BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Penelitian ini meliputi

persiapan bahan penelitian, pembuatan ekstrak rambut jagung (Zea mays L.),

skrining fitokimia. Pemeriksaan karakterisasi ekstrak, uji aktivitas ekstrak

terhadap bakteri penyebab infeksi secara difusi agar, pembuatan sediaan gel

handsanitizer, evaluasi terhadap mutu fisik sediaan, pengujiaan aktivitas

antibakteri sediaan dengan metode difusi agar.

3.1.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah simplisia rambut jagung (Zea

mays L), Ekstrak etanol rambut jagung (Zea mays L), Formulasi gel handsanitizer

ekstrak etanol limbah rambut jagung dengan konsentrasi 10%, 15%, dan 20%.

3.1.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah karakteristik simplisia,

skrining fitokimia, evaluasi sediaan gel handsanitizer, dan nilai zona hambat

aktivitas antibakteri Staphylococcus aureus.

3.1.3 Parameter

Parameter yang digunakan dalam penelitian ini adalah pemeriksaaan

kandungan metabolit sekunder simplisia yaitu alkaloid, flavonoid, tannin, saponin,

steroid/triterpenoid, dan glikosida, karakterisasi simplisia yaitu nilai kadar air,

32
 33

kadar abu total, kadar abu tidak larut asam, kadar sari larut dalam air dan kadar

sari larut dalam etanol, uji evaluasi sediaan gel yaitu cycling test, uji organoleptis,

uji homogenitas, uji pH, uji viskositas, uji daya sebar, uji iritasi dan diameter zona

hambat.

3.2 Waktu Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari - April 2020 di laboratorium

Farmasi Terpadu Universitas Muslim Nusantara Al-Washliyah Medan .

3.3 Alat-alat Penelitiaan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: alat-alat gelas

laboratorium, wadah maserasi, blender, rotary evaporator, cawan penguap, cawan

petri, cawan krus bertutup, inkubator, autoklaf, oven listrik (Memmert), neraca

analitik, vortex, lumpang dan stamfer, desikator, pH meter (Hanna instrument),

viskometer, jarum ose, lampu spiritus, mikroskop, stopwatch, alat tanur, jangka

sorong dan seperangkat penentuan kadar air.

3.4 Bahan Penelitian

Bahan – bahan yang digunakan adalah ekstrak rambut jagung (Zea mays L.),

etanol 70%, aquadest, gliserin, metil paraben, media Nutrient Agar ( NA),

Mannitol salt agar (MSA), media Mueller Hinton Agar ( MHA ), larutan NaCl

0,9%, toluen, asam klorida encer, asam klorida 2N, FeCl3, asam sulfat pekat,

natrium hidroksida, serbuk magnesium, suspensi standar MC.Farland, biakan

bakteri Staphylococcus aureus.

 34

3.5 Pembuatan Larutan Pereaksi

3.5.1 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodide ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air

secukupnya sampai kalium iodide larut sempurna. Kemudian 2 g iodium

dilarutkan dalam kalium iodide tersebut, lalu dicukupkan volumenya dengan air

suling hingga 100 ml (Depkes RI, 1995).

3.5.2 Larutan Pereaksi Dragendroff

Bismuth (III) nitrat sebanyak 0,85 g dilarutkan dalam 100 ml asam nitrat,

lalu ditambahkan 40 ml air suling. Pada wadah lain sebanyak 8 g kalium iodide

dilarutkan dalam 20 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan sama

banyak dan disimpan dalam botol berwarna gelap (Depkes RI, 1995)

3.5.3 Larutan Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,35 g raksa (II) klorida dilarutkan dalam 60 ml air suling.

Kemudian pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodide lalu dilarutkan

dalam 10 ml air suling. Kedua larutan dicampur dan ditambahkan air suling

hingga diperoleh larutan 100 ml (Depkes RI, 1995).

3.5.4 Larutan Pereaksi Liebermann-Bouchard

Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 bagian asam

sulfat pekat. Larutan pereaksi harus dibuat baru (Harborne, 1987).

3.5.5 Larutan Pereaksi Asam Klorida

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga

100 ml (Ditjen POM, 1979).

 35

3.5.6 Larutan Pereaksi Asam Sulfat 2 N

Sebanyak 18 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling

secukupnya hingga volumenya 100 ml (Depkes RI, 1995).

3.5.7 Larutan Pereaksi Natrium Hidroksida

Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling

hingga 100 ml (Ditjen POM, 1979).

3.5.8 Larutan Pereaksi Molish

Sebanyak 3 g alfa-naftol ditambahkan beberapa tetes etanol kemudian

dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml (Ditjen POM, 1979).

3.6 Penyiapan Bahan Tumbuhan

Pengumpulan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan sampel,identifikasi

sampel dan pengolahan sampel.

3.6.1 Pengumpulan Sampel

Pengumpulan bahan dilakukan secara positif yaitu tanpa membandingkan

dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang digunakan untuk

penelitian adalah limbah rambut jagung (Zea mays L.), yang diperoleh dari pasar

simpang limun Medan.

3.6.2 Identifikasi Sampel

Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Medanese (MEDA) Universitas

Sumatera Utara Medan.

 36

3.6.3 Pengolahan Sampel

Pengolahan sampel dilakukan dengan mengumpulkan rambut jagung, lalu

dibersihkan dari pengotor yang melekat, kemudian dicuci dengan air mengalir lalu

ditiriskan. Setelah itu sampel disebar di atas kertas perkamen lalu dikeringkan di

lemari pengering sampai kering (kadar air <10%). Lalu sampel di rendam dengan

etannol 1:1,5 selama 24 jam kemudian di keringkan kembali, setelah itu sampel

dihaluskan dengan memnggunakan blender hingga halus, hingga di peroleh

serbuk halus simplisia. Serbuk rambut jagung diperoleh dari hasil pengeringan

sebanyak 5 kg kemudian 500 g diekstraksi dengan cara maserasi.

3.7 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia

3.7.1 Penetapan Kadar Air

Sebanyak 200 ml toluen dimasukkan kedalam labu alas bulat, lalu

ditambahkan 2 ml air suling, kemudiaan alat dipasang dan dilakukan destilasi

selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ±30 menit,

kemudiaan volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0.05 ml.

Kemudiaan ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 gram serbuk simplisia

yang telah ditimbang seksama lalu dipanaskan toluen selama 15 menit, setelah

toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar

air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per

detik.Setelah air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen.

Destilasi dilanjukkan selama 3 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan

mendingin pada suhu kamar setelah air dan toluen memisah semourna. Volume
 37

air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang terdapat

dalam bahan diperiksa kadar air dalam persen (WHO,1972).

3.7.2 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2 garam serbuk simplisia dimasukkan kedalam krus porselin yang

telah dipijarkan dan ditara kemudian krus dipijarkan perlahan-lahan hingga arang

habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500-600°c selama 3 jam kemudiaan

didinginkan dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung

terhadap bahan yang telah dikeringkan ( Ditjen POM,1979).

3.7.3 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total, didinginkan dengan 25

ml asam klorida encer selama 5 menit, sebagian yang tidak larut dalam asam

dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian dicuci dengan

air panas, residu dengan kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap,kemudiaan

didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap

bahan yang telah dikeringkan diudara ( Ditjen POM,1979).

3.7.4 Penetapan Kadar Sari yang Larut Dalam Air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama

24 jam dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1

L) dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama,

kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring, sejumlah 20 ml filtrat pertama

diuapkan sampai kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah

dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap.
 38

Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah

direingkan di udara (Depkes RI, 1995 ).

3.7.5 Penetapan Kadar Sari yang Larut Dalam Etanol

Sebanyak 5 g serbuk simpilisia yang telah dikeringkan di udara,

dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95% dalam labu bersumbat sambil

dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu

disaring cepat untuk menghindari penguapan metanol. Sejumlah 20 ml filtrat

diuapkan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar

dalam persen sari larut dalam etanol 95% dihitung terhadap bahan yang telah

dikeringkan di udara ( Depkes RI, 1995 ).

3.8 Pembuatan Ekstrak Etanol Rambut Jagung

Serbuk simplisia rambut jagung diekstraksi dengan cara maserasi dengan

pelarut etanol.

Cara kerja: Serbuk simplisia sebanyak 500 g dimasukkan ke dalam bejana

tertutup, kemudian dihitung 75 bagian pelarut (3750 ml pelarut ). Aduk merata

larutan tersebut lalu didiamkan 5 hari terlindung dari cahaya matahari. Selama

proses ini, larutan tersebut setiap 6 jam sekali diaduk. Setelah 5 hari, campuran

larutan tersebut diperas dan dipisahkan filtrat dan residu larutan tersebut ( Maserat

I ).

Residu dicuci kembali dengan sisa penyari kemudian disaring (Maserat II).

Gabungkan Maserat I dan II lalu didiamkan selama 2 hari. Kemudian diambil

cairan jernihnya lalu dipekatkan dengan alat rotary evaporator dengan temperatur

tidak lebih dari 50°C hingga diperoleh ekstrak kental (Depkes RI,1979).
 39

3.9 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia dilakukan terhadap sampel uji ekstrak rambut jagung

meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, tanin,

triterpenoid / steroid.

3.9.1 Pemeriksaan Alkaloid

Ekstrak ditimbang masing-masing sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1

ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2

menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai sebagai berikut:

1. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi

mayer,reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna

coklat sampai hitam.

2. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi

Bouchardat. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan

berwarna cokelat sampai hitam.

3. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi

Dragendroff, reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna jingga.

Alkaloid dianggap positif jika terjadi endapan atau kekeruhan sedikitnya

2 reaksi dari 3 percobaan diatas ( Ditjen POM,1995).

3.9.2 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,1 g ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi , lalu

ditambahkan 5 ml aquadest. Kemudian dipanaskan selama lima menit. Setelah itu

disaring dan filtratnya dikocok. Adanya saponin ditunjukkan dengan timbulnya

 40

busa setinggi 1-10 cm selama ± 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan

asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin ( Ditjen POM,1995).

3.9.3 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0.5 g ekstrak disari dengan 10 ml air suling lalu disaring

filtaratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil

sebanyakn 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi FeCl3 jika terjadi warna biru

atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Ditjen POM,1995).

3.9.4 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid

Sebanyak 1 g ekstrak dimaserasi dalam 20 ml n-heksan selama 2 jam

kemudian disaring. Filtrat sebanyak 5 ml diuapkan dalam cawan penguap sampai

kering. Ke dalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhida dan 1 tetes asam

sulfat pekat (pereaksi Liebermann-Bourchard). Terbentuknya warna ungu atau

merah yang berubah menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroid/triterpenoid

(Ditjen POM,1995).

3.9.5 Pemeriksaan Flavonoid

Sebanyak 10 g ekstrak ditimbang kemudiaan ditambahkan 100 ml air

panas,didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml

filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium 1ml asam klorida pekat dan 2 ml

amil alkohol, dikocok kuat dan dibiarkan memisah. Adanya flavonoid ditunjukkan

dengan timnulnya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol

(Ditjen POM,1995).
 41

3.9.6 Pemeriksaan glikosida

Ditimbang 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 96%

dengan air (7:3) dan 10 ml H2SO4 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan

disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4

N dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring, filtrat disari dengan 20 ml

campuran isopropanol dan kloroform (2:3), dilakukan berulang sebanyak 3 kali.

Dikumpulkan sari, lalu diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 59°C, sisanya

dilarutkan dalam 2 ml metanol.

Larutan sisa digunakan untuk percobaan sebagai berikut: diambil 0,1 ml

larutan percobaan, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di

atas penangas air. Pada sisanya ditambahkan 2 ml air suling dan ditambahkan 5

tetes pereaksi Molish. Kemudin secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam

sulfat pekat. Glikosida positif apabila berbentuk cincin berwarna ungu pada batas

cairan ( Depkes RI, 1995 ).

3.10 Pembuatan Formulasi Sediaan

3.10.1 Formulasi Gel Handsanitizer Ekstrak Etanol Rambut Jagung

R/ Ekstrak Rambut Jagung X

Carbopol 940 1g

TEA 2 Tetes

Etanol 70% 60 ml

Metil paraben 0,2 g

Gliserin 1 ml

Aquadest ad 100 ml
 42

Tabel 3.1 Komposisi Formula Sediaan Gel Handsanitizer dengan Ekstrak Etanol

Rambut Jagung

No Nama Bahan F0 FI FII FIII

1 Ekstrak Rambut Jagung (%) - 10 15 20

2 Basis Gel (g) 100 90 85 80

Keterangan : FI = Formula mengandung 10 % Ekstrak rambut jagung

FII = Formula mengandung 15 % Ekstrak rambut jagung
FIII = Formula mengandung 20 % Ekstrak rambut jagung
F0 = Basis Gel
3.10.2 Cara Pembuatan Sediaan Gel Handsanitizer

Karbopol sebagai basis gel dikembangkan dengan aquadest panas dalam

mortir panas setelah itu ditambahkan 2 tetes TEA digerus hingga terbentuk massa

yang homogen. Kemudian ditambahkan metil paraben yang telah dilarutkan

dalam aquadest panas digerus hingga homogen. Kemudian ditambahkan gliserin

digerus homogen, setelah dingin ditambahkn etanol 70 %. Kemudian

ditambahkan ekstrak etanol rambut jagung dengan berbagai konsentrasi kedalam

lumpang sedikit demi sedikit lalu digerus sampai homogen.

3.11 Evaluasi Terhadap Sediaan

Evaluasi formula meliputi evaluasi fisik dan biologi. Evaluasi fisik

meliputi pengujian organoleptis, pengujian homogenitas, pengujian pH sediaan,

pengujian daya sebar sediaan, pengujian viskositas, serta uji iritasi pada kulit.

Evaluasi biologi meliputi penentuan aktivitas antibakteri sediaan gel

 43

handsanitizer ekstrak rambut jagung terhadap Staphylococcus aureus dengan

metode difusi agar.

3.11.1 Pengujian Cycling Test

Sediaan disimpan pada suhu 4±2°C selama 24 jam, kemudian dipindahkan

ke dalam oven yang bersuhu 40±2°C selama 24 jam (satu siklus). Uji ini

dilakukan selama 6 siklus, kemudian diamati adanya pemisahan fase (Banker,

1997).

3.11.2 Pengujian Homogenitas

Sejumlah tertentu sediaan dioleskan pada sekeping kaca transparan,

sediaan harus menunjukkan susunan homogen dan tidak terlihat adanya butiran

kasar (Ditjen POM, 1979).

3.11.3 Pengujian pH Sediaan

Penentuan pH sediaan dilakukan dengan menggunakan pH meter. pH

meter terlebih dahulu dikaliberasi dengan menggunakan larutan daffar standart

pH netral (pH 7) dan larutan daffar pH asam (pH 4) hingga alat menunjukkan

harga pH tersebut. Kemudian alat dicuci dengan air suling, lalu dikeringkan

dengan kertas tissue, kemudia dibuat dengan konsentrasi 1% ditimbang 1 g

sediaan dan dilarutkan dengan 100 ml air suling. Kemudian pH meter dicelupkan

dalam larutan tersebut, sampai alat menunjukkan harga pH yang konstan. Angka

yang ditunjukkan pH meter merupakan harga pH sediaan (Haslina, 2017).

3.11.4 Uji Daya Sebar

 44

Sebanyak 0,5 gram sampel gel diletakkan di atas kaca bulat berdiameter

15 cm, kaca lainnya diletakkan di atasnya dan dibiarkan selama 1 menit. Diameter

sebar gel diukur.Setelahnya, ditambahkan 150 gram beban tambahan dan

didiamkan selama 1 menit lalu diukur diameter yang konstan (Astuti, et al., 2010).

3.11.5 Pengujian Viskositas

Sebanyak 600 g sediaan gel dimasukkan kedalam wadah, lalu dimasukkan

spindel sampai batas pencelupan dan rotor dijalankan. Viskositas diukur

menggunakan viscometer Brookfield dengan spindel No 2 dengan kecepatan 50

rpm (Asngad, 2018).

3.11.6 Pengujian Iritasi Terhadap Sukarelawan

Uji dilakukan terhadap 12 orang sukarelawan untuk mengetahui apakah

sediaan yang dibuat dapat menyebabkan gatal, kemerahan, dan bengkak serta

pengkasaran kulit. Metode yang digunakan dalam uji adalah open test dilakukan

dengan cara mengoleskan sediaan 2-3 kali sehari di area uji yaitu kulit di belakang

telinga selama 2 hari. Reaksi iritasi positif ditandai oleh adanya gatal, kemerahan,

dan pengkasaran kulit pada area uji (Wasitaatmadja, 1997).

3.12 Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi untuk alat-alat yang digunakan antara lain:

1. Alat -alat yang terbuat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas tentukur

dibungkus dengan kertas perkamen, disterilkan dengan menggunakan

oven pada suhu 170°C selama 1 jam.

 45

2. Alat-alat atau bahan-bahan jenis lainnya seperti media disterilkan di

autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

3. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar pada lampu

bunsen.

4. Sebelum mulai daerah sekitar pengerjaan disemprot dengan etanol 70%

dan dibiarkan selama 15 menit sebelum digunakan.

5. Meja dibersihkan dari debu dan dilap menggunakan desinfektan

(Lay,1994).

3.13 Pembuatan Medium Bakteri Uji

3.13.1 Nutrien Agar (Merck)

Komposisi : Beef extract 3,0 g

Pepton 5.0 g

Agar 15,0 g

Medium NA ditimbang sebanyak 28 g dan kemudian ditambahkan air

1000 mL, kemudian dipanaskan sampai jernih. Setelah itu disterilkan di dalam

autoklaf selama 15 menit, pada suhu 121°C dan tekanan 2 atm.

3.13.2 Pembuatan Laruatan NaCl 0,9%

Komposisi Natrium klorida 0,9 g

Air Suling Steril ad 100 ml

Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 0,9 g Natrium Klorida lalu

dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit dalam labu takar 100 ml

sampai larut sempurna. Ditambahkan air suling steril sampai garis tanda,
 46

dimasukkan dalam erlenmeyer steril bertutup lalu disterilkan pada autoklaf suhu

121°C tekanan 1 atm selama 15 menit (Ditjen POM, 1979).

3.13.3 Pembuatan Suspensi Standar Mc. Farland

Suspensi standart yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan suspensi

bakteri sama dengan 108CFU/ml.

Komposisi: H2SO4 1% 99,5 ml

BaCl2 1,175% 0,5 ml

Cara pembuatan: kedua larutan dicampurkan dalam tabung reaksi steril,

dikocok sampai homogen dan ditutup. Apabila kekeruhan hasil suspensi bakteri

sama dengan kekeruhan suspensi standart bearti konsentrasi bakteri 108CFU/ml

(Ditjen POM, 1979).

3.13.4 Pembuatan Agar Miring

10 ml media agar NA yang telah dimasak dimasukkan kedalam tabung

reaksi, ditutup dan dibungkus lalu disterilkan kedalam autoklaf selama 15 menit

pada suhu 121°C kemudian tabung yang berisi agar diletakkan pada kemiringan

30-45°. Diperhatikan bahwa agar tidak menyentuh tutup tabung. Agar dibiarkan

menjadi dingin dan keras (Ditjen POM, 1979).

3.14 Penyiapan Inokulum

3.14.1 Identifikasi Bakteri

 47

Identifikasi bakteri uji dilakukan dengan teknik pewarnaan Gram

yaitu dengan cara sebagai berikut, sebanyak 1 tetes NaCL diteteskan diatas kaca

objek, kemudian disebar setipis mungkin menggunakan ose yang ada

bakterinya yang diambil dari bakteri uji. Selanjutnya difiksasi dengan

melewatkanya diatas api. Dan siap diwarnai. Sebanyak 1 tetes larutan karbol

kristal ungu diteteskan pada preparat di atas dan dibiarkan selama 5 menit,

kemudian dicuci dengan air.

Setelah itu, sebanyak 1 tetes Lugol diteteskan pada preparat dan

dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air, kemudian preparat

dibilas dengan alkohol 70% dengan cara diteteskan alkohol. Selanjutnya dicuci

kembali dengan air, selanjutnya sebanyak 1 tetes larutan air Safranin

diteteskan pada preparat dan dibiarkan selama 1 sampai 2 menit setelah itu dicuci

dengan air dan dibiarkan mengering. Bentuk dan warna sel bakteri dalam preparat

diamati secara mikroskopik pada perbesaran 100 x.

3.14.2 Peremajaan Bakteri

Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose

steril, lalu ditanam pada media Nutrient Agar (NA) miring dengan cara

Menggores nya dengan bentuk zig-zag. Media tersebut selanjutnya diinkubasi

dalam incubator pada suhu 36-37⁰C selama 18-24 jam (Ditjen POM,1995).

3.14.3 Pembuatan Stok Kultur Bakteri

Masing-masing sebanyak 1 ose dari biakan murni bakteri Staphylococcus

aureuss di goreskan dengan metode sinambung pada permukaan media NA

 48

miring kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C (Ditjen POM,

1979).

3.14.4 Pembuatan Inokulum Bakteri

Bakteri hasil inkubasi dengan menggunakan jarum ose steril lalu

disuspensikan kedalam tabung yang berisi 10 ml larutan NaCl 0.9 % steril,

kemudian di homogenkan dengan vortex hingga diperoleh kekeruhan suspensi

bateri yang sama dengan kekeruhan standar Mc. Farland, ini bearti konsentrasi

suspensi bakteri adalah 108CFU/ml. Setelah itu dilakukan pengenceran dengan

memipet 0,1 ml biakan bakteri (108CFU/ml), dimasukkan kedalam tabung steril

yang berisi larutan NaCl 0.9 % sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen, maka

diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi 106 CFU/ml (Ditjen POM, 1979).

3.15 Pengujian Aktivitas Antibakteri Terhadap Handsanitizer Rambut

Jagung (Zea mays L.)

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap handsanitizer rambut

jagung, pengujian ini dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan

sumuran.

Cara kerja: Kedalam cawan petri steril dimasukan suspensi inokulum bakteri

Staphylococcus aureus sebanyak 0,1 ml kemudian di tambahkan 25 ml media

MHA steril yang telah dicairkan, setelah memadat, media dilubangi dengan

pencetak lubang (punch hole). Selanjutnya dimasukkan ekstrak sebanyak 0,1 ml

ke masing masing lubang yang telah di buat dengan berbagai variasi konsentrasi.

Pra inkubasi selama 15 menit, kemudia di inkubasi dengan suhu 36-37°C selama
 49

18-24 jam, selanjutnya diameter daerah hambat disekitar lubang diukur dengan

menggunakan jangka sorong.