25

BAB IV
METODE PENELITIAN

4.1. Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Proteksi Tanaman Unit Pendidikan

dan Fitofatologi Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo dari bulan Juni sampai

September 2018.

4.2. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi media TSA (Trypticase Soy

Agar), media PDA (Potato Dextrose Agar), media V8, media King’s B, media MRSB,

larutan KOH 3%, CaCO3, starct, yeast extract, pepton, NaCl, keristal Violet, safranin,

alcohol 70%, alcohol 96%, spritus, plastik wrape, plastik tahan panas, almunium foil,

tisu, aquades steril, buah dan ranting tanaman kakao yang sehat, buah yang teinfeksi P.

palmivora.

Alat yang digunakan dalam percobaan ini meliputi tabung erlenmeyer, cawan

petri, rotary shaker, gelas ukur, scapel, jarum ose, hot plate, stirrer magnetic, pipet

mikro, pipet tetes, tip pipet, mikrotube, scapel, pisau kater, autoclave, sentrifuse, kaca

preparat, kaca objek, mikroskop, kamera dan alat tulis menulis.

4.3. Prosedur Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara bertahap, tahap pertama adalah isolasi P.

palmivora patogen penyebab penyakit busuk buah kakao dan isolasi bakteri endofit asal

jaringan tanaman kakao. Tahap kedua adalah skrining bakteri endofit terhadap P.

palmivora PPKS melalui uji ganda (uji antagonis) dan tahap ketiga adalah uji daya
 26

hambat 20 isolat bakteri endofit terpilih hasil uji skrining tahap kedua terhadap isolat P.

palmivora PPKU dan PPKT, pada tahap selanjutnya merupakan penelitian deskriptif

berupa analisis mekanisme antagonis dan karakterisasi awal bakteri bakteri endofit yang

memiliki potensi antagonis (daya hambat) ≥ 50 % terhadap P. palmivora.

4.3.1. Isolasi dan Persiapan Patogen Uji

Pengambilan sampel untuk patogen uji dilakukan pada tanaman kakao yang

terinfeksi P. palmivora di beberapa sentra pertanaman kakao di Kabupaten Konawe

Selatan, Kolaka Timur dan Kolaka Utara dan isolasi. Patogen diisolasi dari buah kakao

yang terinfeksi gejala patogen P. palmivora. Isolasi patogen dari buah kakao sakit

dilakukan dengan metode moist chamber yang telah dimodifikasi, dimana bagian

tanaman yang bergejala dicuci dengan air mengalir dan kemudian dikeringanginkan.

Selanjutnya bagian tanaman yang sakit dipotong-potong dengan ukuran 1 cm dan

didesinfeksi dengan cara memasukan ke dalam larutan Natrium Hipoklorit 1% selama 3

menit. Potongan jaringan tanaman bergejala dibilas dengan aquades dan

dikeringanginkan. Potongan jaringan tanaman bergejala diinkubasikan di dalam cawan

petri yang telah berisi media V8 padat. Selanjutnya biakan dalam cawan petri

diinkubasi dalam suhu kamar. Hifa P. palmivora yang tumbuh pada jaringan buah di

pindahkan ke medium V8 baru. Koloni P. palmivora yang tumbuh diidentifikasi secara

makrokopis dan mikroskopis lalu dimurnikan dan diberi kode isolat

 27

4.3.2. Isolasi dan Seleksi Bakteri Endofit yang Berpotensi sebagai Agens Hayati
Phytophthora palmivora
4.3.2.1. Isolasi Bakteri Endofitik

Pengambilan sampel untuk bakteri endofit dilakukan pada tanaman kakao yang

sehat di dalam kebun yang terinfeksi P. palmivora di beberapa sentra pertanaman

kakao di Kabupaten Konawe Selatan, Kabupaten Konawe, Kolaka Timur dan Kolaka

Utara. Bagian tanaman yang diambil adalah bagian buah dan ranting tanaman kakao.

Bakteri endofit diisolasi dari sampel menggunakan metode gerus dan teknik

pengenceran sesuai yang dikemukakan oleh Melnik et. al. (2011). Suspensi sampel

hasil gerusan diencerkan secara berseri dalam garam fisiologis 0,8%. Sebanyak 100 µl

suspensi disebar di atas medium TSA (Trypticase Soy Agar) dan diinkubasi pada suhu

28oC selama 2-7 hari. Koloni bakteri yang tumbuh dikarakterisasi bentuk morfologinya

sesuai dengan karakter morfologi secara umum dan diberi kode isolat lalu dimurnikan

dalam medium TSA agar miring dan diinkubasi pada suhu 28oC hingga siap digunakan

untuk pengujian selanjutnya.

4.3.2.2. Seleksi Awal Bakteri Endofit Melalui Uji Daya Hambat

Seleksi awal bakteri endofit melalui uji hambat dilakukan menurut metode

Agustiyani et al. (2014) yang dimodifikasi. Patogen uji yang digunakan pada tahap ini

adalah P. palmivora isolat Konawe Selatan dengan kode isolat PPKS.

Uji aktivitas antagonis bakteri endofit terhadap P. palmivora menggunakan

cross-plug dengan dua ulangan. Satu blok agar-agar P. palmivora yang umur 7 hari dan

berdiameter 5 mm ditumbuhkan ditengah-tengah medium V8 juice dalam cawan petri

 28

lalu diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Setelah 3 hari masa inkubasi masing-

masing 1 ose biakan murni bakteri endofit umur 2 hari digoreskan di tiga sisi cawan

dengan jarak 2 cm dari pinggiran cawan dan 1 sisi dikosongkan sebagai kontrol. Setiap

sisi digoreskan isolat yang berbeda dan setiap isolat diulang 2 kali. Setelah lima hari

inkubasi, zona penghambatan yang terbentuk dari aktivitas bakteri diamati. Persentase

penghambatan dihitung mengikuti rumus yang di kemukakan oleh Soenartiningsih et

al. (2011), yaitu dengan mengukur jari-jari pertumbuhan patogen ke arah tepi cawan

petri (R1) dan jari-jari pertumbuhan patogen ke arah bakteri endofit (R2). Metode

aplikasi bakteri endofit dan patogen P. palmivora pada uji antagonis dapat dilihat pada

Gambar 1..

Keterangan:
(b)
(a) = P. palmivora
(b) = bakteri endofit 1
(a) (c) (c) = bakteri endofit 2
(d) = bakteri endofit 3

(d)

Gambar 3. Metode aplikasi bakteri endofit dan patogen P. palmivora pada uji
antagonis.

4.3.3. Uji Daya Hambat bakteri Endofit Potensil Terhadap 2 isolat P. palmivora

Pada tahap pengujian ini dipilih 20 isolat bakteri endofit yang memiliki aktivitas

terbaik terhadap pengambat P. palmivora pada pengujian Tahap I, sedangkan patogen

 29

target digunakan 2 isolat P. palmivora yaitu Isolat PPKU dan PPKT. Pengujian daya

hambat menggunakan metode cross-plug (Agustiyani et al., 2014) pada media V8 Juice.

Satu crok bor agar-agar P. palmivora umur 7 hari dan berdiameter 5 mm

ditumbuhkan di medium V8 Juice berjarak 3 cm dari sisi dalam cawan petri lalu

diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Setelah 3 hari masa inkubasi masing-masing

1 ose biakan murni bakteri endofit umur 2 hari digoreskan di depan biakan patogen uji

dengan jarak 3 cm. Masing-masing bakteri endofit diuji sebanyak 2 kali sebagai

ulangan. Setelah lima hari inkubasi, zona penghambatan yang terbentuk dari aktivitas

bakteri diamati. Persentase penghambatan dihitung mengikuti rumus yang di

kemukakan oleh Soenartiningsih et al. (2011), yaitu dengan mengukur jari-jari

pertumbuhan patogen ke arah tepi cawan petri (R1) dan jari-jari pertumbuhan

patogen ke arah bakteri endofit (R2). Metode aplikasi bakteri endofit dan cendawan

patogen P. palmivora pada uji antagonis pada tahap II dapat dilihat pada Gambar 2.

Keterangan:

(a) = P. palmivora
(a) (b)
(b) = bakteri endofit

Gambar 4. Metode aplikasi bakteri endofit dan patogen P. palmivora pada uji
antagonis.
 30

4.3.4. Analisis Mekanisme Antagonis Bakteri Endofit terhadap Phytophthora

palmivora

4.3.4.1. Deteksi Enzim-Enzim Pendegredasi Sel Phytophthora palmivora secara In

Vitro

4.3.4.1.1. Uji Kuantitas Aktivitas Protease

Uji aktivitas protease secara kualitatif ditentukan dengan menggunakan metode

disc blank yang telah dimodifikasi. Isolat bakteri diinokulasi pada medium nutrient

broth (NB) dan diinkubasi pada rotary shaker selama 24 jam, Selanjutnya satu ose

biakan bakteri diletakkan dibagian tengah cawan petri yang berisi medium protease-

skim milk agar 1% dengan pH 7.0 yang diulang sebanyak dua kali dan diinkubasi pada

suhu 28oC. Zona bening yang terbentuk disekeliling koloni bakteri diukur diameternya,

dan aktivitas secara kualitatif ditentukan berdasarkan nilai indeks yaitu diameter total

zona dibagi diameter koloni bakteri (Agustiyani et. al., 2014).

4.3.4.1.2 Uji Kualitatif Aktivitas Selulase

Uji akitivitas selulase secara kualitatif ditentukan dengan menggunakan metode

disc black yang telah dimodifikasi. Isolat bakteri diinokulasi pada medium NB dan

diinkubasi pada rotary shaker selama 24 jam. Selanjutnya 1 ose bakteri diletakkan pada

bagian tengah cawan petri yang berisi medium carboxymethyl cellulose (CMC) dengan

dua ulangan dan diinkubasi pada suhu 28oC. Koloni yang tumbuh pada cawan petri

kemudian ditetesi congo red 1%, kemudian diamati terbentuknya zona bening di
 31

sekelilingnya. Aktivitas secara kualitatif ditentukan berdasarkan pada nilai indeks yaitu

diameter total zona dibagi diameter koloni bakteri (Agustiyani et. al., 2014).

4.3.4.1.3. Uji Kualitatif Aktivitas Amilase

Sebanyak satu jarum ose bakteri berumur 2 hari yang ditumbuhkan pada media

NA agar miring dipindahkan ke media YPSs agar dan dibiarkan tumbuh. Setelah satu

atau dua hari inkubasi pada suhu kamar, media selektif yang telah ditumbuhi bakteri itu

di uji dengan meneteskan larutan iod. Apabila bakteri mempunyai aktivitas amilase

maka akan terlihat zona bening disekitar koloni bakteri sedangkan pada bakteri yang

tidak memiliki aktivitas amilase, media disekitarnya akan terlihat berwarna biru.

Aktivitas secara kualitatif ditentukan berdasarkan pada nilai indeks yaitu diameter total

zona dibagi diameter koloni bakteri (Agustiyani et. al., 2014).

4.3.4.1.4. Pengamatan hiperparasit

Pengamatan ini dilakukan pada perlakuan yang menunjukkn aktivitas antagonis

berupa pengambatan pertumbuhan P. palmivora. Pada bagian ujung pertumbuhan hifa

P. palmivora yang berhadapan langsung dengan baktei endofit diambil dengan

menggunakan jarum inokulasi steril dan diletakkan di atas gelas objek yang berisi satu

tetes air steril lalu dituto dengan kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop cahaya

pada pembesaran bertingkat dari 200-400 kali. Adanya aktifitas hiperparasit ditandari

dengan terjadinya degradasi/hancurnya hifa yang diamati.

4.3.5. Karakterisasi Awal Bakteri Endofit

Isolat murni bakteri endofit yang telah di dapat dari hasil seleksi antagonis

selanjutnya dilakukan karakterisasi bakteri endofit meliputi uji pewarnaan Gram dan
 32

reaksi Gram, uji motilitas, uji katalase, uji kebutuhan oksigen dan uji bentuk bakteri

endofit.

4.3.5.1. Uji Pewarnaan Gram dan Reaksi Gram

Kaca objek dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan alcohol dan

dilewatkan beberapa kali pada api bunsen, kemudian di ambil isolate bakteri dengan

jarum ose secara aseptik dan dioleskan pada kaca objek. Isolat bakteri kemudian ditetesi

ungu violet dan dibiarkan selama 3 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan

dianginkan hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi lagi dengan larutan iodine

dan dibiarkan selama 3 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dianginkan

hingga kering. Selanjtnya isolat bakteri ditetesi alkohol 96% selama 30 detik, kemudian

dialiri air dan dianginkan hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi safranin selama

1 menit dan dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan, kemudian dilakukan

pengamatan dengan menggunakan mikroskop. Bakteri Gram positif ditandai dengan

warna ungu yang menunjukan bahwa bakteri tersebut mampu mengikat warna keristal

violet, sedangkan bakteri Gram negatif ditandai dengan warna merah muda yang

menunjukan bahwa bakteri tersebut tidak mampu mengikat warna keristal dan hanya

terwarnai oleh safranin (Yulvizar, 2013).

Uji reaksi Gram dilakukan dengan mengambil isolat murni bakteri dengan jarum

ose. Kemudian isolat diaduk dengan mengangkat berkali-kali jarum ose pada kaca objek

yang telah diberi 2 tetes larutan KOH 3 %. Pengamatan reaksi gram berdasarkan
 33

berlendir/lengket tidaknya jarm ose dengan koloni bakteri. Reaksi positif (Gram

negatif) menunjukan koloni lengket seperti benang, sedangkan reaksi negatif (Gram

positif) menunjukan koloni tidak lengket dengan jarum ose (Junuda, 2015).

4.3.5.2. Uji Motilitas

Sebanyak 1 ose isolat dari stok kultur lalu diinokulasikan dengan cara ditusuk

pada medium tegak semi padat, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Hasil

positif (motil) apabila terdapat rambatan-rambatan disekitar bekas tusukan jarum pada

medium dan hasil negatif (non motil) bila tidak terdapat rambatan-rambatan disekitar

bekas tusukan jarum ose pada medium (Sardiani et al., 2015).

4.3.5.3. Uji Katalase

Sebanyak 1 ose koloni tunggal yang diperoleh dari hasil isolasi dioleskan pada

kaca objek yang telah disterilkan dengan alkohol, kemudian ditetesi larutan H 2O2 3 %.

Preparat diamati, apabila terdapat gelembung gas menunjukan bakteri tersebut katalase

positif dan apabila tidak terbentuk gelembung gas bakteri tersebut katalase negatif

( Suhaeni et al., 2016).

4.3.5.4. Uji Kebutuhan Oksigen

Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat dari stok kultur lalu diinokulasikan pada media

MRS Broth, lalu di sheker selama 24 jam. Hasil positif apabila medium dari warna

bening berubah menjadi warna keruh yang menunjukan bahwa bakteri bersifat anaerob

fakultatif ( Zahidah et al., 2013).

4.3.5.5. Uji Bentuk Bakteri Endofit

 34

Uji bentuk bakteri endofit ini masih berhubungan dengan pewarnaan Gram.

Bakteri hasil pewarnaan gram kemudian diamati bentuk selnya secara mikroskopik pada

kaca preparat sehingga dapat diketahui bentuknya (coccus, basil dan spiral) (Yulvizar,

2013).

4.4. Rancangan Penelitian

Tahapan penelitian yang menggunakan rancangan percobaan adalah tahap ketiga

yaitu uji daya hambat 20 isolat bakteri endofit terpilih terhadap patogen P. palmivora

PPKU dan isolat PPKT yang dilakukan secara terpisah. Tahap ketiga ini dilakukan

dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Percobaan ini menggunakan

20 isolat bakteri yang bersifat antagonis yaitu, 1 BRB1, 2 BRB, 5 BRB3, 2 BWB2, 1

BPL, 3 BAE, 4 RS, 2 RWB2, 2 RPR1, 4 RRB, 5 BAE, 5 BRB1, 1 RWB, 4 BWB2, 3

BPR1, 5 BRB4, 1 BT, 4 BRB, 5 BPR2 dan 4 BWB1 dan sebagai perlakuan dan

diulangi sebanyak 2 kali sehingga terdapat 40 unit percobaan. Pengujian pertama adalah

pengujian daya hambat bakteri endofit terhadap isolat P. palmivora PPKU dan

kemudian dilanjutkan dengan pengujian daya hambat bakteri endofit terhadap P.

palmivora PPKT.

4.5. Variabel Pengamatan

Variabel pengamatan dalam penelitian ini yaitu daya hambat bakteri endofit

terhadap pertumbuhan patogen P. palmivora. Pengamatan daya hambat dilakukan

pada saat 7 hari setelah inokulasi bakteri endofit. Daya hambat dihitung dengan

mengukur jari-jari pertumbuhan cendawan patogen ke arah tepi cawan petri (R1)

dan jari-jari pertumbuhan patogen ke arah bakteri endofit (R2). Selanjutnya data
 35

yang diperoleh digunakan untuk menghitung daya hambat (DH) isolat bakteri

endofit terhadap patogen P. palmivora, dengan rumus yang dikemukakan oleh

Soenartiningsih et al. (2011), yaitu:

R 1−R 2
Daya Hambat = ×100 %
R1

Keterangan:

R1= jari-jari pertumbuhan patogen ke arah tepi cawan petri

R2= jari-jari pertumbuhan patogen ke arah tepi isolat bakteri endofit

Variable pengamatan selanjutnya adalah uji selulase, uji protease, uji

amilase, uji pewarnaan Gram dan uji reaksi Gram, uji motilitas, uji katalase, uji

kebutuhan oksigen dan uji bentuk bakteri endofit.

4.6. Analisis Data

Data hasil pengamatan akan dianalisis menggunakan sidik ragam, jika F-hitung

menunjukan pengaruh nyata atau sangat nyata akan dilanjutkan dengan Uji Jarak

berganda Duncan (UJBD) pada taraf kepercayaan 95%.