Patologi tanaman ( 1999) 48, 735-741

Peningkatan deteksi virus psorosis jeruk menggunakan antibodi poliklonal

dan monoklonal

D. Alioto b, M. Gangemi Sebuah, S. Deaglio c, P. Sposato c, E. Noris Sebuah, E. Luisoni iklan dan
RG Milne Sebuah*
Sebuah Istituto di Fitovirologia Applicata CNR, I-10135, Turin; b Departemen Patologi Tumbuhan, Universitas Portici, Naples; c Departemen Genetika, Biologi dan Biokimia,

Universitas Turin; dan d DIVAPRA, Universitas Turin; Italia

Citrus psorosis adalah penyakit serius dan luas yang berhubungan dengan virus psorosis jeruk ( CPsV), sebuah virus stranded negatif berfilamen novel dalam
genus Ophiovirus. Pengindeksan yang melelahkan dan mahal pada pabrik uji telah menjadi satu-satunya metode diagnostik rutin yang tersedia, tetapi
baru-baru ini antiserum yang dapat digunakan dalam sandwich antibodi ganda (DAS) ELISA telah disiapkan. Di sini, peningkatan besar pada protokol
DAS-ELISA, metode pemurnian baru, dan produksi dua antibodi monoklonal (mab) untuk CPsV, IgG dan IgM dilaporkan. Sandwich triple antibody (TAS)
ELISA yang sangat sensitif memanfaatkan mab dijelaskan. Dalam jeruk rumah kaca virus homolog masih dapat dideteksi pada pengenceran jaringan 1/6250
di DAS dan pada 1/31250 di TAS-ELISA. Baik format DAS dan IgG mab-TAS mendeteksi semua isolat CPsV yang sejauh ini diuji (dari Argentina, Italia,
Lebanon, Spanyol, dan AS). Beberapa isolat tidak terdeteksi oleh IgM mab.

Kata kunci: virus psorosis jeruk, DAS-ELISA, Ophiovirus, serologi, TAS-ELISA

pengantar
Penyakit citrus psorosis ditandai dengan penskalaan kulit pada batang dan
cabang pohon jeruk dewasa, yang seringkali mengarah pada penurunan
dan penurunan hasil. Ini mudah ditransmisikan tetapi gejala jarang muncul
sebelum pohon berumur 10 tahun, sehingga petani sering menyebarkan
tunas yang terinfeksi psorosis dari pohon tanpa gejala. Penyakit ini telah
menyebar di wilayah Mediterania, Amerika Selatan dan mungkin di Asia.
Penyebaran ladang alami tampaknya tidak menjadi masalah di cekungan
Mediterania tetapi ada bukti penyebaran alami di California, Texas dan
Argentina (Roistacher,
1993). Agen penyebab yang diduga sekarang sebagian dicirikan sebagai
virus baru, Virus jeruk sitrus
(CPsV), ditempatkan dalam genus baru, Ophiovirus ( Milne
et al., 1999).
Psorosis belum dikontrol atau bahkan diidentifikasi dengan jelas kecuali
di beberapa tempat seperti California, Spanyol dan Afrika Selatan, di mana
pengindeksan pada tanaman indikator diterapkan dengan hati-hati.
Masalahnya adalah bahwa pengindeksan lambat dan mahal, dan
membutuhkan personel yang terlatih dan berdedikasi. Metode diagnostik
yang murah, sederhana dan lebih cepat sangat dibutuhkan dan akan sangat
bermanfaat untuk memahami tingkat dan dinamika
* Kepada siapa korespondensi harus dialamatkan (email:
R.Milne@ifa.to.cnr.it ).
Diterima 1 Agustus 1999.
penyakit, dan untuk pengindeksan dan penanaman kembali rutin dengan bahan
bebas psorosis.
Antiserum awal terhadap virus (da Grac¸a et al., 1991)
tidak cocok untuk uji immuno-sorbent enzim-linked (ELISA), meskipun
pekerjaan yang bermanfaat dilakukan dengan itu oleh Western blotting
(Navas-Castillo et al., 1993; NavasCastillo & Moreno, 1995). Antibodi
monoklonal (mab) pertama yang tersedia (Derrick et al., 1993) tidak ada
nilainya sebagai pereaksi diagnostik, seperti yang dilaporkan oleh Barthe
et al. ( 1998).
Antiserum untuk isolat virus CRSV-4 (Garcia et al., 1997) dapat
digunakan untuk DAS-ELISA, dan digunakan untuk menunjukkan bahwa
data ELISA berkorelasi erat dengan hasil pengindeksan pada tanaman
indikator, mengkonfirmasi hubungan yang kuat antara gejala psorosis klasik
dan CPsV, dan menunjukkan bahwa setidaknya di wilayah Apulia dari Italia
selatan, virusnya menyebar luas (D'Onghia et al.,
1998). Namun, DAS-ELISA ini tidak terlalu sensitif dan bergantung pada
penyerapan antiserum dengan bahan tanaman sehat. Baru-baru ini, mab ke
isolat Italia CPsV (Djelouah et al., 1999) telah disiapkan dan digunakan untuk
membedakan antara isolat CPsV dari berbagai belahan dunia, tetapi data
tidak tersedia pada sensitivitas deteksi yang dicapai.
Di sini ditunjukkan bahwa modifikasi pada protokol DAS-ELISA
digunakan oleh Garcia et al. ( 1997) dan 'Onghia et al.
(1998) dapat sangat meningkatkan batas deteksi. Juga dilaporkan adalah
persiapan mab untuk isolat CRSV-4 dan penggunaannya dalam
TAS-ELISA. Sistem ini semakin meningkat

Q BSPP 1999 735

736 D. Alioto et al.

sensitivitas deteksi. Salah satu mab bereaksi dengan semua isolat CPsV Tabel 1 Hasil ELISA pada 34 isolat CPsV dari asal yang berbeda. Rasio kepadatan optik yang

yang diuji. terinfeksi / sehat 3 atau lebih dianggap positif. Setiap tes diulang setidaknya sekali pada sampel

yang berbeda
Selama pekerjaan ini ditemukan bahwa protokol yang dikembangkan
untuk CPsValso juga memberikan hasil yang lebih baik dengan virus lain,
TAS
dan suatu saat dapat diterapkan lebih luas. Protokol karenanya dibahas
secara rinci. Isolat DAS IgG IgM

Amerika Utara

CRSV-4 þ þ þ

P200 þ þ þ

material dan metode P201 þ þ þ

P203m þ þ þ

Isolat virus P205 þ þ þ

P208 þ þ þ
Isolat CRSV-4 dari CPsV (Garnsey & Timmer, P209 þ þ þ
1980), disediakan oleh KS Derrick (Pusat Penelitian dan Pendidikan Citrus, P213 þ þ þ

Lake Alfred, FL, USA), digunakan untuk produksi antibodi. Isolat CPsV lain P215m þ þ þ

yang digunakan dalam pekerjaan ini tercantum dalam Tabel 1. Semua isolat P216m þ þ þ

ini kecuali Na-1 (tidak diindeks) secara biologis diindeks sebagai Argentina

psorosispositif (Garnsey & Timmer, 1980; da Grac¸a et al., CPsV 173–22 NT þ þ

CPsV 90-1-1 NT þ þ

CPsV 189–34 NT þ þ
1991; Navas-Castillo & Moreno, 1995; D'Onghia et al.,
CPsV 504–5 NT þ þ
1998; Garcia et al., 1997; CN Roistacher, Departemen Patologi Tumbuhan,
CPsV 100–40–1 NT þ þ
Universitas California, komunikasi pribadi 1996).
CPsV 100–16–5 NT þ þ

Italia

ITA-3 þ þ þ

NA-1 þ þ þ
Tumbuhan dan bahan tanaman
IAM-197X þ þ þ

CRSV-4 dan beberapa isolat lainnya dipelihara dalam jeruk manis Madam IAM-393X þ þ þ

IAM-7V þ þ þ
dalam pot di rumah kaca yang diadakan sekitar 25/18 8 C (siang / malam).
IAM-320X þ þ ¹
Isolat CPsV lain diterima sebagai bahan daun yang dikeringkan di atas silika
IAM-398X þ þ þ
gel atau kalsium klorida.
Libanon

IAM-165X þ þ þ
Untuk inokulasi mekanik Chenopodium quinoa,
daun jeruk muda yang terinfeksi CRSV-4 dan gejala bantalan Orang Spanyol

Sp2 þ þ þ
dihomogenisasi dalam buffer dingin (50m M.
RS-SOR þ þ þ
fosfat pH7 · 0, 5m M. DIECA, 1m M. EDTA, 5m M.
RS-SR þ þ þ
sodium thioglycolate) dengan penambahan 0 · 25% (b / v) karbon aktif, dan
P-121 þ þ -
segera diinokulasi. Untuk mendapatkan infeksi sistemik di Gomphrena
P-126 þ þ þ
globosa tanaman, C. quinoa bahan lesi lokal diinokulasi secara mekanis P-132 þ þ þ
seperti di atas, sedangkan transmisi mekanis antara P-129 þ þ þ

RS-105 þ þ -

G. globosa tanaman terbaik diperoleh dengan menggunakan TACMbuffer (Derrick RS-108 þ þ þ

et al., 1988) ditambah karbon aktif. Konsentrasi virus tertinggi (diperkirakan dengan PB-102 þ þ þ

pewarnaan EM negatif dan oleh ELISA) diperoleh di G. globosa tanaman diadakan

NT, tidak diuji.
sekitar 30/25 8 C (siang / malam) dengan pencahayaan tambahan untuk
memberikan 18 jam sehari.

Untuk membandingkan hasil DAS dan TAS-ELISA yang dilakukan pada
waktu yang berbeda, dan untuk menyediakan peralatan kepada pekerja lain,
ekstrak standar disiapkan sebagai berikut. Daun sehat atau terinfeksi G.
globosa dihomogenisasi dalam 3 volume (b / v) dari salin yang mengandung
fosfat yang mengandung 0 · 05% Tween-20 (PBS-T) dan 2%
polyvinylpyrrolidone (PVP). Ekstrak disaring melalui stocking nilon dan
disentrifugasi dengan kecepatan rendah. Para supernatan diliofilisasi.
Pengujian menunjukkan bahwa infektivitas hilang, sehingga sampel tidak
menunjukkan bahaya karantina, tetapi antigenisitas dipertahankan selama
beberapa bulan.
Pemurnian virus
Untuk produksi mab, virus dimurnikan menurut Garcia et al. ( 1997) dengan
modifikasi. Secara singkat, terinfeksi G. globosa daun dihomogenisasi dalam
10 volume (b / v) dari buffer TACM ditambah karbon aktif. Ekstrak yang
diklarifikasi pelarut diberi dua siklus presipitasi dengan 10% polietilen glikol
(PEG), 1% NaCl dan 0 · 1% Nonidet P40. Sediaan yang dihasilkan
disentrifugasi menjadi gradien kepadatan cesium sulfat 10–40% dalam
buffer TACM pada 310000 g selama 70 menit dalam rotor Beckman SW60Ti.
Fraksi yang berbeda ditarik, diencerkan dalam buffer TACM dan
disentrifugasi pada

Q BSPP 1999 Patologi tanaman ( 1999) 48, 735-741

 Deteksi serologis virus psorosis jeruk
504000 g selama 30 menit dalam rotor Beckman 70Ti (Beckman, Fullerton,
CA, USA). Pelet ditangguhkan di 0 · 2 M. buffer fosfat pH7 · 0.
Langkah-langkah kation fi kasi dipantau dengan pewarnaan negatif uranyl
asetat dan mikroskop elektron (Philips CM 10: Eindhoven, Belanda), dan
oleh DAS-ELISA.
Antibodi
Antiserum kelinci adalah yang dijelaskan oleh Garcia et al.
(1997). Untuk menghasilkan mab, tikus BALB / c yang berumur enam
minggu yang dianestesi disuntikkan dalam limpa dengan virus yang
dimurnikan sebagian yang disuspensikan kembali pada 100 m L saline steril
(hari 0), menggunakan lubang bedah di peritoneum. Pada interval 3 minggu
selama 2 bulan, persiapan virus selanjutnya diresuspensi pada 200 m L salin
diinjeksikan secara intravena. Empat hari setelah injeksi terakhir, serum
setiap tikus dititrasi terhadap virus oleh TAS-ELISA; limpa mouse dengan
titer tertinggi telah dihapus dan sel-sel menyatu dengan sel-sel garis P3 /
X63Ag8 · 653 menggunakan PEG (MW 1500-1700, Sigma, St Louis, MO,
USA) (Perotto et al., 1992). Media bekas dari kultur primer disaring oleh
TAS-ELISA, dan koloni positif dikloning tiga kali pada batas pengenceran
dan kemudian tumbuh sebagai tumor asites pada tikus pristaneprimed.
Isotipe mab yang dipilih ditentukan dalam uji Ouchterlony.
Protokol ELISA
Protokol yang diberikan di bawah ini adalah yang akhirnya tiba di. Dalam
Hasil, data diberikan pada beberapa variasi, semua diuji dengan isolat
homolog, CRSV-4. Satu varian yang memiliki efek penting adalah jenis
pencucian piring. Dua mesin cuci piring otomatis digunakan, W1 dengan jet
bertekanan dan W2 menggunakan umpan gravitasi. Piring-piring juga dicuci
dengan tangan menggunakan semprotan dari botol cuci, mengosongkan
piring, lalu mengetuknya dengan tajam di bangku untuk menghilangkan
semua cairan. Jumlah pencucian juga bervariasi untuk mencapai kondisi
optimal. Varian kedua adalah penggabungan susu tanpa lemak pada
berbagai tahap, termasuk penambahan antigen selama homogenisasi
sampel.
Pembacaan kepadatan optik (OD) dari semua pelat dilakukan secara
berkala, dengan Biorad (Richmond, CA, USA) 3550 Pembaca Lempeng
Mikro (pengukuran 405nm, referensi 490nm). Pembaca piring memusatkan
perhatian pada sumur perbatasan diisi dengan solusi substrat. Data yang
dilaporkan adalah yang dicatat ketika perbedaan antara rasio pembacaan
yang terinfeksi (I) ke sehat (H) adalah yang terbesar.
DAS-ELISA
Imunoglobulin (Ig) G dan konjugat yang berasal dari kelinci antiserum
adalah seperti yang dijelaskan oleh Garcia et al.
(1997). Pelat (Microlon 96W mengikat tinggi; Greiner, Frickenhausen,
Jerman) dilapisi dengan IgG pada 0 · 5 m gmL ¹ 1 dalam buffer lapisan standar
dan diinkubasi pada 37 8 C untuk 4 jam. Piring dicuci dengan
Q BSPP 1999 Patologi tanaman ( 1999) 48, 735-741
737
PBS-TIGA kali dengan tangan, dalam hal ini dan semua langkah mencuci.
Daun jeruk yang sehat atau terinfeksi ditempatkan dalam kantong plastik
dengan 9 bagian (b / v) buffer ekstraksi (PBS-T yang mengandung 2% PVT
dan 2% susu bubuk yang dihilangkan lemak) dan dihomogenisasi dengan
alat penahan bola. Setelah inkubasi semalam dengan homogenate di 4 8 C,
pelat dicuci dan ditambahkan konjugat, diencerkan 1/1000 dalam buffer
ekstraksi. Inkubasi lebih lanjut untuk 4 jam di 37 8 C diikuti dengan pencucian
dan penambahan substrat pada 1mgmL ¹ 1.
TAS-ELISA
Metode Thomas et al. ( 1986) digunakan sebagai berikut. Sumur dilapisi
dengan antiserum mentah yang diencerkan 1/9000 dalam buffer lapisan dan
pelat diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37 8 C. Pencucian piring dan
persiapan serta inkubasi antigen dilakukan untuk DAS-ELISA. Cairan asites
yang mengandung mab, diencerkan 1/32000 dalam buffer ekstraksi,
ditambahkan dan pelat diinkubasi selama 90 menit pada 37 8 Konjugat alkali
fosfatase (Sigma) antimouse IgG (seluruh molekul, dari kelinci) dan
antimouse IgM ( m- rantai-spesifik, dari kambing), diencerkan 1/20000 dalam
buffer ekstraksi, ditambahkan dan diinkubasi selama 90 menit pada 37 8 C.
Substrat (1mgmL ¹ 1) ditambahkan dan OD dibaca setelah dua jam atau lebih.
Noda barat
Ini disiapkan oleh prosedur standar (Sambrook
et al., 1989) menggunakan membran PVDF (Polyscreen, NEN, Life Science
Products, Boston, USA). Antigen diendapkan dari homogenat daun
menggunakan asam triklorasetat (Wu & Wang, 1984). IgG dari kelinci
antiserum selanjutnya diserap silang dengan bahan yang dipreparasi TCA
sehat dan digunakan pada 0 · 9 m gmL ¹ 1. Mab digunakan pada 1/1000
pengenceran cairan asites.
Hasil
Puri fi kasi
Metode yang dijelaskan, mulai dari G. globosa, memberi hasil virus sekitar 1
· 5 kali lebih besar dan agak lebih bersih daripada ketika mulai dari C.
quinoa. Namun, setelah sentrifugasi gradien kepadatan, tidak ada pita
hamburan cahaya yang jelas terbentuk, tetapi zona kaya virus 18-26mm dari
dasar tabung diamati. Infeksi sistemik pada G. globosa memiliki keunggulan
tambahan dalam menyediakan sumber virus selama periode yang panjang.
DAS-ELISA
Protokol yang dijelaskan dalam bagian bahan dan metode meningkatkan
sensitivitas DAS-ELISA empat kali lipat dari yang dilaporkan oleh Garcia et
al. ( 1997). Dalam perbandingan langsung dari metode (Tabel 2: plat A
738 D. Alioto et al.

Meja 2 Perbandingan lima protokol DAS-ELISA dan dua TAS-ELISA menggunakan ekstrak daun jeruk yang terinfeksi CPsV yang sama diencerkan dalam langkah lima kali lipat dari 1/10 hingga 1/31250, menggunakan

ekstrak daun jeruk sehat pada 1/10 sebagai pengencer. A ke G adalah hasil untuk tujuh lempeng yang disiapkan secara bersamaan. A dan F masing-masing merujuk pada DAS dan TAS yang dioptimalkan. Yang lain

seperti yang ditunjukkan. W1 dan W2 adalah dua mesin cuci piring. Angka OD merujuk pada kepadatan optik rata-rata (standar deviasi dalam tanda kurung) untuk 6 sumur (terinfeksi) dan 20 sumur (sehat)

SEBUAH B C D E F G

DAS DAS DAS DAS DAS TAS IgG TAS IgM

Susu plus Susu plus Susu plus Minus susu Minus susu Susu plus Susu plus

Cuci 5 × tangan Cuci 3 × W1 Cuci 3 × W2 Cuci 3 × W1 Cuci 3 × W2 Cuci 5 × Cuci Tangan 5 × tangan

Membaca 1 jam Membaca 1 jam Membaca 1 jam Membaca 3 jam Membaca 3 jam Membaca 3 jam Membaca 3 jam

OD pengenceran AKU H OD AKU H OD AKU H OD AKU H OD AKU H OD AKU H OD AKU H

1/10 1.829 108 2.590 25 2.371 20 1.179 21 1.395 18 2.648 441 2.537 634

(0,31) (0,04) (0.12) (0,03) (0.16) (0,04) (0,05)

1/50 1.897 112 2.229 22 2.313 19 0,935 17 1,049 13 2.431 405 1.996 499

(0,25) (0,09) (0,09) (0,02) (0.17) (0,03) (0.17)

1/250 0,895 53 1.226 12 1.253 11 0,351 6.4 0,407 5 1.672 279 0,921 230

(0,05) (0,07) (0,09) (0,02) (0,04) (0.12) (0.14)

1/1250 0,249 15 0,454 4.5 0,438 3.7 0,128 2.3 0,130 1.6 0,471 79 0,233 58

(0,04) (0,05) (0,03) (0,01) (0,05) (0,07) (0,02)

1/6250 0,066 4 0,153 1.5 0,178 1.5 0,057 1 0,093 1.2 0,115 19 0,053 13

(0,007) (0,010) (0,010) (0,012) (0,009) (0,009) (0,007)

1/31250 0,027 1.6 0,155 1.5 0,141 1.2 0,053 0,9 0,089 1.1 0,036 6 0,022 6

(0,004) (0,039) (0,011) (0,013) (0,018) (0,003) (0,003)

Sehat 0,017 0,102 0,119 0,055 0,079 0,006 0,004

1/10 (0,009) (0,030) (0,028) (0,013) (0,015) (0,002) (0,004)

dibandingkan dengan pelat D dan E), namun, perbedaannya bahkan lebih
besar. Antigen homolog pada jeruk rumah kaca yang terinfeksi terdeteksi
hingga pengenceran jaringan 1/6250 (pelat A, rasio I / H 4). Nilai I / H lebih
dari 100 diperoleh pada pengenceran jaringan dari 1/10 hingga 1/100 dalam
hal ini dan dalam banyak tes lainnya. Semua isolat yang diuji oleh
DAS-ELISA (Tabel 1) muncul positif, sehingga korelasi antara pengindeksan
dan hasil ini tepat.
Virus dalam bahan daun dikeringkan di atas silika atau kalsium klorida
dan disimpan di 4 8 C dapat dideteksi oleh DASELISA selama setidaknya 2
bulan, tetapi pengeringan udara bahan menyebabkan hilangnya
antigenisitas.
Eksperimen untuk mengoptimalkan protokol menunjukkan bahwa prosedur
pencucian piring penting untuk mendapatkan nilai OD yang rendah secara konsisten
untuk persiapan yang sehat, tanpa secara signifikan menurunkan nilai untuk sampel
yang terinfeksi. Mereka juga menunjukkan bahwa menambahkan susu yang
dihilangkan lemak ke dalam antigen dan konjugat memberikan peningkatan,
terutama jika dikombinasikan dengan pencucian menyeluruh.
pengenceran, dari 898, 699 dan 115 untuk lima pencucian tangan, 60, 50 dan
11 untuk tiga pencucian tangan, 14, 13 dan 5 untuk lima pencucian mesin, dan
11, 10 dan 5 untuk tiga pencucian mesin. Cuci tangan tambahan menurunkan
nilai I / H, mungkin karena mereka mulai menghilangkan bahkan beberapa
reaktan yang terikat secara spesifik.
Menambahkan susu juga meningkatkan rasio I / H, seperti yang terlihat dengan
membandingkan, pada Tabel 2, piring B dan C (susu plus) dengan D dan E (minus
susu). Data ini diperoleh dengan menggunakan tiga mesin pencuci standar tetapi
percobaan lebih lanjut menunjukkan bahwa, dengan lima pencucian dengan
tangan, keuntungan memasukkan susu menjadi jauh lebih besar.
Mab
Dua baris sel yang mensekresi mab ke CPsV dipilih. Satu mab adalah IgG1
dan yang lainnya adalah IgM. Titer cairan asites, ditentukan dalam
TAS-ELISA sebagai pengenceran yang memberikan setengah nilai
absorbansi (dataran tinggi) maksimum sekitar 1/256000 untuk IgG dan IgM.

Membandingkan protokol yang ditingkatkan (Tabel 2, pelat A) dengan

pencucian pelat mesin standar dengan salah satu pencuci piring (Tabel 2,
pelat B dan C), rasio I / H sekitar empat kali lebih tinggi untuk semua
pengenceran jaringan hingga 1/1250 didapatkan. Siklus lima mesin pencuci
bukannya pencuci tiga standar tidak secara signifikan meningkatkan rasio I /
H ini. Hasil ini dikonfirmasi dalam percobaan di mana ekstrak getah yang
terinfeksi atau sehat diencerkan 1/10, 1/100 atau 1/1000 dan diuji dalam
piring dicuci tiga atau lima kali, dengan mesin atau dengan tangan. Hasilnya
memberi nilai I / H, untuk ketiganya
TAS-ELISA
Seperti dengan DAS-ELISA, percobaan awal memungkinkan optimalisasi
sistem, dan menunjukkan bahwa efek dari pencucian piring dan termasuk
susu yang dihilangkan lemak dalam antigen, persiapan mab dan konjugat
sama-sama menguntungkan. Mengganti ovalbumin, gelatin atau BSA untuk
susu menghasilkan rasio I / H kurang dari sepertiga tinggi (data tidak
ditampilkan).

Ketika ekstrak serial yang sama diencerkan

Q BSPP 1999 Patologi tanaman ( 1999) 48, 735-741

 Deteksi serologis virus psorosis jeruk
FREKUENSI
Gambar 1 Frekuensi nilai I / H yang berbeda diperoleh dengan
pengenceran sampel 1/10 menggunakan IgG dan IgM mab di
TAS-ELISA. Total 119 sampel daun jeruk dari ladang dan rumah
kaca terwakili. Setiap sampel diuji dengan masing-masing mab.
Perhatikan bahwa tidak ada sampel yang memberikan nilai I / H
dalam rentang 2-10, indikasi bahwa hasilnya selalu positif atau
negatif.
isolat virus homolog dibandingkan dengan DAS dan TAS-ELISA, format
TAS (dengan IgG dan mab IgM) setidaknya lima kali lebih sensitif daripada
sistem DAS terbaik (Tabel 2) dan memberikan nilai I / H di atas
3, dengan kedua mab, pada pengenceran jaringan 1/31250 (Tabel 2, pelat F
dan G). Ini terutama karena nilai TAS H secara konsisten rendah (0 · 001-0 ·
006).
Ketika lima isolat CPsV (CRSV-4, RS-SOR, P216m, P213, dan P215m)
dibandingkan dengan DAS, IgG-TAS dan IgM-TAS yang dioptimalkan, pada
pengenceran jaringan 1/10, nilai I / H untuk masing-masing isolat adalah
8-13 kali lebih tinggi di TAS-ELISA daripada di DAS-ELISA (data tidak
ditampilkan).
Menyaring 119 sampel (termasuk sampel lapangan yang diambil di musim
dingin, dan bahan rumah kaca yang tercantum dalam Tabel 1) pada
pengenceran jaringan 1/10, menggunakan masing-masing mab di
TAS-ELISA, nilai I / H antara 12 dan 3000 ( jelas positif) atau pengelompokan
pada 2 atau kurang (jelas negatif) diperoleh, tanpa nilai dalam kisaran 3-11
inklusif (Gbr. 1).
IgG mab mendeteksi semua isolat yang diuji (Tabel 1), yang
menunjukkan bahwa epitop yang dikenali hadir dalam berbagai isolat dan
sekali lagi mengkonfirmasi korelasi dengan pengindeksan biologis. Dalam
tes paralel IgMmab sama efektif kecuali bahwa itu tidak bereaksi dengan
isolat IAM-320X dari Italia selatan, dan P-121 dan RS-105 dari Spanyol. Di
mana IgM memberikan hasil positif, nilai I / H setinggi dengan IgG, dan
penggunaan mab ini tidak menimbulkan masalah.
Noda barat
Antiserum kelinci bereaksi kuat pada bercak Barat, memberikan pita yang
sesuai dengan protein mantel CPsV (48kDa: Barthe et al., 1998). Igab IgG
bereaksi untuk memberikan pita serupa tetapi hanya pada konsentrasi
antigen empat kali lebih tinggi. IgMmab tidak bereaksi bahkan saat itu.
Hasilnya menunjukkan bahwa antigen terdenaturasi membuat target yang
buruk untuk mab.
Q BSPP 1999 Patologi tanaman ( 1999) 48, 735-741
739
60
50
IgG
IgM
40
30
20
10
0
1-2
2-5
5-10
10-30
30-50
50-100
100-300
300-500
500-1000
1000-3000
H
SAYA/
Diskusi
Hasilnya menunjukkan bahwa TAS-ELISA yang menggunakan IgG mab
adalah alat yang ampuh untuk mendeteksi CPsV, dan harus berguna dalam
program diagnostik dan karantina. Pengujian menjanjikan cukup sensitif untuk
mendeteksi virus dalam konsentrasi rendah, pada musim yang tidak
menguntungkan tahun ini, atau dalam sampel komposit yang mencakup
beberapa bahan sehat. Fakta bahwa ia telah mendeteksi semua isolat yang
tersedia menunjukkan bahwa mab ini dapat bereaksi dengan epitop yang
ditampilkan oleh berbagai varian. IgMmab tidak mendeteksi tiga isolat, tetapi
seharusnya bermanfaat, dengan mab lainnya seperti yang dimiliki Djelouah et
al. ( 1999), dalam membedakan strain CPsV.
DAS-ELISA sangat sensitif dalam bentuk baru tetapi kurang sensitif
dibandingkan TAS-ELISA. Itu masih akan berguna karena ia memiliki
peluang bagus untuk mendeteksi semua isolat CPsV.
Percobaan menunjukkan bahwa faktor-faktor utama dalam meningkatkan
sensitivitas DAS dan TASELISA adalah penggabungan susu yang dibuang
ke buffer ekstraksi dan semua reagen berikutnya (kecuali substrat), dan
pencucian piring secara menyeluruh. Yang terakhir itu penting dalam dirinya
sendiri tetapi menjadi sangat kritis ketika susu digunakan.
Susu yang dihilangkan lemak jarang digunakan dalam buffer ekstraksi
untuk menyiapkan sampel ELISA, dan tidak ada kasus yang ditemukan di
mana ia juga ditambahkan ke buffer konjugat dan pengenceran mab. Ragetli et
al. ( 1982) menggunakannya saat memurnikan Virus ceri kecil dari daun ceri
tetapi tujuannya adalah pemurnian virus, bukan ELISA. Habili et al.
(1997) menggunakannya pada 0 · 5% dalam buffer ekstraksi untuk deteksi ELISA Virus
yang terkait dengan Grapevine leafroll 1, tapi tanpa memberi alasan.
Mencuci piring diperiksa dengan cermat karena perbaikan mengesankan
diperoleh dengan mencuci tangan sebagai lawan dari mesin cuci, meskipun
biasanya tidak ada perbedaan yang dibuat dalam literatur antara keduanya.
Umumnya direkomendasikan tiga jenis pencucian
740 D. Alioto et al.
(misalnya lihat Converse & Martin, 1990; Torrance, 1992; Fox, 1993; Van
Regenmortel & Dubs, 1993) tetapi Tijssen (1985) mencatat bahwa
'sebanyak 6 pencucian mungkin diperlukan alih-alih 2 atau 3 yang
dianjurkan dalam prosedur standar untuk penghilangan lengkap
imunoreaktan yang terikat longgar (hlm. 298). Copeland (1998) menekankan
bahwa cacat dalam kinerja mesin cuci mekanik adalah sumber umum dari
nilai-nilai absorbansi latar yang meningkat, dan bahwa bahkan jika mesin
cuci piring dapat menyedot isi sumur, lebih baik mengosongkannya dengan
tangan. Pelanggan et al. ( 1992) juga mencatat banyak kekurangan dalam
pencuci piring mekanik dan perbaikan yang mungkin dilakukan untuk
mereka. Data saat ini menunjukkan bahwa siklus tiga pencucian mesin
memungkinkan sebagian besar reaktan tidak spesifik tetap di sumur dan
bahwa dua pencucian mesin selanjutnya memberikan sedikit perbaikan.
Sebaliknya, tiga pencucian tangan sudah memberikan hasil yang baik, yang
terus membaik hingga lima pencucian.
Membandingkan protokol yang dilaporkan di sini dengan yang diterbitkan
untuk mendeteksi lima virus lain yang sangat berbeda, baik di host berkayu
maupun herba, ditemukan (M. Gangemi dan D. Alioto, hasil yang tidak
dipublikasikan) bahwa protokol ini memberikan peningkatan I / H yang signifikan,
serupa untuk yang diperoleh dengan CPsV, dalam semua kasus. Pengalaman
ini menunjukkan bahwa ELISA mungkin telah menjadi begitu rutin sehingga
optimasi tidak lagi selalu dipertimbangkan secara serius, dan bahwa pandangan
baru pada beberapa variabel dapat bermanfaat.
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada F. Malavasi atas bantuannya yang luar biasa dan penggunaan
fasilitasnya dalam memproduksi monoklonal; N. Costa,
KS Derrick, K. Djelouah, AM D'Onghia, ML Garcia, P. Moreno dan C.
Roistacher karena telah menyediakan isolat CPsV; dan P. Caciagli, ML
Garcia, P. Moreno, P. Roggero dan CM Roistacher untuk diskusi yang
bermanfaat. Kami berterima kasih kepada K. Djelouah dan kolega (Djelouah et
al., 1999) untuk mengirimi kami makalah mereka sebelum dipublikasikan.
Pekerjaan ini sebagian didanai oleh Kontrak Penelitian INCO-DC Uni Eropa
No. ERBIC18CT960044.
Referensi
Barthe GA, Ceccardi TL, Keremane L, Manjunath L, Derrick
KS, 1998. Virus citrus psorosis: sekuensing nukleotida dari gen protein mantel
dan deteksi dengan hibridisasi dan RT-PCR. Jurnal Virologi Umum 79, 1531–7.
Beumer T, Stoffelen E, Smits J, Carpay W, 1992. Microplate
mencuci: deskripsi proses dan perbaikan. Jurnal Metode Imunologis 154, 77–87.
Converse RH, Martin RR, 1990. Metode ELISA untuk tanaman
virus. Dalam: Hampton R, Ball E, De Boer S, eds. Metode Serologis untuk Deteksi
dan Identifikasi Patogen Tumbuhan Virus dan Bakteri. St. Paul, Minnesota, AS:
APS Press, 179–96.
Copeland R, 1998. Pengujian kadar virus tanaman oleh ELISA.
Dalam: Foster GD, Taylor SC, eds. Protokol Virologi Tumbuhan.
Totowa, NJ, AS: Humana Press, 455–60. D'Onghia AM, Djelouah K, Alioto D,
Castellano MA, Savino
V, 1998. ELISA berkorelasi dengan pengindeksan biologis untuk pendeteksian
virus yang berhubungan dengan citrus psorosis. Jurnal Patologi Tanaman 80, 157–63.
Derrick KS, Brlansky RH, da Grac¸a JV, Lee RF, Timmer LW,
Nguyen TK, 1988. Karakterisasi parsial dari virus yang terkait dengan citrus
ringspot. Fitopatologi 78, 1298–
301.
Derrick KS, Lee RF, Hewitt BG, Barthe GA, 1993. Spiro-
virus: kelompok baru virus tanaman beragam serologis yang terkait dengan
psorosis jeruk dan cincinpot. Dalam: Moreno P, da Grac¸a JV, Timmer LW, eds. Prosiding
Konferensi Keduabelas Organisasi Internasional Ahli Virologi Jeruk 1992. Riverside,
CA, AS: IOCV, University of California, 428–9.
Djelouah K, Potere O, Boscia D, D'Onghia AM, Savino V,
1999. Produksi antibodi monoklonal terhadap virus yang berhubungan dengan
psorosis jeruk. Jurnal Patologi Tanaman dalam pers. Fox RTV, 1993. Prinsip-prinsip
Teknik Diagnostik di Pabrik
Patologi. Kew, Inggris: CAB International. Garcia ML, Sanchez de la Torre ME,
Dal Bo'E, Djelouah K,
Rouag N, Luisoni E, Milne RG, Grau O, 1997. Deteksi virus citrus
psorosis-ringspot menggunakan RT-PCR dan DASELISA. Patologi tanaman 46, 830–6.
Garnsey SM, Timmer LW, 1980. Transmisibilitas mekanik
isolat virus citrus ringspot dari Florida, Texas dan California. Dalam: Calavan EC,
Garnsey SM, Timmer LW, eds.
Prosiding Konferensi Kedelapan Organisasi Internasional Ahli Virologi Jeruk,
1980. Riverside, CA, AS: IOCV, University of California, 174–9. da Grac¸a JV, Lee
RF, Moreno P, Civerolo EL, Derrick KS,
1991. Perbandingan isolat citrus ringspot, psorosis, dan agen citrus mirip virus
lainnya. Penyakit Tumbuhan 75, 613–
6.
Habili N, Fazeli CF, Rezaian MA, 1997. Identifikasi a
klon cDNA yang spesifik untuk virus terkait daun anggur
1, dan terjadinya virus di Australia. Patologi tanaman
46, 516–22.
Milne RG, Garcia ML, Grau O, 1999. Genus Ophiovirus.
Dalam: van Regenmortel MHV, CM Fauquet, Bishop DHL, Carstens E, Estes MK,
Lemon S, Maniloff J, Mayo MA, McGeogh D, Pringle CR, Wickner RB, eds. Taksonomi
Virus. Laporan Ketujuh Komite Internasional tentang Taksonomi Virus. NewYork:
Academic Press, dalam siaran pers. Navas-Castillo J, Moreno P, 1995. Partikel
lunak berserat
cles dan protein serologis terkait ukuran variabel yang terkait dengan psorosis
jeruk dan penyakit ringspot. Jurnal Eropa tentang Patologi Tumbuhan 101, 343–8.
Navas-Castillo J, Moreno P, Cambra M, Derrick KS, 1993
Pemurnian parsial virus yang terkait dengan isolat citrus ringspot dari Spanyol. Patologi
tanaman 42, 339–46. Perotto S, Malavasi F, Butcher GW, 1992. Penggunaan
monoklonal
antibodi untuk mempelajari mikoriza: aplikasi saat ini dan perspektif. Metode
dalam Mikrobiologi 24, 221–48. Ragetli HWJ, Penatua M, Schroeder BK, 1982.
Isolasi dan
sifat partikel mirip virus yang berserat yang terkait dengan penyakit ceri kecil di
Indonesia Prunus avium. Jurnal Botani Kanada 60, 1235–48.
Roistacher CN, 1993. Psorosis - ulasan. Dalam: Moreno P,
Q BSPP 1999 Patologi tanaman ( 1999) 48, 735-741
 Deteksi serologis virus psorosis jeruk
da Grac¸a JV, Timmer LW, eds. Prosiding Konferensi Keduabelas Organisasi
Internasional Ahli Virologi Jeruk, 1992. Riverside, CA, AS: IOCV, University of
California, 139–54.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 1989. Kloning Molekul.
Manual Laboratorium. New York: CSH Press. Thomas JE, Massalsky PR,
Harrison BD, 1986. Produksi
antibodi monoklonal terhadap virus mosaik singkong Afrika dan perbedaan
reaktivitasnya dengan geminiviruses yang ditransmisikan terbang putih lainnya. Jurnal
Virologi Umum 67, 2739–48. Tijssen P, 1985. Praktik dan Teori Enzim Immunoas-
kata. Amsterdam, Belanda: Elsevier.
Q BSPP 1999 Patologi tanaman ( 1999) 48, 735-741
741
Torrance L, 1992. Metode serologis untuk mendeteksi virus tanaman:
Produksi dan penggunaan antibodi monoklonal. Dalam: Duncan JM, Torrance L,
eds. Teknik untuk Deteksi Cepat Patogen Tumbuhan. Oxford: Publikasi Ilmiah
Blackwell, 7–33.
Van Regenmortel MHV, Dubs MC, 1993. Prosedur serologis
Dures. Dalam: Matthews REF, ed. Diagnosis Penyakit Virus Tumbuhan. Boca
Raton, AS: CRC Press, 159–214. Wu FS, Wang MY, 1984. Ekstraksi protein untuk
natrium
elektroforesis gel dodecyl sulfate-polyacrylamide dari jaringan tanaman yang
kaya protease. Biokimia Analitik 139,
100–3.