Laporan Praktikum Mata Kuliah Biologi Sel dan Molekuler

“ISOLASI PLASMID BAKTERI”

DI SUSUN OLEH :

Nama : Ni kadek adelia

Nim:711345319027

Tingkat : 2B

Mata Kuliah :Biologi sel dan molekuler

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MANADO

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

2020
Judul :

Isolasi Plasmid Bakteri

Tujuan :

Mengetahui cara isolasi DNA dari Plasmid Bakteri

Prinsip :

Isolasi DNA plasmid di lakukan dari bakteri hasil cloning yang telah di konfirmasi
membawa vector plasmid dan di kultur dalam media cair selama 18-24 jam

Dasar Teori :

DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa
yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimdin. Dua purin yang
paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum
adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang
berhubungan. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam
setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Teknik isolasi
DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor,
khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan
diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada
dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently
closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua
untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut
menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan
dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat
memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom (Susanto, 2012).

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang
disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri
 juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal
yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler
double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid
yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid
bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi
ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang
dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa
karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat ditransfer ke bakteri lain
dan memiliki ORI (Origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa
pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ORI hingga semua plasmid
tereplikasi. Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang
lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting
untuk pertumbuhan bakteri. Di alam, gen informasi ini sering mengkode protein yang
akan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik. Plasmid mungkin merupakan hasil
dari perkembangan heterotrop yang tertutup. Bakteri sering tumbuh pada lingkungan
yang sama dengan mold dan fungi dan berkompetisi dengan mereka untuk mendapatkan
makanan (bahan organik kompleks). Sebagai hasilnya, mold dan fungi menghasilkan
toksin untuk membunuh bakteri (dalam dunia kedokteran sering deisebut dengan
antibiotik) agar supaya menang dalam memperebutkan makanannya. Untuk menanggapi
ini bakteri menghasilkan plasmid untuk mempertahankan hidupnya (Jakubowski.
2008). Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar
DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara alamiah pada
bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik maupun
parasitik pada sel inang.

Pra Analitik

Alat dan Bahan

• Isolat bakteri yang akan di panen

• Kit isolasi DNA plasmid
 • Collection tube dan PDH column
• Centrifuge
• Vortex

Analitik

Prosedur Kerja

1.Panen Bakteri

1. Siapkan microtube 1,5 ml steril dan beri label

2. Tuang isolate bakteri ke microtube
3. Sentrifugasi pada kecepatan 16000 x g selama 1 menit pada suhu ruang
4. Setelah selesai keluarkan sampel
5. Buang media (supernatann)
6. Tuang sisa isolate bakteri ke microtube yang sama
7. Sentrifugasi kembali selama 1 menit
8. Lakukan langkah ini hingga di peroleh pellet (natan) yang cukup untuk isolasi plasmid
sekitar 5-8 ml isolate bakteri
9. Setelah selesai sentrifugasi buang supernatant

2.Resuspensi Bakteri

1. Setelah di peroleh pellet yang cukup

2. Tambahkan reagen PD 1 dingin sebanyak 20ul
3. Vortex hingga pellet larut semurna

3.Lisis Sel

1. Tambahkan reagen PD 2 sebanyak 200ul

2. Inveting ( bolak-balik) sebanyak 10x untuk homogenisasi
3. Jangan di vortex untuk menghindari campuran DNA genol
4. Inkubasi suhu ruang selama 2 menit
4.Netralisasi

1. Tambahkan reagen PD3 sebanyak 300ul

2. Inverting kembali sebanyak 10x untuk homogenisasi
3. Centrifugasi dengan kecepatan 16000 x g selama 5 menit pada suhu ruang
4. Siapkan collection tube dan PDH column
5. Beri label agar tidak tertukar

5. Pengikatan DNA ( DNA Binding)

1. Keluarkan sampel dari centrifuge

2. Ambil larutan bening yang terbentuk
3. Hindari endapan putih yang terbentuk jangan sampai itu terambil
4. Pindahkan larutan bening ke PDH column
5. Centrifuge dengan kecepatan 16000 x g selama 30 detik pada suhu ruang
6. Keluarkan sampel dari centrifuge
7. Buang larutan bening dalam collection tube
8. Kembalikan collection tube ke PDH column

6.Pencucian DNA

1. Tambahkan W1 buffer sebanyak 400ul

2. Centrifugasi dengan kecepatan 16000 x g selama 30 detik pada suhu ruang
3. Keluarkan sampel dari centrifuge
4. Dan buang larutan bening dalam collection tube
5. Kembalikan collection tube ke PDH column
6. Tambahkan wash buffer sebanyak 600ul
7. Centrifugasi dengan kecepatan 16000 x g selama 30 detik pada suhu ruang
8. Keluarkan sampel dari centrifuge
9. Buang larutan bening
10. Kembalikan collection tube ke PDH column
11. Centrifuge kembali dengan kecepatan 16000 x g selaa 3 menit pada suhu ruang
12. Keluarkan sampel dari centrifuge
13. Pindahkan PDH column ke microtube 1,5 ml steril yang baru
7.Pelarutan DNA

1. Tambahkan pelarut seperti (NFW) sebanyak 50ul

2. Tambahkan pelarut (NFW) pas di bagian tengah PDH column
3. Inkubasi pada suhu ruang selama kurang lebih 2 menit
4. Centrifugasi dengan kecepatan 16000 x gravitasi selama 2 menit pada suhu ruang
5. Keluarkan sampel dari centrifuge
6. Buang PDH column dan tutup microtube yang berisis DNA plasmid
7. DNA plasmid siap di disekuensing

Pasca Analitik

Hasil Pengamatan

Pembahasan

Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa
DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan
DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda
sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).
 Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa
DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan
DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda
sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana
(vektor) kloning, antara lain adalah :

➢ Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi
dan dimanipulasi
➢ DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara
kimia
➢ Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri
(bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi;
➢ Jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah
banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;
➢ Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga
lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu. (Brock, et
al., 1994).

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada
umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi
sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk
komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim Isolasi DNA merupakan
langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi.
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi
akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet
pada bagian bawah (Campbell 2002).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana
(vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil
sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler
sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of
replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi;
d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam
jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi,
yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi
plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi
dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam
kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan
plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun
atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein,
fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran
fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999).
Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti
lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini
fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi
untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang
merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk
merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan
akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang
tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari
larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform
(membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan,
memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

Kesimpulan
 DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin
dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. DNA tersusun atas 3
komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung
membentuk nukleotida

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut
sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga
memiliki DNA ekstrakromosomal.

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat
di dalam sel prokariot, khususnya bakteri.

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan
harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid.

Referensi:

• https://drive.google.com/file/d/1ALAnm6TP2O7g-
MgR4f0SSIIBmWM4TH8r/view?usp=drivesdk
• https://www.academia.edu/22794618/PRAKTIKUM_BIOMOLEKUL_ISOLASI_DNA_
PLASMID
• https://id.scribd.com/doc/266910460/Laporan-Isolasi-Plasmid-Dan-Kromosom