untuk sampel RNA kulit karet, daun karet, Penyimpanan RNA dengan Beberapa
kopi, sawit hibrida, dan embrio kakao juga Perlakuan
mempunyai kualitas RNA yang baik dengan
menghasilkan 2 pita yang utuh ketika Setelah RNA yang diperoleh disimpan
dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa selama 2 bulan dengan beberapa perlakuan.
1% (Gambar 4). Kualitas RNA diamati RNA tersebut diukur kembali konsentrasi dan
dengan melakukan elektroforesis gel agarosa kualitas dengan menggunakan
1%. Adanya RNA yang utuh ditandai dengan spektrofotometer dan elektroforesis gel
adanya 2 buah pita yang utuh pada gel agarosa agarosa 1%. Konsentrasi RNA tertinggi
ketika dilihat dengan menggunakan sinar setelah dilakukan penyimpanan selama 2
ultraviolet, semakin tebal pita tersebut terlihat bulan diperoleh pada perlakuan dengan
semakin bagus pula RNA yang diperoleh. Bila menambahkan sodium asetat dan etanol
pada gel agarosa hanya terlihat 2 pita yang absolut serta disimpan pada suhu 40C.
tidak utuh maka RNA yang diperoleh telah Konsentrasi RNA yang diperoleh pada
terdegradasi atau rusak (Farrell RE 1993). perlakuan tersebut adalah 456 ng/µl untuk
Sebelum dilakukan pengukuran RNA bunga kakao, 2.358 ng/µl untuk RNA
konsentrasi dan kualitas RNA, terlebih dahulu lateks stimulan dan 1.368 ng/µl untuk RNA
dilakukan isolasi RNA dari sampel tanaman lateks nonstimulan . Konsentrasi tersebut
yang akan digunakan untuk penelitian. Isolasi masih lebih rendah dibandingkan dengan
RNA tanaman terdiri atas 3 tahap yaitu tahap konsentrasi RNA kontrol positif yaitu 1.204
pemecahan dinding sel yang meliputi ng/µl untuk RNA bunga kakao, 3.408 ng/µl
penggerusan sampel dengan N2 cair dan untuk RNA lateks stimulan dan 1.374 ng/µl
penambahan bufer ektraksi yang berfungsi untuk RNA lateks nonstimulan . Konsentarsi
untuk memecah dinding sel, selanjutnya yang lebih rendah dari pada konsentrasi RNA
adalah tahap isolasi RNA yang meliputi
ekstraksi dengan fenol:kloroform:
isoamilalkohol (25:24:1), kloroform:
isoamilalkohol (24:1) yang berfungsi untuk
memisahkan lemak, protein dan glukosa serta
pengotor lainnya, dan pengendapan RNA
dengan etanol absolut dan sodium asetat, 1 2 3
tahap selanjutnya adalah tahap pemurnian Gambar 3 Hasil elektoforesis gel agarosa 1%
RNA yang meliputi penambahan LiCl 8 RNA tanaman. Keterangan: (1)
M yang berfungsi untuk memisahkan DNA RNA bunga kakao, (2) RNA
dengan RNA dan pencucian dengan etanol leteks stimulan, (3) RNA lateks
70%. nonstimulan
Selain diperoleh kuantitas, juga diperoleh
kualitas RNA setelah penyimpanan selama 2
bulan dengan perlakuan. Sampel RNA yang
disimpan pada suhu 400C sebagai kontrol
1 2 3 4 5 6 7 8 9 positif mempunyai kualitas RNA yang sangat
Gambar 4 Hasil elektoforesis gel agarosa 1% baik dengan menghasilkan 2 pita yang utuh
RNA tanaman. Keterangan: (1&2) dan tebal ketika dipisahkan dengan
RNA kulit batang karet stimulan elektroforesis gel agarosa 1% (Gambar 5).
dan nonstimulan , (3) RNA daun Berbeda dengan sampel RNA yang disimpan
karet, (4) RNA sawit hibrida, pada suhu ruang sebagai kontrol negatif akan
(5&6) RNA kopi transgenik dan terdegradasi dan mengalami kerusakan, ketika
non trasngenik, (7&8) RNA lateks dipisahkan dengan elektroforesis tidak
stimulan dan nonstimulan , (9) menunjukkan 2 pita yang utuh (Gambar 6).
RNA embrio kakao Penyimpanan RNA pada 40C dengan
penambahan sodium asetat dan etanol absolut
dengan penambahan sodium asetat dan etanol mempunyai kualitas RNA yang baik setelah
absolut dan disimpan pada 40C diperoleh penyimpanan walaupun pita yang terbentuk
pada perlakuan-perlakuan yang lainnya. ketika elektroforesis tidak setebal pita yang
Konsentrasi RNA yang diperoleh dengan terbentuk pada kontrol positif (Gambar 7).
penambahan sodium asetat dan etanol absolut Begitu pula untuk penyimpanan pada suhu -
serta disimpan pada suhu -200C adalah 402 200C dengan penambahan sodium asetat dan
ng/µl untuk RNA bunga kakao, 1.200 ng/µl etanol absolut (Gambar 8) dan penyimpanan
untuk RNA lateks stimulan dan 1.074 ng/µl pada suhu 40C dengan penambahan etanol
untuk RNA lateks nonstimulan , dengan absolut (Gambar 9) juga memiliki kualitas
penambahan etanol absolut dan disimpan RNA yang baik. Sedangkan pada
pada suhu 40C diperoleh konsentrasi RNA penyimpanan pada suhu ruang dengan
sebesar 276 ng/µl untuk RNA bunga kakao, penambahan etanol absolut akan mengalami
1.446 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan kerusakan (Gambar 10).
546 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan, dan Walaupun RNA yang diberi perlakuan
dengan penambahan etanol serta disimpan kualitasnya berkurang tetapi karena
pada suhu ruang diperoleh konsentrasi RNA konsentrasinya masih tinggi, RNA tersebut
sebesar -54 ng/µl untuk RNA bunga kakao, masih bisa digunakan untuk penelitian
3.732 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan selanjutnya. Metode penyimpanan RNA
684 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan terbaik berdasarkan perlakuan yang dilakukan
(Tabel 3). adalah RNA yang ditambahkan sodium asetat
Tabel 3 Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan selama 2 bulan
Perlakuan Suhu Sampel Konsentrasi setelah
penyimpanan penyimpanan
Bunga kakao 1.204
RNA - 400C Lateks stimulan 3.408
Lateks nonstimulan 1.374
Bunga kakao 756
RNA Suhu ruang Lateks stimulan 5.192
Lateks nonstimulan 2.248
RNA dengan Bunga kakao 456
penambahan sodium 40C Lateks stimulan 2.358
asetat dan etanol absolut Lateks nonstimulan 1.368
RNA dengan Bunga kakao 402
penambahan sodium -200C Lateks stimulan 1.200
asetat dan etanol absolut Lateks nonstimulan 1.074
RNA dengan Bunga kakao 276
penambahan etanol 40C Lateks stimulan 1.446
absolut Lateks nonstimulan 546
RNA dengan Bunga kakao -54
penambahan etanol Suhu ruang Lateks stimulan 3.732
absolut Lateks nonstimulan 684
1 2 3 1 2 3
Gambar 5 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA Gambar 8 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman yang disimpan pada - tanaman yang ditambah sodium
400C. Keterangan: (1) RNA bunga asetat dan etanol absolut serta
kakao, (2) RNA leteks stimulan, disimpan pada -200C selama 2
(3) RNA lateks nonstimulan bulan. Keterangan: (1) RNA
bunga kakao, (2) RNA leteks
stimulan, (3) RNA lateks
nonstimulan
1 2 3
Gambar 6 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman yang disimpan pada suhu
ruang Keterangan: (1) RNA bunga 1 2 3
kakao, (2) RNA leteks stimulan, Gambar 9 Elektrofresis gel agarosa 1% RNA
(3) RNA lateks nonstimulan tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada 40C
selama 2 bulan. Keterangan: (1)
RNA bunga kakao, (2) RNA
leteks stimulan, (3) RNA lateks
nonstimulan
1 2 3
Gambar 7 Elektoforesis gel agarosa 1%
RNA tanaman yang
ditambah sodium asetat dan etanol
absolut serta disimpan pada 40C 1 2 3
selama 2 bulan. Keterangan: (1) Gambar10 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
RNA bunga kakao, (2) RNA tanaman yang ditambah etanol
leteks stimulan, (3) RNA lateks absolut serta disimpan pada suhu
nonstimulan ruang selama 2 bulan. Keterangan:
(1) RNA bunga kakao, (2) RNA
dan etanol absolut serta disimpan pada suhu leteks stimulan, (3) RNA lateks
40C, karena selain masih utuh, RNA tersebut nonstimulan
juga memiliki konsentrasi tertinggi
dibandingkan dengan RNA pada perlakuan serta disimpan pada suhu 40C lebih rendah
yang lain. Oleh karena itu, untuk lebih dibandingkan dengan konsentrasi RNA awal.
membuktikan bahwa metode tersebut dapat Hal tersebut menunjukkan bahwa sebagian
digunakan untuk penyimpanan RNA. Metode RNA tetap mengalami kerusakan ketika
tersebut diuji kembali dengan beberapa disimpan dengan penambahan sodium asetat
sample serta diuji ekspresi gen dengan RT- dan etanol absolut. Konsentrasi RNA sampel
PCR. yang tidak diberi perlakuan mencapai 744
ng/µl tetapi setelah ditambah dengan etanol
Penyimpanan RNA dengan Penambahan absolut serta disimpan pada suhu 40C,
Sodium Asetat dan Etanol Absolut Serta konsentrasi RNA yang diperoleh hanya
Disimpan pada Suhu 40C mencapai 324 ng/µl (Tabel 4). Selain itu,
ketika dilakuan elektroforesis, sampel RNA
Setelah penyimpanan pada suhu 40C yang tidak diberi perlakuan lebih utuh
dengan penambahan sodium asetat dan etanol dibandingkan dengan RNA yang telah
absolut selama 2 bulan. Sampel RNA diukur ditambah sodium asetat dan etanol absolut
kembali konsetrasi dan kualitasnya. Lalu juga serta disimpan pada suhu 40C (Gambar 11).
dilakukan RT-PCR yang kemudian Walaupun konsentrasi dan kualitas RNA
dibandingkan dengan hasil RT-PCR RNA setelah ditambah sodium asetat dan etanol
tanpa perlakuan. Konsentrasi RNA yang absolut serta disimpan pada suhu 40C selama
ditambah sodium asetat dan etanol absolut dua bulan lebih rendah dibandingkan dengan
RNA awal, sampel RNA tersebut masih dengan hasil RT-PCR RNA awal tanpa
memungkinkan untuk dipergunakan pada perlakuan dan penyimpanan (Gambar 13).
penelitian yang lebih lanjut. Hal tersebut Kulit karet stimulan, kulit karet nonstimulan,
dapat dilihat pada hasil RT-PCR RNA lateks stimulant, lateks nonstimulan, dan
yang ditambah dengan sodium asetat dan daun karet memberikan ekspresi gen pada
etanol absolut serta disimpan pada suhu 275 Kb sedangkan sawit hibrida, kopi
40C (Gambar 12), RNA tersebut transgenik, kopi nontransgenik dan embrio
memberikan hasil ekspresi gen yang sama kakao memberikan ekspresi pada 516 Kb.
Tabel 4 Hasil pengukuran konsentrasi RNA yang ditambah sodium asetat dan etanol absolut
kemudian disimpan pada suhu 40C selama 2 bulan
No Sampel A 260 A 280 A 230 260/280 260/230 []
(ng/µl)
1 Kulit karet stimulan 0,015 0,010 0,031 1,418 0,480 60
2 Kulit karet nonstimulan 0,039 0,028 0,094 1,407 0,416 156
3 Daun karet 0,032 0,019 0,032 1,687 0,995 128
4 Sawit hibrida 0,024 0,020 0,023 1,214 1,044 96
5 Kopi non trangenik 0,024 0,014 0,017 1,702 1,446 96
6 Kopi transgenik 0,023 0,014 0,016 1,717 1,483 92
7 Lateks stimulan 0,081 0,043 0,052 1,898 1,560 324
8 Lateks nonstimulan 0,037 0,022 0,030 1,689 1,229 148
9 Embrio kakao 0,045 0,025 0,033 1,787 1,337 180
1 2 3 4 5 6 7 8 9 500 Kb
Gambar 11 Elektroforesis agarosa 1%
setelah penyimpanan dengan 250 Kb
penambahan sodium asetat dan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
etanol absolut pada 40C. Gambar 13 Hasil RT-PCR RNA setelah
Keterangan:(1&2) RNA kulit penyimpanan 2 bulan dengan
batang karet stimulan penambahan sodium asetat dan
nonstimulan, (3) daun karet, (4) etanol absolut. Keterangan (1)
RNA sawit hibrida, (5&6) kopi marker, (2) lateks stimulan, (3)
transgenik nontrangenik, (7&8) lateks nonstimulan, (4) kulit karet
lateks stimulan nonstimulan, (9) stimulan, (5) kulit karet
embrio kakao nonstimulan, (6) daun karet, (7)
kopi transgenik, (8) kopi non
transgenik, (9) embrio kakao, (10)
sawit hibrida