Nama : Lisa Yuhana (192211101111)

Al Kautsar (192211101112)

I Wayan Seniarta (192211101113)

Rachmad Hidayat (192211101114)

Kelas : C

Tugas Sebelum Praktikum :

a. Buatlah prosedur ekstraksi simplisia daun jambu biji dengan pelarut etanol (1:10),
metode maserasi! (FHI Jilid I, 2008)

Simplisia Daun Jambu Biji

- Dimasukkan satu (1) bagian serbuk simplisia ke dalam maserator
- Ditambahkan sepuluh (10) bagian pelarut etanol
- Direndam selama 6 jam pertama sambil diaduk
- Didiamkan selama 18 jam
- Maserat dipisahkan dengan cara pengendapan, sentrifugasi, dekantasi atau filtrasi
- Proses penyaringan diulang sekurang – kurangnya dua kali dengan jenis dan jumlah
pelarut yang sama
- Semua maserat dikumpulkan
- Diuapkan dengan penguap vakum atau tekanan rendah

Simplisia Daun Jambu Biji

Hasil Ekstrak:
Pemerian : ekstrak kental, coklat tua, bau khas, rasa khelat
Kadar air : <10%
Abu total : <0,8%
Abu tidak larut asam : <0,2%
Kadar Flavonoid : <1,40%
Penetapan kadar flavonoid total digunakan kuersetin sebagai pembanding dan serapan
diukur pada panjang gelombang 425 nm
Rendemen : <12,3%

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘
Rendemen = x 100%
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

b. Tentukan senyawa marker pada ekstrak etanol daun jambu biji !

Senyawa aktif yang menjadi penciri (marker) pada ekstrak daun jambu biji adalah
kuersetin yang merupakan salah satu golongan flavonoid (FHI Jilid I, 2008)
Rumus Kimia : C15H10O7
 Struktur Kimia :

c. Buatlah prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif dengan KLT-densitometri ! (cari

kondisi optimum KLT ekstrak tersebut, dan nilai RF senyawa marker pada ekstrak
tersebut pada literatur) (FHI Jilid I, 2008)
1) Kondisi optimum KLT eksktrak tersebut, dan nilai Rf senyawa marker pada ekstrak
(FHI Jilid I, 2008)
Fase gerak : Kloroform P : Aseton : Asam Formiat P (10:2:1)
Fase Diam : Silika Gel 60 F254
Larutan Uji : 1% dalam etanol P, gunakan larutan uji KLT seperti tertera pada
kromatografi
Larutan Pembanding : Kuersetin 0,1% dalam etanol P
Volume Penotolan : Totolkan 20 µl larutan uji dan 2 µl larutan pembanding
Deteksi :Alummunium Klorida LP
2) Penjenuhan Bejana
Bahan

- Disiapkan kertas saring dengan tinggi 18 cm dan lebar sama dengan bejana
- Kertas saring dimasukkan ke dalam bejana kromatografi
- Larutan pengembang/fase gerak (kloroform P : Aseton P : Asam Formiat P)
perbandingan (10:2:1) dimasukkan ke dalam bejana kromatografi (chamber)
- Dimasukkan ke dalam bejana kromatografi dengan ketinggian 0,5 – 1 dari dasar
bejana
- Ditutup kedap dan kertas saring dibiarkan hingga basah seluruhnya
- Kertas saring harus selalu tercelup ke dalam larutan pengembang pada dasar
bejana.
Chamber Jenuh

3) Larutan Uji KLT

Bahan

- Ditimbang simplisia kurang lebih sebanyak 1 gram

- Direndam sambil dikocok di atas penangas air deng 10 ml pelarut yang sesuai
selama 10 menit
- Filtrat dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml
- Ditambahkan pelarut sampai tanda
Larutan Uji
4) Prosedur KLT
Bahan

- Lempeng (plat) KLT dipotong dengan ukuran tertentu

- Dibuat batas tanda rambat menggunakan pensil dengan jarak 1,5 sampai 2 dari
tepi bawah dan atas
- Larutan uji dan larutan pembanding ditotolkan pada lempeng dan dibiarkan
kering sebentar
- Lempeng dimasukkan kedalam bejana kromatografi dengan posisi totolan
berada dibawah
- Larutan pengembang (fase gerak) harus menyentuh tepi bawah lempeng namun
semua totolan tidak boleh terendam
- Bejana kromatografi ditutup dan dibiarkan fase gerak merambat pada lempeng
- Lempeng dikeluarkan ketika fase gerak telah mencapai batas rambat dan
dikeringkan sebentar
- Bercak diamati dengan sinar tampak, UV gelombang pendek (254 nm) dan UV
gelombang panjang (366 nm)
- Dicatat jarak tiap bercak dari titik penotolan
- Dicatat panjang gelombang tiap bercak
- Diidentifikasi harga Rf atau Rx
- Jika diperlukan, bercak disemprot dengan pereaksi penampak noda
- Diamati dan dibandingkan kromatogram hasil uji dengan bahan pembanding
Hasil KLT

5) KLT Densitometri
Bahan

- Dilakukan penotolan pada lempeng tidak kurang dari tiga larutan baku dari zat
ditetapkan
- Dilakukan derivatisasi dengan pereaksi dan rekam pantulan (fluorosensi) pada
kromatogram
- Dihitung jumlah zat dalam larutan uji
Hasil

6) Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai
Rf(Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit dengan
Rf baku pembanding atau membandingkan bercak kromatogram sample dengan
kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx).
Penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample pada plat
yang sama.
 7) Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit
dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.
Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :
(a) Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang
diketahui konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Keterangan :
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding
(b) Kurva kalibrasi :
Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari
satu seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus linear, kemudian
dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit.
Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT akan lebih
terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda
kromatogram diukur pada posisi diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar
analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis
lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati parabola

d. Buatlah prosedur uji cemaran bakteri dengan metode angka lempeng total untuk sediaan
obat tradisional berbentuk cair (FI VI, 2020 hal. 1840)
1) Penyiapan Sampel
Disesuaikan dengan sifat fisik sediaan yang diuji :
(a) Sediaan larut air
- Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji (1 dalam 10) dalam larutan
Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2,
atau Soybean-Casein Digest Broth bila perlu atur pH hingga 6 - 8.
- Jika perlu encerkan dengan pelarut yang sama
(b) Sediaan bukan lemak yang tidak larut dalam air
- Encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar
Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH 7,2, atau
Soybean-Casein Digest Broth.
- Dapat ditambahkan surfaktan seperti Polisorbat 80 1 g per L untuk membantu
mensuspensikan bahan yang sulit dibasahi
- jika perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan dengan pelarut yang sama.
(c) Sediaan Berlemak
- Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji dalam isopropil miristat steril
yang disterilkan dengan cara penyaringan atau campurkan sediaan yang akan
diuji dengan sesedikit mungkin surfaktan Polisorbat 80 steril atau surfaktan
non-inhibitor lain steril
 - jika perlu hangatkan dalam tangas air pada suhu tidak lebih dari 40º atau pada
kasus tertentu tidak lebih dari 45º
- Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dalam tangas air.
- Tambahkan secukupnya pengencer yang telah dihangatkan hingga diperoleh
pengenceran 1 dalam 10.
- Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu dengan waktu sesingkat
mungkin untuk pembentukan emulsi.
- Lakukan pengenceran bertingkat dengan pengencer yang sesuai mengandung
surfaktan Polisorbat 80 P dengan kadar sesuai atau surfaktan non-inhibitor
lain steril.
(d) Cairan atau padatan dalam bentuk aerosol
- Pindahkan seluruh isi sediaan dengan cara aseptik dalam penyaring membran
atau wadah steril yang sesuai untuk pengambilan sampel.
- Gunakan seluruh isi atau sejumlah tertentu sediaan dari tiap wadah yang diuji.
- “Transdermal Patches” Lepaskan lapisan, letakkan bagian berperekat
menghadap ke atas pada lempeng kaca steril atau baki plastik.
- Agar tidak saling menempel tutup permukaan berperekat dengan bahan
berpori steril yang sesuai (misal kasa steril)
- kemudian pindahkan lembaran transdermal dalam wadah berisi pengencer
yang mengandung polisorbat 80 P atau lesitin dengan volume yang sesuai.
- Kocok kuat selama tidak kurang dari 30 menit.

2) Metode Tuang
Sampel

- Disiapkan media sekurang – kurangnya dua cawan petri untuk tiap tingkat
pengenceran.
- Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 300-350 selama 3 – 5 hari
dan cawan Sabouraud extrose Agar pada suhu 200 - 250 selama 5 – 7 hari
- Pilih cawan dari satu tingkat pengencean dengan jumlah koloni tertinggi yang
kurang dari 250 untuk ALT dan 50 koloni untuk AKK.
- Hitung jumlah rata – rata koloni dalam media biakan dan jumlah koloni per g atau
ml sediaan
Hasil

Interpretasi hasil :
Angka Lempeng Total (ALT) dianggap sama dengan angka koloni yang ditemukan
pada Soybean-Casein Digest Agar; jika koloni jamur ditemukan pada media ini,
dihitung sebagai bagian dari jumlah ALT. Jika telah ditetapkan kriteria keberterimaan
untuk mutu mikrobiologi, maka di-interpretasikan sebagai berikut:
- 101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 20;
- 102 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 200;
- 103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima = 2000; dan seterusnya
 3) Metode Sebar
Dilakukan seperti yang tertera pada metode tuang

e. Buatlah prosedur uji potensi antibiotik gentamisin sesuai FI VI (hal. 1887)

Komposisi inokula
Kondisi inkubasi yang dianjurkan
Nomor
Antibiotik Mikroba uji
ATCC Waktu Jumlah (mL
media Suhu Media per 100 mL)
(jam)
Gentamisin Staphylococcus 12228 1 32- 24 11 0,03
epidermidis 35
Media Bahan

1 Pepton P 6,0 g
Digesti Pankreatik Kasein P 4,0 g
Ekstrak Ragi P 3,0 g
Ekstrak Daging P 1,5 g
Dekstrosa P 1,0 g
Agar P 15,0 g
Air 1000 ml
PH setelah sterilisasi 6,6 ± 0,1

11 Pepton P 6,0 g
Digesti Pankreatik Kasein P 4,0 g
Ekstrak Ragi P 3,0 g
Ekstrak Daging P 1,5 g
Dekstrosa P 1,0 g
Agar P 15,0 g
Air 1000 ml
PH setelah sterilisasi 8,3 ± 0,1

1) Larutan baku
- larutkan sejumlah baku pembanding yang sesuai dengan antibiotik
- encerkan hingga dosis yang ditentukan.
- Simpan pada suhu 20-80, dan gunakan dalam waktu yang disarankan.
- Pada hari penetapan, siapkan pengenceran dari larutan persediaan 5 atau lebih
larutan untuk pengujian dengan dosis bertahap, umumnya dengan perbandingan
1:1,25.
- Gunakan pengencer akhir yang dinyatakan dan urutan dosis dengan dosis tengah
2) Larutan Sampel
- Tentukan perkiraan potensi per bobot atau volume sampel.
- Pada hari penetapan, siapkan larutan persediaan serta enceran larutan sampel setiap
antibiotik dengan pengencer akhir yang sama seperti untuk baku pembanding
 - Encerkan larutan persediaan sampel dengan pengencer akhir untuk mendapatkan
dosis setara dengan dosis tengah larutan baku (S3).
3) Inokula
- Suspensikan mikroba uji dari biakan segar agar miring atau biakan lain dalam 3
mL salin LP steril.
- Sebarkan suspensi ke permukaan lapisan dari dua atau lebih lempeng agar atau
permukaan media agar dalam botol Roux (menutupi seluruh permukaan) yang
berisi 250 mL media
- Inkubasi selama waktu dan suhu tertentu atau hingga pertumbuhan terlihat jelas.
- Setelah inkubasi, mikroba uji dipanen dari biakan lempeng agar atau botol Roux
dengan lebih kurang 50 mL salin LP steril menggunakan batang kaca bengkok
steril atau butiran kaca steril
- Suspensi dipipet ke dalam wadah kaca steril, dan disebut suspensi persediaan.
- Encerkan sejumlah suspensi persediaan dengan salin LP steril, ukur transmitan
pada panjang gelombang 580 nm menggunakan spektrofotometer UV-Visibel.
- Target nilai transmitan lebih kurang 25% pada panjang gelombang 580 nm.
- Nilai ini digunakan
- untuk membakukan volume suspensi persediaan yang ditambahkan ke dalam
lapisan agar inokula.
- penentuan proporsi dari suspensi persediaan yang ditambahkan ke dalam media
inokula yang menghasilkan diameter zona hambatan yang memuaskan lebih
kurang 14-16 mm pada dosis tengah baku (S3) dilakukan selama verifikasi metode.

Analisis :

- Siapkan lapisan dasar untuk sejumlah cawan Petri penetapan

- Biarkan media memadat membentuk lapisan dasar rata dengan ketebalan seragam.
- Siapkan sejumlah inokula sesuai lapisan inokula sesuai dengan antibiotik dengan
memperhitungkan berdasarkan pada uji pendahuluan.
- Putar lempeng ke depan-belakang untuk menyebarkan inokula di atas permukaan
lapisan dasar, dan kemudian biarkan memadat.
- Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan yang telah diinokulasi dari ketinggian 12
mm, menggunakan alat mekanik atau alat lain untuk menjamin penempatannya
pada radius 2,8 cm, kemudian tutup cawan untuk mencegah kontaminasi.
- Isikan keenam silinder pada tiap lempeng dengan enceran antibiotik dengan tingkat
dosis (S1 – S5 dan U3)
- Inkubasi lempeng selama 16-18 jam
- kemudian seluruh silinder dikeluarkan dari lempeng. Ukur dan catat diameter antar
zona hambatan pertumbuhan mendekati 0,1 mm.
Penetapan cara lempeng

Untuk setiap 12 lempeng, zona 1, 3, dan 5 adalah dosis pembanding dan tiga zona
lainnya merupakan salah satu dosis dari empat dosis lainnya. Kolom lain yang
diperlukan untuk penghitungan seperti dijelaskan berikut ini.

Langkah 1: Lakukan penghitungan awal dan periksa kesesuaian variasi. Untuk setiap
tiga lempeng, rata-ratakan sembilan nilai pembanding dan sembilan nilai baku. Untuk
setiap tiga lempeng, tetapkan simpangan baku dari sembilan nilai pembanding dan
simpanganbaku dari sembilan nilai baku. Untuk setiap simpangan baku, tetapkan
simpangan baku relatifnyaUntuk kriteria kesesuaian variasi, setiap laboratorium harus
menetapkan nilai keberterimaan maksimum untuk simpangan baku relatif. Jika ada
dari 8 simpangan baku relatif (4 untuk pembanding dan 4 untuk baku) melebihi nilai
maksimum yang telah ditetapkan, maka data penetapan yang tidak sesuai harus
dibuang. [Catatan Batas yang dianjurkan untuk simpangan baku relatif adalah tidak
lebih dari 10%.]

Langkah 2: Lakukan koreksi variasi lempeng ke lempeng. Koreksi ini diterapkan

untuk merubah hasil pengukuran rerata zona dari tiap dosis ke nilai yang hanya bisa
jika hasil pengukuran rerata dosis pembanding dari 3 lempeng sama seperti nilai angka
koreksi yang dihitung dengan rumus:

Langkah 3: Penentuan garis kurva baku

Buatlah garis kurva baku dengan menempatkan titik-titik hasil koreksi pengukuran
zona terhadap nilai log dosis baku. Hitung persamaan garis kurva baku dengan
menerapkan garis regresi linear (unweighted linear regretion), menggunakan
perangkat lunak yang sesuai atau penghitungan manual pada Lampiran 1. [Catatan
Gunakan log natural atau log 10 untuk menggambar kurva baku dan tentukan
persamaan regresinya, keduanya memberikan hasil yang sama.] Tiap laboratorium
harus menentukan nilai minimum koefisien determinasi (%R2) untuk regresi yang
dapat diterima. Regresi dapat diterima hanya jika perolehan %R2 melebihi nilai
yang ditentukan. [Catatan Batas minimum koefisien determinasi disarankan tidak
kurang dari 95%.]
Penentuan potensi sampel: Untuk menghitung potensi sampel yang tidak diketahui,
rata-ratakan ukuran zona baku dan zona sampel pada tiga lempeng yang digunakan.
Lakukan koreksi variasi lempeng ke lempeng menggunakan angka koreksi seperti
tersebut di atas untuk memperoleh koreksi rata-rata sampel yang tidak diketahui, Ū.
[Catatan Penghitungan angka koreksi pilihan yang dapat diterima adalah
menggunakan nilai koreksi garis regresi perkiraan berhubungan dengan log dosis
S3.] Gunakan pengukuran rerata zona terkoreksi pada persamaan garis kurva baku
untuk menentukan log dosis sampel LU dengan rumus: