ikut tertentukan dalam suatu penentuan, baku dengan berbagai pengenceran antiserum,
karena efek biologisnya berbeda. Jadi kespe- hingga diperoleh pengenceran yang memberi-
sifikan antibodi merupakan salah satu faktor kan daerah keIja dengan kepekaan yang dii-
utama yang menentukan kualitas dari penen- nginkan. Untuk pembuatan kurva baku digu-
tuan. Adanya reaksi silang akan mempenga- nakan 25 !!l larutan baku T4 dengan konsen-
ruhi hasil analisis [2,3]. trasi 0, 10, 50, 100, 150, dan 250 nmol/l. Kemu-
Kepekaan suatu sistem penentuan RIA dian ditambahkan 100!!1T4 bertanda 1251clan
sangat bergantungpada aktifitasjenis senyawa 100!!1 antiserum T4 (hasil pengenceran). Cam-
bertanda dan aviditas antibodi. Aviditas atau puran diaduk dengan pengaduk vortex, diinku-
nilai K menggambarkan energi ikatan atau ke- basi selama 1 jam pada suhu kamar. Selan-
kuatan ikatan antara antigen dan antibodi. jutnya ditambahkan 1 ml larutan PEG 18%
Pad a penentuan RIA nilai K menggambarkan untuk memisahkan fraksi terikat dan fraksi
kepekaan dari suatu penentuan, makin kecil bebas. Setelah dipusing, cairan dari setiap ta-
konsentrasi antigen yang akan ditentukan di- bung didekantasi dan keaktifan residu dicacah
perlukan antibodi dengan aviditas yang tinggi. dengan menggunakan pencacah sinar-y. Pro-
Perhitungan nilai K dapat ditentukan dari tokol RIA untuk percobaan ini dapat dilihat
data kurva baku dengan menggunakan metode pada Tabell.
Scatchard. Harga K diperoleh dari kemiringan Tabell. Protokol RIA
garis (slope)[4,5].
Dalam
T
serum
baku an-
penelitian
pe
mb ini antiserum T4 diuji
25
10-25
:~5
10C
50-1
125
10(
25( I
- n
10C
10C
lik-
l5(
0 akb0 --(nmol/l)
konsentrasi
100
vo- baku T4an
up
18%
an lum ding Cuplik-
Anti-
bebas
PEG
denganLarutan
menentukan titer, daerah (!!l)kerja 12tl-T4
Larutan
optimal,
Serum
nilai aviditas dan kespesifikan. Kespesifikan di- Inkubasi suhu kamar selama 1 iam
evaluasi dengan mempelajari reaksi silang anti-
serum T4 terhadap T3 ' 3,5- T2 ' MIT
(3-iodo-L-tirosina), DIT (3,5-diiodo-L-tirosina),
dan nilai aviditas ditentukan dari kurva
Scatchard.
BAHAN DAN PERALATAN
Bahan yang digunakan
Antibodi yang digunakan adalah antibodi
hasil penelitian yang terdahulu yaitu antibodi
dari kelinci 2,39 Kg dan kelinci 2,53 Kg.
3,5-diiodo-L-tirosina (DIT), 3-iodo-L-tirosina
(MIT), 3,5-T2(diiodotironina), T3 ' polietilengli-
kol (PEG-6000), dapat diperoleh dari Sigma.
NaN3, NaH2 P04 ' Na2 HP04 ' diperoleh dari
E. Merck. Semua bahan mempunyai tingkat
kemurnian pereaksi analitik. Selain itu diguna-
kan pula serum bebas, T4 bertanda 1125,dan
baku T4 produksi PPTN.
Peralatan
Perala tan yang digunakan adalah alat
Pemusingan : selama 20 menit pada 2000 g.
pencacah sinar y (Miniassay type 6-20), alat
Dekantasi supernatan d~Il cacal1.eIl4~pl:!n.
pemusingyang diperlengkapi pendingin (lEC
Centra-7R), alat pH meter (Metrohm HerisauE Ni,lai keakt~fan senyawa b~rtan':ia digu~k;~n
untuk menentukan % ikatan. f< ,', •

520), alat freeze dryer (Labconco).Kecuali alat-

i Dari ...
hasil seluruh
_;~-',j percob~an dibuat grafili
alat tersebut digunakan pula pipet ependorf i.. ,~ ~."

antara fraksi terikat dan konsentrasi T4 serta

2
Proceedings Seminar Pendayagunaon Reakror Nllklir Brmdung, 26-27 September 1990
Untuk Kesejahteraan Masyaralwt PPTN8ATAN

gl'afik profil presisi yang menggambarkan hu- HASILDAN DISKUSI

bungan antara % koefisien variasi (%CV) de- Antiserum yang digunakan pada peneli-
ngan konsentrasi. tian ini adalah antiserum yang diperoleh dari
Plmentuan volum pereaksi optimal un/uk menda- kelinci 2,53 kg dengan nilai titer 1 x 104 dan
p,!tkan daerah kerja dan kepekaan yang diinginkan kelinci 2,39 kg dengan nilai titer 6 x 102 (hasil
Setelah diperoleh pengenceran antiserum penelitian yang terdahulu).
ynng tepat ditentukan pula volum pereaksiyang Antiserum tidak dapat diseleksi atas da-
optimal untuk mendapatkan daerah kerja dan sar titer semata-mata. Keuntungan antiserum
kopekaan yang diinginkan. Untuk maksud ini dengan titer tinggi ialah sedikit antiserum da-
dilakukan berbagai kombinasi dengan disain pat digunakan untuk sejumlah besar penentuan
porcobaan sebagai berikut: [4,5,6]. Umumnya antiserum dengan pengen-
1. 25 ~llarutan bakuT4, 50 ~l T4bertan d a 1251, ceran tinggi memberikan kepekaan analisis
50 ~l antiserum T4 yang tinggi. Akan tetapi pada daerah kerja yang
2. 25 ~llarutan baku T4, 100 ~l T4 bertanda diinginkan sering tidak memberikan kondisi
1251, 50 ~l antiserum T4 yang optimal. Jadi untuk menentukan
3. 25 ~llarutan baku T4, 50 ~l T4 bertanda pengenceran antiserum optimal pada daerah
1251,100 ~l antiserum T4 kerja yang diinginkan dilakukan pembuatan
4. 25 I-!llarutan baku T4, 100 ~l T4 bertanda kurva baku dan kurva profil presisi dari
1251,100~l antiserum T4 berbagai pengenceran antiserum.
5. 50 ~llarutan baku T4 , 50 ~l T4 bertanda Kurva profil presisi sangat berguna untuk
1251. 00~l antiserum T4 mengetahui sej~uh mana kepekaan dan daerah
Percobaan dilakukan sesuai dengan pro- kerja yang dapat dicapai dengan sistem analisis
takol RIA yang tertera pada Tabel1. Dari selu- tersebut (7). Kurva profil presisi diperoleh
ruh percobaan kemudian dibuat grafik antara dengan mengalurkan % CV terhadap
fraksi terikat dan konsentrasi T4 serta grafik konsentrasi. Daerah kerja yang diinginkan
profil presisi. adalah daerah konsentrasi yang memberikan
Plmentuan aviditas kesalahan < 10%.
Penentuan aviditas dilakukan setelah di- Untuk memperoleh daerah pengenceran
kdahui pengenceran antiserum dan volum pe- antiserum yang optimal dilakukan pengenceran
reaksi optimal. Aviditas ditentukan dari kurva antiserum T4 antara 1/1000 -1/7500 untuk ke-
S<:atchard yaitu hubungan antara B/F (fraksi linci dengan berat 2,53 kg dan 1/200 - 1/400
terikat/fraksi bebas) danjumlah antigen terikat untuk kelinci dengan berat 2,39 kg. Hasil opti-
(molm yang diperoleh dari data kurva baku. masi pengenceran antiserum T4 dapat dilihat
Aviditas dinyatakan dengan harga K pada re- pada Gambar 1, Gambar 2, dan Tabel 2 (lihat
aksi antigen-antibodi. Nilai K ini diperoleh da- halaman berikut).
ri koefisien arah (slope) pada kurva Scatchard. Kurva profil presisi menunjukkan bahwa
P~'nentuan kespesifikan antibodi T4 makin encer konsentrasi antibodi akan membe-
Kespesifikan ditentukan dari reaksi silang rikan limit deteksi yang makin rendah. Jadi
3,5-T2' DIT,MIT,dan T3, terhadap antibodi T4 apabila diinginkan penentuan pada konsentrasi
U ntuk maksud ini dilakukan 5 seri percobaan. yang sangat rendah diperlukan antibodi de-
Sori pertama dibuat kurva baku T4 dengan ngan tingkat pengenceran yang tinggi. Walau-
konsentrasi 0, 10, 50, 100, 150, dan 250 nmol/l pun antibodi dengan tingkat pengenceran tinggi
dIm seri ke 2 hingga ke 5 dibuat kurva pengen- dapat mencapai limit deteksi yang rendah tetapi
ceran berbagai senyawa tersebut dengan kon- presisi percobaan kurang baik karena nilai ikat-
sentrasi 10, 100, 1000, 10.000, 100.000 nmol/l. an maksimum (BolT) rendah. Hal ini akan mem-
Prosedur percobaan dilakukan sesuai dengan berikan bentuk kurva baku yang landai dan
protokol yang terdahulu. Derajat reaksi silang akan mengurangi kepekaan analisis.
da.pat dihitung dengan membandingkan Ed 50 Pada penentuan klinis untuk hormon ti-
pa.da kurva baku T4 dengan Ed 50 pada kurva roksina (T4) daerah hipotiroida dan hipertiro-
pengenceran senyawa-senyawa T3 ' 3,5-T2 ' ida merupakan daerah yang sangat penting un-
DIT, MIT. tuk pemeriksaan klinis, maka kurva baku harus
mencakup kedua daerah tersebut. Dari hasil
pengujian diperoleh bahwa pengenceran anti-
bodi optimal adalah 1/2000 untuk kelinci de-
ngan berat 2,53 kg, dan 1/300 untuk kelinci

3
Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor Nuhlir 13andung, 26-27 September 1990
Untuh Kesejahteracm Masyarakat PPTN-BATAN

a, ",Ii)

1
':::':"i2~",=".",_._.~_ nmol/l

"rcU:.~ pAdo. I:Ct•.•••••••t,.••.•~

clka,tar'l ",Wc••t,'ftU •••1

o p."''Jenc.,-an .~oo; • r""'.nc.' ••..•

. C p.n9 ••.•c:.,-Qn •.•••'''00; • p.n,_ncerGn J./200~
o p.ng_ •.•c:..rGn ,-",•.500; A p.n9.ncer ••••.•

Gambar 1. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai pengenceran antiserum T4 ( kelinci
2,53 kg ).

-='-'~::~<:'\ '. ...

'/. ~
s.
\';.. ~
..• ~~. '" a •

''0.\.. ••• ',It '\

.',\\\"..
Q. •.
..•"" ..
....
~t. "0 ..
..

'.~:-.,
a ••.•••
'" 1
\ ••• ~\,~. ~,.., ~':,:; ••~ •••• o
010 J~ n nil 01 / I
---to- K Dn~tntuli .tr-:'1....~.~~_ .• ';;;-;-"IDI/I

o P••.•9.roc:.,. ••••.•1/ .•00; • p.n9 ••.•c.,-on :Joo

, .••.
• p."g.ru:.r_ •.• L/250; 0 pon9.nc.,-.. ~.••.
~_oo

Gambar 2. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai pengenceran antiserum T4 ( kelinci
2,39 kg )..

4
 Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor Nuklir Bandung, 26-27 September 1990
PPTN-BATAN
Untuk Kesejahteraan Masyarakai

dengan berat 2,39 kg (Gambar 1,2).Pad a kondisi lang biasanya ditentukan sebagai perbandingan
pengeneeran ini diperoleh daerah kerja yang konsentrasi antigen spesifik terhadap konsen-
c:ukup lebar. trasi senyawa yang mengadakan reaksi silang
pada Ed 50 (BfBo = 50%) (1,3). Dari data yang
'Pabel 2. Hasil optimasi pengeneeran antibodi diperoleh T 3 adalah antigen yang bereaksi si-
'P4' lang terhadap antibodi T4 sedang untuk senya-
20
11
18
8Ed50
32
20
19
45 ----420
-59,1300
400
750
700
1000
600
1000 wa MIT,DIT,dan T2 derajat reaksi silangnya sa-
5.5
11,8
57,6
47,0
25,7
42,0
77,6
18,2
63,7
65,6
81,7
73,9
(nmol/l)
13,5
112,3
32,0
46,2
42,9
74,5,
63,2
65,3
67,5
presisi
preSlSl
Batas 130
BolT
(%)
profil
a. Kelinei
(nmol/l) dem1;anberat 2,53 kg. ngat keeil. Besar reaksi silang T 3 adalah 5,0 %
berat 2.30 ke. (nmol/l) atau 0,1 nmol/l untuk kelinei 2,53 kg dan 2,75 %
Pengeneer-
atau 0,06 nmol/l untuk kelinei 2,39 kg. Dari data
tersebut di atas ternyata reaksi silang T3 untuk
kedua antiserum yang dihasilkan tidak mem-
berikan perbedaan yang nyata. Kadar T 3 dalam
serum darah normal berkisar antara 1,5 - 2,2
nmol/l, yang berarti jauh lebih kecil dari kadar
T4 ' maka adanya reaksi silang tidak signifikan
pengaruhnya terhadap hasil pengukuran kon-
sentrasi T4 . Hasil penentuan reaksi silang ter-
hadap antibodi T4 selengkapnya dapat dilihat
pada Tabel 4.

Tabel 4. Hasil penentuan reaksi silang terha-

dap antibodi T4'

a. Kelinei dengan beratI 2,53 k

Senvawa
100
Dengan kondisi pengeneeran ini dilakukan 5
pula penentuan volum pereaksi optimal untuk < 0,0001
mendapatkan daerah kerja yang diinginkan. < 0,0001
Hasil penentuan dari berbagai kombinasi pere- < 0,0001
aksi dapat dilihat pada Tabel 3, Gambar 3 dan
4, masing-masing untuk kelinei dengan berat b. Kelinei denean berat 2.39 k~.
2,53 kg dan 2,39 kg. Dari data yang diperoleh Senvawa
ternyata disain penentuan dengan 25 f..lliarutan
baku T4 (euplikan), 100 f..llT4 bertanda 1251, dan T4 100
100 f..llantiserum T4 memberikan hasil T3 2,75
pereobaan yang eukup peka pada daerah kerja MIT < 0,0001
yang diinginkan yaitu antara 18 - 700 nmol/l DIT < 0,0001
1.lntukkelinei dengan berat 2,53 kg dan 19 - 600 3,5 T2 < 0,0001
nmol/l untuk kelinci dengan berat 2,39 kg. Nilai
normal T4 berkisar antara 60 - 150 nmol/l [5].
(lihat halaman berikut ). Dari hasil analisis dapat disimpulkan bah-
Mengingat bahwa untuk penentuan T4 de- wa antiserum T4 yang dihasilkan eukup spes i-
ngan metode RIA tidak diperlukan pemisahan fik.
antibodi T4dari antibodi lainnya yang ada maka Kepekaan dari suatu sistem penentuan
perlu dilakukan uji kespesifikan. Kespesifikan erat hubungannya dengan aviditas atau harga
dapat dievaluasi dengan mempelajari reaksi K antibodi. Maka untuk dapat memperoleh sua-
Bilangantiserum T4terhadapsenyawa-senyawa tu sistem dengan kepekaan yang tinggi umum-
yangmempunyai struktur molekulyang hampir nya digunakan antiserum yang mempunyai a-
:3ama.Adanya reaksi silang akan inenyebabkan viditas tinggi. Aviditas atau harga K antiserum
hasil pengukuran eenderung terlalu tinggi. Ha- dapat dipelajari dengan menggunakan kurva
:3ilpenent).lan reaksi silang terhadap antibodi Seatehard.
:3pesifikT4 dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6 Pada prinsipnya penentuan harga K sa-
(lihat halaman berikutnya). Derajat reaksi si- ngat sederhana, teta pi dalam prakteknya sering

5
Proceedings Seminar Pendayaguncum Reaktor NukliJ' Bandllng, 26-27 September 1990
Untuk Kesejahteraan. Masyarakat PPTN-BATAN

Tabel 3. Hasil optimum dari berbagai kombinasi pereaksi.

Ed 5020
15
19
33,2
44,0
20,6
42,0
45,7
13,4
Batas 730
25
46,2
15,4
39,2
19,1 18
17 250
400
---300
600
700
370
8(nmol/l)
7,5-220
500
300Bo/l'
profil presisi(%)
(nmol(l)
80,3
62,1
79,0
82,8
65,6
54,6
56,9
65,3
(nmoI(l)
40,5
63,2
a. Kelinci dengan berat 2,53 kg.
100!AI
50 !AI125I-T4
125I-T4
!AIlarutan
f.!llarutan
!AIIarutan
25 Kelinci
b. !AIlarutan
Kombinasi
!AIIarutan baku
denganpereaksi
baku berat 2,39 kg.

6
Pl'Ooeedings Seminar Penria)'agunaon. Reaktor Nuklir Ban-dung, 26-27 September 1990
Untuk Kesejrihteraon. Masyarakat PPTN-BATAN

'{, tV

---+ Kuuntrul
--+ ko" II ••Hui
•• 'ra.il:.l t.rU••t: loa 1,.II..t potlo. k." •• ntru.o~ 0
X • to..rlolCo."ba.ku: Y • I.Z':"T.1 Z • o,..Ubodt T.•

o 25 J.J\ X, iDO ."'\ Y, &00 ,..~ 2; (1\ z::II JJl )C, :SO JJ\ V, "" J.JL 'Z
• ao J.J~ V, 100 ~\ Y, JOO ""I %.:0 t:s ,..U X. ,n $01\ Y. 400 fit 2-
o U }.Il x. 100 }.It Y, 50 #1 Z

Gambar 3. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai kombinasi pereaksi ( kelinci 2,53
kg)

~I,~, ,.

r
q
0:.,",
\~:'.. \
r .•...

'." '~'~::;~-~?~!\-'''-''''''~1f<;;;;i~-
...
~,o''''
100 f5D UO
1000 n Mol/I
nmol/I
Kon,enrrui

x • \.(U"u\a.n bCLku: Y • 1:1.~:I_T./ Z • IISntlbodi T'"

o 2:1' ~l )c. aDo ,&It Y, sCa jJl. 2; 425 lolL X. :SO pi Y. 50 Jolt "Z
• ~O #-ILx, 1.00 }Jl Y, .1.00 Ii' %:. 1$ }oJl X. !So }Jt y. SOD pI Z
D ~ J.I\ )( •.• 00 J.I' Y, :tO}lt z:

Gambar 4. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai kombinasi pereaksi ( kelinci 2,39
kg)

7
Proceedings Seminar Pendayagunaan Reakwr Nuklir Bandung, 26-27 September 1990
Untuk Kesejahteraan Masyarakat PPTN-BATAN

.<0... •......•

'I, !B.

!~ .~
.
.
• .•.o..•~-.o T,!
.aoooo "mol}1

____ • Ko_.entrHi

Gambar 5. Hasil penentuan reaksi silang antibodi T4 (kelinci 2,53 kg).

~o~

"'r'~'
80 ....
"c:::::.:', .." •.•:':'~"':'."
",
"
- ----------.--
o
''''

-----
••
..0.••• ••. ", .'~' ,,,, ..,,,,,!, ~::
.,
"", '.
. '!

'0•

•• 'b '.
r"C'U"U _"'u - ••• ~-
'" ,
"
••••••••••••
100000 nmol/l

Gambar 6. Hasil penentuan reaksi silang antibodi T4 (kelinci 2,39 kg).

8
 Proceedings Seminar Pendayagunaan
Untuh KesejahteraOR Masyarakai
mengalami banyak persoalan. Hal ini disebab-
kan karena antiserum yang dihasilkan adalah
antiserum poliklonal yang mengandung bebe-
rapa populasi antibodi clansetiap antibodi mem-
berikan harga K yang berbeda. Keadaan inilah
yang memberikan kurva Seatehard sering tidak
berupa garislurus tetapi berupa garis lengkung
yang merupakan superposisi beberapa fungsi
linier dari setiap antibodi spesifik.
Pada Gambar 7 clan 8 terlihat bahwa kur-
va Seatehard merupakan superposisi dua fungsi
linier dengan kemiringan masing-masing ialah
K1 = 3,6x 107l1moldan~ = 8,8x 1051/moluntuk
kelinci berat 2,53 kg dan K1 = 2,9 x 107 lImol
dan K 2 = 9 x 105 limoI untuk kelinei berat 2,39
kg . Sekalipun antiserum yang dihasilkan
adalah antiserum poliklonal yang mengandung
heberapa populasi antibodi tetapi dengan dila-
kukannya pengeneeran antiserum, maka anti-
hodi dengan konsentrasi yang rendah dapat dia-
haikan.
~ .. l.G'
., 0.'
r disuntikkan identik dengan material endogen
..•
____ t Konu"trUi (10.71'101/1)
Gambar 7. Kurva penentuan aviditas antise-
rum T4 ( kelinei 2,53 kg ).
Dari data kurva baku dengan mengguna-
kan metode Seatchard diperoleh bahwa anti-
serum T 4 terdiri dari 2 populasi antibodi yaitu
dengan kemiringan K1 dan ~ . Kedua nilai K
ini menggambarkan kepekaan analisis untuk
kedua jenis antibodi dalam serum yang dihasil-
k9.n.Dengan pereobaan menggunakan baku T4
Reaktor Nuhlir Bandung, 26-27 September 1990
PP1'N-BATAN
,,12
.c, :
.,
B
r
1
Gambar 8. Kurva penentuan aviditas antise-
rum T4 (kelinei 2,39 kg).
pada berbagai konsentrasi dapat disimpulkan
bahwa antibodi yang peka untuk penentuan T4
ialah kurva dengan kemiringan K1 . Harga K
untuk antibodi yang umum digunakan dalam
RIA berkisar antara 107- 10121/mol [2,4]. Harga
K yang diperoleh untuk antiserum T4 dalam
pereobaan ini relatifrendah (107l/mol). Kenya-
taan ini sering dijumpai apabila imunogen yang
pada hewan penerima. Sehingga antibodi yang
dihasilkan akan bereaksi dengan kedua mate-
rial tersebut, yang akan mengubah karakteris-
tika dari antiserum. Antigen endogen akan beri-
katan dengan antibodi yang mempunyai avidi-
tas tinggi. Apabila konstanta disosiasi reaksi
ikatan antigen antibodi rendah, maka proses
yang terjadi tak reversibel sehingga antiserum
yang dihasilkan mempunyai aviditas relatifren-
dah [4]. Keterangan molekuler tentang hal ini
belum diketahui seeara pasti dan masih perlu
dipeeahkan. Mengingat bahwa T4 adalah zat
yang endogen, maka aviditas antiserum T4 re-
latif rendah. Aviditas suatu antiserum menen-
tukan limit deteksi dari suatu sistem penentu-
an. Limit deteksi adalah sebanding dengan 11K,
maka limit deteksi yang dapat dieapai dengan
antibodi T4 yang dihasilkan oleh kelinei 2,53 kg
adalah 2,8 x 10-8 mol/l dan untuk kelinei 2,39 kg
adalah 3,4 x 10-8mol/l. Limit deteksi dari kedua
9
Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor Nllklir Bandllng, 26-27 September }990
Untllk Kesejahteraan Masyarakai PPTN-BATAN

antibodi yang dihasilkan tidak memberikan
perbedaanyang nyata. Mengingat bahwa kadar
hormon T4 dalam serum cukup tinggi antara 60
- 150 nmol/l maka antibodi T4 yang dihasilkan
cukup peka untuk penentuan T4 .
KESIMPULAN
Kondisi penentuan daerah keIja optimal
diperoleh dengan melakukan pengenceran
1/2000 untuk kelinci 2,53 kg dan 1/300 untuk
kelinci 2,39 kg, serta percobaan mengunakan
25 !AI baku/ cuplikan T4, 100 !AI T4berlanda 1251,
DAFTAR PUSTAKA
dan 100 !AI antiserum T4yang memberikan dae-
rah kerja antara 18-700 nmol/l untuk kelinci
2,53 kg dan 19-600nmol/l untuk kelinci 2,39 kg.
Hasil uji karakteristik antiserum menun-
jukkan bahwa antiserum T4 yang dihasilkan
cukup spesifik untuk penentuan RIA dengan
batas deteksi 2,8 x 10-8 molJI untuk kelinci 2,5:3
kg dan 3.4 xlO-8 molJIuntuk kelinci 2,39 kg.
Antiserum yang dihasilkan cukup meme-
nuhi persyaratan untuk digunakan sebagai ba-
han pereaksi RIA.

1. Anonim,"Laboratory Training Manual on Radioimmunoassay in Animal Reproduction", Tech-

nical Report Series No 223, IAEA, Vienna, 1984, 100-105.
2. Edward, R, "An Introduction", Immunoassay, William Heinemann Medical Books, London,
1985, 12-23.
3. Mera, V., "Preparation and Characterization of Antibody", Diklat Radioimmunoassay ke II,
PPTN-BATAN, Bandung, 1988.
4. Chard, T., "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology",An Introduction
to Radioimmunoassay and Related Techniques, 2ed., Elsevier Biomedical Press, Amsterdam,
1982,22-24,95-109.
5. Thorell, J.I., S.M. Larson, "Methodology and Clinical Application", Radioimmunoassay and
Related Techniques, The C.V. Mosby Company, 1978, 11-31, 114-118.
6. Pillay, M.RA.and RS. Mani, "Radioimmunoassay", Ind. J. Pharm. Edu., 12, 1978, 172-183.
7. Ekins, RP., "Quality Control and Assay Design", Radioimmunoassy and Related Procedure:;
in Medicine, vol. II, IAEA, Vienna, 1978, 39-56.
DISKUSI
Salman Umar:
Penandaan T4 menggunakan radioisotop 12512 1251 ini mempunyai beberapa kelemahan- kele··
mahan. Karena telah ditemukan radioisotop 1 31yang mempunyai sifat-sifat yang ideal, apakah
tidak terbayang untuk mengembangkan kit RIA dengan penandaan 1231 tersebut.
Ratnawati Kukuh:
Mengingat bahwa radioisotop 1231 mempunyai waktu paruh yang pendek, sehingga untuk
penandaan T4 kurang memenuhi syarat, sebab sebagai radioisotop penanda dibutuhkan radio··
isotop yang mempunyai waktu paruh yang cukup panjang (1251 mempunyai waktu paruh 60 hari),
agar tidak diperlukan pembuatan antigen T4 bertanda yang berulang-ulang.

10