LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIM II

TEKNIK PEMURNIAN PROTEIN METODE SDS-PAGE

Oleh :

Nama : M Ridho Ramadhan

NIM :1808511026

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2020
 TEKNIK PEMURNIAN PROTEIN METODE SDS-PAGE
I. Tujuan
1. Menentukan nilai Rf dan Berat Molekul (BM) dari sampel
2. Mengetahui fungsi penambahan akrilamid dan UGB pada percobaan
3. Mengetahui fungsi penambahan Amonium Persulfat (APS) pada percobaan
4. Mengetahui larutan yang digunakan pada pewarnaan pita protein
5. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pada percobaan SDS-PAGE
6. Mengetahui prinsip dari elektroforesis
II. Dasar Teori

Protein, yang namanya berarti “pertama” atau “utama” merupakan makromolekul

yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lenih dari setengah berat kering pada
hamper semua organisme. Struktur protein yang terdiri dari polipeptida mempunyai
rantai yang amat panjang, tersusun atas banyak unit asam amino Protein yang akan
dimurnikan pada praktikum ini adalah LDH (Laktat dehidrogenase). Dimana LDH ini
merupakan enzim. Protein yang paling bervariasi dan mempunyai kehususan tinggi
adalah protein yang mempunyai aktivitas katalisa, yakni, enzim. Hampir semua reaksi
kimia biomolekul organic di dalam sel dikatalisa oleh enzim. Lebih dari 2000 jenis enzim,
masing-masing dapat mengkatalisa reaksi kimia yang berbeda, telah ditemukan di dalam
berbagai bentuk kehidupan. (Lehninger, 1982)
Pemurnian protein, untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai
aktivitas yang tinggi, perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi
pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis substrat yang digunakan. (Wang, 1979)
Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran
berdasarkkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan dibawah pengaruh medan
listrik. Cara elektroforesis telah diigunaakan untuk analisa virus, asam nnukleat, enzim,
dan protein lain, serta molekul-molekul organik dengan berat molekul rendah seperti asam
amino. (Westermeier, 2004)
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Elektroforesis (SDS-PAGE) adalah
teknik untuk memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya
untuk bergerak dalam arus listrik, yang merupakan fungsi dari panjang rantai polipeptida
atau berat molekulnya. Hal ini dicapai dengan menambahkan deterjen SDS dan pemanasan
untuk merusak struktur tiga dimensi pada protein dengan terpecahnya ikatan disulfide yang
selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidhihidril. SDS akan membentuk kompleks
dengan protein dan kompleks ini bermuatan negativ karena gugus-gugus anionic dari SDS
(Hemes,1998).

Gambar 1.1. Skema SDS PAGE

SDS adalah detergen anionik yang dapat melapisi protein, sebagian besar sebanding
dengan berat molekulnya, dan memberikan muatan listrik negatif pada semua protein
dalam sampel. Protein glikosilasi mungkin tidak bermigrasi, karena diharapkan migrasi
protein lebih didasarkan pada berat molekul dan massa rantai polipeptidanya, bukan gula
yang melekat. SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai
deterjen yang mengakibat ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat
terelusi dalam gel begitu juga mercaptoetanol. SDS dapat mengganggu konformasi
spesifik protein dengan cara emelarutkan molekul hidrophobik yang ada di dalam struktur
tersier polipeptida. SDS mengubah semua molekul protein kembali ke struktur primernya
(struktur linear) dengan cara meregangkan gugus utama polipeptida. Selain itu, SDS juga
menyelubungi setiap molekul protein dengan muatan negatif (Azira, 2012).
Poliakrilamid merupakan polimer dari monomer akrilamid. Saat poliakrilamid
berbentuk gel, maka akan terbentuk pori-pori kecil yang membentuk labirin atau
terowongan dan saluran yang memungkinkan molekul bergerak (migrasi). Poliakrilamid
merupakan medium yang tepat untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran karena
ukuran pori-pori kecil yang memungkinkan untuk memperlambat gerakan molekul. Gel
poliakrilamid terbentuk dari proses polimerisasi radikal bebas akrilamid dan agen cross
linking N N’ methylene bis acrylamide.(Hames, 2004)
 Gambar 1.3. Prinsip reaksi pembentukan poliakrilamid
Analisis menggunakan SDS-PAGE ini gel poliakrilamid yang digunakan terdiri dari
2 yaitu stacking gel dan resolving gel. Stacking gel berfungsi sebagai gel tempat
meletakkan sampel, tedapat beberapa well, sedangkan resolving gel merupakan tempat
dimana protein akan bergerak/berpinadah menuju anoda. Stacking gel dan resolving gel
memilikikomposisi yang sama, yang membedakan hanya konsentrasi gel poliakrilamid
pembentuknya, dimana konsentrasi Stacking gel lebih rendah daripada resolving gel.
Komponen penting yang membentuk gel poliakrilamida adalah (Hames, 2004) :
1. Akrilamida, sebagai senyawa utama yang menyusun gel dan merupakan senyawa
karsinogenik (Hermanto, 2013).
2. Bis akrilamida, berfungsi sebagai cross‐linking agent yang membentuk kisi‐kisi
bersama polimer akrilamida. Kisi‐kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul
protein. Perbandingan antara akrilamida dengan bis akrilamida dapat diatur sesuai
dengan berat molekul protein yang dipisahkan . Semakin rendah berat molekul protein
yang dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi akrilamida yang digunakan agar
kisi‐kisi yang terbentuk semakin rapat (Hermanto, 2013).
3. Amonium persulfat (APS), berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida
agar bereaksi dengan molekul akrilamida yang lainnya membentuk rantai polimer
yang panjang (Kageyama, 1987).
4. TEMED (N,N,N’,N’ tetrametilendiamin), berfungsi sebagai katalisator reaksi
polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam
pemisahan protein (Hermanto, 2013).
Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dibandingkan dengan gel
lainnya, seperti : Tidak bereaksi dengan sampel, Tidak membentuk matriks dengan
sampel, Tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan protein
secara sempurna, Mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi (Hermanto, 2013).
Prinsip penggunaan metode gel poliakrilamid ini adalah migrasi komponen
akrilamida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi – kisi tersebut berfungsi sebagai saringan
molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk
mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk
menentukan berat molekul suatu protein disamping untuk memonitor pemurnian protein
(Wilson dan Walker, 2000). SDS‐PAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan
kekuatan ion rendah dan dapat menentukan apakah suatu protein termasuk monomerik
atau oligomerik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit
atau monomer (Wu, 2006)
Prinsip dasar analisa dengan SDS-PAGE adalah :
1. Larutan protein yang akan dianalisis dicampur dengan SDS terlebih dahulu, SDS
merupakan detergent anionik yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan
negatif dalam range pH yang luas. Muatan negatif SDS akan mendenaturasi
sebagian besar struktur kompleks protein, dan secara kuat tertarik ke arah anoda
bila ditempatkan pada suatu medan elektrik.(Fatchiyah, dkk., 2011)
2. Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui gel poliakrilamid,
menuju kutub positif (anoda), molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat
daripada yang besar, sehingga akan terjadi pemisahan (Bollag, 2009).
3. Pada proses eleltroforesis dengan SDS dilakukan di dalam gel poly acrylamide,
molekul protein akan melewati pori – pori gel, sehingga kemudahan pergerakan
melalui pori tergantung pada diameter molekul (Azira, 2012).
4. Molekul yang lebih besar akan tertahan dan akibatnya bergerak lebih lambat.
Karena molekul terdenaturasi, diameternya tergantung dari berat molekulnya.
Makin besar diameter molekulnya, semakin lambat gerakannya (Alberts, 2009).
5. Dengan demikian, SDS–PAGE akan memisahkan molekul berdasarkan BM-nya.

Gambar 1.5. Alur Kerja SDS PAGE

Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarna
khusus, beberapa pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE adalah:
 1. Commasie Brilliat Blue, mengikat protein secara spesifik dengan ikatan kovalen
(Suranto, 2006).
2. Silver Salt Staining, memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun membutuhkan
proses yang lebih lama (Wilson, 2000).
III. Alat dan Bahan
3.1 Alat
 Seperangkat alat elektroforesis
 Kaca load
 Comb (sisir)
 Mikropipet
 Mikrotip
 Beaker glass
 Timbangan analitik
 Spatula
 Tube elektroforesis
 Kompor listrik
 Kuvet
 Spektrofotometer UV-VIS
3.2 Bahan
 Aquades
 Akrilamid
 LGB (Lower Gel Buffer)
 UGB (Upper Gel Buffer)
 TEMED (Tetra Etil Metil Ethilene Diamine)
 APS (Amonia persulfat)
 Pepsin
 Running Buffer (berisi SDS)
 Larutan pewarna (Croomasil Brilian Blue, metanol, asam asetat glasial,
aquabides)
 Larutan pembilas (metanol, asam asetat glasial, aquabides)

IV. Prosedur Percobaan

Secara Garis Besar, langkah-langkah metode SDS-PAGE adalah sebagai berikut.
1. Gel pemisah (separating gel) dibuat
 2. Gel pengumpul (stacking gel / upper gel) dibuat
3. Sampel dipanaskan
4. Dilarutkan. Runing pada plate 1 dengan arus 28A dengan tegangan 110V dan
pada plate 2 dengan arus 30A dan tegangan 130 V.
5. Gel direndam dalam larutan staining untuk proses pewarnaan selama 20 menit
6. Gel direndam dalam larutan destaining (Penghilangan warna) untuk proses
pencucian 20 menit
4.1 Persiapan Gel
a Separating gel 12,5% dibuat dengan cara :
 Tabung polipropilen 50 mL disiapkan
 3,125 ml stock akrilamid dimasukkan ke dalam tabung
 2,75 ml 1M tris pH 8,8 dimasukkan ke tabung ditutup, lalu digoyang dengan
shaker secara perlahan-lahan.
 Aquabides 1,505 ml dimasukkan dan tabung ditutup, lalu digoyang dengan
shaker secara perlahan-lahan
 5 µl SDS (sodium dodesil sulfat) 10% dimasukkan, tabung ditutup, lalu
digoyang dengan shaker secara perlahan-lahan
 75 ml APS (amonium persulfat) 10% dimasukkan, tabung ditutup, lalu
digoyang secara perlahan
 6,25 µl TEMED dimasukkan, tabung ditutup lalu digoyang dengan shaker
secara perlahan
 Larutan dituang dengan segera ke dalam plate pembentuk gel menggunakan
mikro pipet 1 ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung udara) sampai
batas yang terdapat pada plate.
 Aquades/n-BuOH ditambahkan secara perlahan diatas larutan gel dalam plate
agar permukaan gel tidak bergelombang.

b Gel dibiarkan memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan

terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk) setelah
itu, air/n-BuOH yang menutup separating gel dibuang.
c Setelah separating gel memadat, stacking gel 3% disiapkan dengan cara yang
sama pada prosedur diatas dengan volume larutan:
 30% acrylamide-bis 0,45 mL
  1M tris pH 6,8 0,38ml
 Aquabidest 2,11 ml
 10% SDS 30 µl
 TEMED 5 µl
 10% APS 30 µl
d Kemudian stacking gel dituang
e Sisir dipasang pada tempat penyuntikan sampel, kemudian dibiarkan beberapa
lama hingga gel memadat
f Sisir dilepas
g Gel dalam plate dipasang pada alat elektroporesis ‘set mini protean II Dual Slab
Cell Bio- Rad’ (Vertical Slab Cells) spesifikasinya sbb:
Inner cooling core : Molded liquid crystal polymer
Clamp assemblies : Glass filled liquid crystal polymer
Clamps with acrylic pressure plate
Lower buffer chamber, lid, casting stand: molded polycarbonate Electrodes :
Platinum wire 0,254mm diameter
Combs : Teflon
Spacers : PVC
Shipping weight : 2,2 kg
Overall size : 16 cm (L)x 12 cm (W) x 18 cm (H)
Gel size : 7 cm (L) x 8 cm (W)
Glass plate size : inner 7,3 cm x 10,2 cm
outer 8,3 cm x 10,2 cm
h Running buffer dituang

4.2 Injeksi Sampel dan Running

1. Enzim murni/ ekstrak murni/ isolat dipipet sebanyak 15 µl kemudian dimasukan
kedalam eppendorf
2. Ditambahkan dengan 15µl RSB dan panaskan pada suhu 1000C selama 2 menit
3. Dinginkan pada suhu kamar.
4. Sampel disuntikkan sebanyak 10-20 µl kedalam sumur secara hati-hati dengan
menggunakan Hamilton syringe.
5. Syringe dibilas dengan air atau runing buffer sebelum dipakai untuk memasukan
sampel yang berbeda pada sumur gel berikutnya
 6. Untuk memulai running, perangkat elektroporesis dihubungkan dengan power
supply dengan arus pada plate 1 28 mA tegangan 110 V dan Plate 2 30 mA
dengan tegangan 130V
4.3 Pewarnaan Gel
a Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada gel dan
larutan destaining untuk pencucian atau menghilangkan warna pada gel dan
memperjelas band protein yang terbentuk.
1. Untuk membuat larutan staining 1 liter diperlukan
 Coomassie Blue R-250 1,0 g
 Methanol 450 mL
 Aquades 450 mL
 Asam Asetat Glasial 100 mL
2. Untuk membuat larutan destaining 1 liter diperlukan
 Methanol 100 mL
 Asam Asetat Glasial 100 mL
 Aquades 800 mL
b Gel direndam di dalam 20 ml larutan staining solution sambil digoyang dengan
shaker selama 20 menit, kemudian larutan staining dituang kembali ke
wadahnya.
c Kemudian dicuci dalam 150 ml asam asetat / larutan TCA 12,5%
d Gel direndam dalam larutan destaining sambil digoyang selama 20 menit
e Dicuci dengan asam asetat/ larutan TCA 12,5% sampai bening
V. Data Pengamatan
Protein
BM Panjang pita Log (BM)
Marker RF
(KDa) (cm)

I 225 2,3 2,352 0,479

II 150 2,6 2,176 0,542

III 100 2,9 2 0,604

IV 75 3,5 1,875 0,729

 V 50 4,1 1,698 0,854

VI 35

VII 25

VI. Pembahasan
Pada percobaan Elektroforesis SDS hal yang pertama kali dilakukan yaitu preparasi
sampel dan bahan. Sampel yang digunakan yaitu enzim pepsin. Sampel pepsin masing-
masing ditimbang dengan timbangan analitik sebanyak 0,005 gr, 0,0075 gr, 0,01 gr, 0,0125
gr, dan 0,015 gr. Kemudian masing-masing sampel dibungkus dengan kertas alumunium
foil. Proses selanjutnya yaitu pembuatan separating gel (gel pemisah). Namun sebelum
pembuatan separating gel dilakukan preparasi bahan-bahan penyusunnya seperti APS.
Untuk APS (Amonium persulfat) ditimbang sebanyak 0,1 gram. APS digunakan sebagai
inisiator yang dapat mengaktifkan akrilamid agar bereaksi dengan gel poliakrilamid lain
membentuk rantai polimer yang panjang.
Separating gel yang akan dibuat berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi
protein berdasarkan berat molekulnya. Pertama dimasukkan aquades 1700 µL, 30%
Akrilamid 200 µL, dan LGB 1300 µL ke dalam beaker glass. Penambahan akrilamid
berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada proses pemisahan gel sedang LGB sebagai
buffer. Setelah itu dimasukkan 10% APS 40 µL dan TEMED 35 µL secara bersamaan
dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara sempurna. Setelah itu diaduk supaya
homogen.
Sebelum separating gel dimasukkan ke dalam cetakan, terlebih dahulu kaca loading
dibersihkan dengan cara dibilas menggunakan aquades sampai bersih kemudian di lap
searah menggunakan tisu,hal ini bertujuan agar kaca tidak tergores sehingga mempengarui
proses analisis yang dilakukan. Setelah itu kaca loading dipasang pada alat elektroforesis,
separating gel yang telah dibuat dimasukkan kedalam cetakan dengan menggunakan
mikropipet sampai pada batas yang ditentukan yakni sekitar ¾ bagian dan ¼ bagian
sisanya digunakan untuk stacking gel. Setelah itu gel dibiarkan terpolimerisasi dalam suhu
ruang selama 15 menit. Kemudian dituangkan sedikit aquades untuk membuat permukaan
separating gel datar/gel yang dibentuk tidak bergerigi yang dapat menyebabkan adanya
sekat diantara separating gel dengan stacking gel yang dapat mengganggu proses
pemisahan molekul. Aquades yang ditambahkan kemudian diserap dengan menggunakan
tisu agar tidak mempengaruhi gel yang terbentuk.
Selanjutnya dibuat stacking gel (gel pengumpul). Cara pembuatan stacking gel hampir
sama dengan pembuatan separating gel, yang membedakan yaitu banyaknya atau jumlah
yang ditambahkan. Selain itu pada stacking gel digunakan UGP (Upper gel buffer) sebagai
buffer pada gel. Langkah pembuatanya yaitu pertama dimasukkan aquades 1475 µL, 30%
Akrilamid 400 µL, dan UGB 625 µL ke dalam beaker glass. Penambahan akrilamid
berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada proses pemisahan gel sedangkan UGB
sebagai buffer. Setelah itu dimasukkan 10% APS 20 µL dan TEMED 4 µL secara
bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara sempurna. Setelah itu
diaduk supaya homogen.
Stacking gel dimasukkan keatas gel pemisah dan disisipkan gigi sisir yang berfungsi
untuk mencetak sumuran yang akan digunakan sebagai tempat meneteskan sampel. Gigi
sisir dibiarkan sampai gel terpolimerisasi pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah
terbentuk sumuran selanjutnya gigi sisir diambil dari gel. Gel yang telah terbentuk
kemudian dipindahkan ke dalam tank elektroforesis dan siapkan digunakan untuk proses
selanjutnya.
Sementara itu, sampel pepsin yang masing-masing telah ditimbang sebanyak 0,005
gr, 0,0075 gr, 0,01 gr, 0,0125 gr, dan 0,015 gr yang dibungkus alumunium foil masing-
masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf lalu ditambahkan masing-masing sampel
buffer sebanyak 0,5 µL yang didalamnya mengandung SDS yang akan memberikan
muatan negatif pada sampel yang dianalisis serta β-mercaptoetanol yang dapat mereduksi
ikatan disulfida pada protein. Kemudian sampel dipanaskan diatas kompor listrik sehingga
sampel dapat terdenaturasi sempurna pada suhu 90˚C selama 5 menit. Selanjutnya sampel
diangkat dan didinginkan untuk selanjutnya dilakukan proses analisis. Sampel yang telah
tersedia kemudian dimasukkan ke dalam sumuran sebanyak 0,01 µL. Kemudian alat
elektrolisis dipasang dan dimasukkan buffer tank ke dalam tank elektrolisis sampai pada
batas sumuran. Buffer ini digunakan sebagai penghantar listrik yang akan membantu
memisahkan sampel saat alat dinyalakan.
Pada proses pewarnaan, gel yang telah dielektroforesis dipindahkan dari tank kedalam
wadah plastik. Pewarnaan (staining) pita protein dilakukan dengan jalan merendam gel
hasil elektroforesis (setelah dilepas dari rangkaian plat) dalam larutan Coomasie brilliant
blue (CBB) lalu gel yang terdapat dalam wadah plastik dishaker selama 15 menit,
penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh
CBB. kemudian dilakukan destaining untuk menghilangkan kelebihan warna dengan jalan
merendam gel dalam larutan destaining (aquabides, metanol, asam asetat glasial dan
Coomasie brilliant blue) dan dishaker selama 10 menit. Selain itu, perendaman dengan
larutan destaining bertujuan untuk menghilangkan CBB yang tersisa dan memperjelas
band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB yang tidak berada pada band
protein. Setelah itu dilakukan pencucian lagi dengan aquades serta dimasukkan potongan
kertas saring untuk menyerap warna yang akan dibilas hingga gel menjadi jernih dengan
pita terpisah jelas satu sama lainnya. Pembilasan berfungsi untuk menghilangkan sisa
larutan destaining dan menghentikan pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining.
Kemudian dilakukan penghitungan Rf (Retention factor) pada sampel yang telah terpisah
yang kemudian digunakan untuk mencari berat molekul dari sampel.
Dari hasil percobaan elektroforesis yang dilakukan pada sampel enzim pepsin
didapatkan pita-pita dimana dari pita yang terbentuk dihitung panjang atau RF (Retention
Factor) yang akhirnya didapatkan BM sampel. Pada percobaan tersebut digunakan marker
yaitu protein yang mengandung beberapa komponen enzim. Sementara itu sumuran/well
yang terbentuk ada 10 dimana pada sumuran pertama diisi dengan protein marker. Sampel
enzim pepsin yang diinjeksikan ada 5 dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Pepsin
dengan konsentrasi 0,005 µL dimasukkan ke sumuran no.2, pepsin dengan konsentrasi
0,0075 µL dimasukkan ke sumuran no.8, pepsin dengan konsentrasi 0,01 µL dimasukkan
ke sumuran no.9, pepsin dengan konsentrasi 0,0125 µL dimasukkan ke sumuran no.10,
dan pepsin dengan konsentrasi 0,015 µL dimasukkan ke sumuran no.3. pada sumuran
4,5,6, dan & 7 tidak digunakan karena ada gelembung-gelembung.
Setelah dilakukan running, pita yang terbentuk selama percobaan yaitu ada 5. Pada
marker I dengan BM 225 KDa, panjang pita yaitu 2,3 cm, log BM 2,352, dan RF 0,479.
Pada marker II dengan BM 150 KDa, panjang pita yaitu 2,6 cm, log BM 2,176, dan RF
0,542. Pada marker III dengan BM 100 KDa, panjang pita yaitu 2,9 cm, log BM 2, dan RF
0,604. Pada marker IV dengan BM 75 KDa, panjang pita yaitu 3,5 cm, log BM 1,875, dan
RF 0,729. Pada marker V dengan BM 50 KDa, panjang pita yaitu 4,1 cm, log BM 1,698,
dan RF 0,854. Pada marker VI dan VII tidak terbentuk pita sehingga tidak dapat diketahui
nilai RF. Dari hasil percobaan didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi sampel maka
pita yang terbentuk akan semakin tebal. RF yang didapatkan merupakan retention factor
yaitu faktor retensi atau hambatan yang berarti pemisahan protein pada gel. Prinsipnya
yaitu penghambatan terhadap laju migrasi dari protein‐protein tersebut sehingga
pemisahan karena perbedaan berat molekul mengakibatkan terbentuknya pita‐pita pada
jarak migrasi yang berbeda satu sama lain dan jarak tersebut di konversi menjadi nilai RF.
Dari marker I-V menunjukkan bahwa semakin besar nilai RF maka akan berbanding
terbalik dengan berat molekul yang semakin kecil.
Dari hasil percobaan didapatkan panjang pita sampel 3,2 cm dengan panjang
separating gel 4,8 cm. Sehingga dari data tersebut didapatkan nilai Rf sampel l sebesar
0,667. Dari RF dan log BM selanjutnya dibuat kurva sehingga didapatkan persamaan y =
-1,6552x + 3,0822 dimana x = RF sampel dan y = log BM. Dari persamaan tersebut
didapatkan y atau log BM yang kemudian dicari BM sampel dengan antilog y sehingga
didapatkan BM sampel sebesar 95,060 KDa.
Apabila diperhatikan posisi pita dari sampel dan pita-pita dari marker pada gel, akan
terlihat bahwa pita sampel membentuk garis lurus dengan marker. Hal ini menunjukkan
bahwa sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama karena sampel yang digunakan
sama, yaitu enzim pepsin. Molekul dengan berat yang sama akan bergerak menempuh
jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus (Suranto, 2006).
Pita-pita bisa terbentuk atau nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel
sampel yang tersangkut pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada
sampel yang bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki berat molekul sama akan
terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk beberapa pita dengan panjang
berbeda yang terpisah berdasarkan berat molekulnya (Hames, 2004).
Dari hasil percobaan, sampel membentuk garis lurus. Hal tersebut mengindikasikan
bahwa sampel-sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama karena sampel yang
digunakan sama, yaitu enzim pepsin. Molekul dengan berat yang sama akan bergerak
menempuh jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus (Bollag, 2009).
Sebenarnya Elektroforesis protein dan enzim itu hampir sama prinsipnya. Namun
yang membedakan antara elektroforesis enzim dan protein yaitu pada Elektroforesis
protein mengandung beberapa jenis asam amino yang memiliki berat molekul yang
berbeda-beda yang akan terpisah ketika proses running pada gel poliakrilamid. Sedangkan
pada elektroforesis enzim hanya memiliki satu komponen spesifik yang tidak bisa dipisah
lagi (Alberts, 2009).
Berat molekul yang didapatkan dari percobaan dengan literatur berbeda jauh dimana
pada hasil percobaan dengan BM 95,060 KDa. Sedangkan menurut Fatchiyah (2011),
berat molekul enzim pepsin yaitu 34,5 KDa. BM tersebut sangat berbeda yang disebabkan
oleh beberapa faktor. Selain itu sampel metode elektroforesis yang digunakan adalah
enzim sedangkan metode elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis protein.
 Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan Elektroforesis kali ini yaitu ukuran
dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage.
VII. Kesimpulan
1. Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan didapatkan hasil dengan panjang
pita sampel 3,2 cm dan panjang separating gel 4,8 cm dimana RF yang didapatkan
yaitu 0,667. BM dari enzim pepsin yaitu 95,060 KDa.
2. Penambahan akrilamid berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada proses
pemisahan gel sedangkan UGB sebagai buffer.
3. Amonium Persulfat (APS) digunakan sebagai inisiator yang dapat mengaktifkan
akrilamid agar bereaksi dengan gel poliakrilamid lain membentuk rantai polimer yang
panjang.
4. Pewarnaan (staining) pita protein dilakukan dengan jalan merendam gel hasil
elektroforesis (setelah dilepas dari rangkaian plat) dalam larutan Coomasie brilliant
blue (CBB).
5. Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan Elektroforesis kali ini yaitu ukuran
dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage dimana faktor-faktor
tersebut akan berpengaruh terhadap pergerakan protein selama elektroforesis.
6. Prinsip dari elektroforesis yaitu memisahkan protein berdasarkan berat molekul
dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid. Protein terseparasi dalam medan
listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan warna dan pembilasan gel.
Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat pita yang terbentuk oleh
marker
 DAFTAR PUSTAKA

Alberts B, Johnson A., Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2009. Molecular Biology of
The Cell, 4th Edition. Garland Scince. USA

Azira, T., Amin. I., and Che Man, Y. B., 2012. Differentiation of bovine and porcine gelatins
in processed products via Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis (SDS-PAGE) and principal component analysis (PCA) techniques.
International Food Research Journal 19 (3): 1175-1180.

Bollag, D.M. and Edelstein, S.J. 2009. Protein Methods. A John Wiley and Sons Inc. New
York

Fatchiyah, A., dkk. 2011. Biologi Molekuler: Prinsip Dasar Analisis. Penerbit Erlangga.
Jakarta

Hames, B.D & Rickwood. 2004. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Robert E
Krieger Publishing Company. Huntington

Hemes, B.D.1998. Gel Electrophoresis of proteins. Oxford university press. New York

Hermanto. S., sumarlin. L. O., Fatimah.W., 2013. Differentiation of Bovine and Porcine
Gelatin Based on Spectroscopic and Electrophoretic Analysis. Journal food
pharmaceutical sciences. 68-73.

Kageyama, T. and K. Takahashi. 1987. Activation mechanism of monkey and porcine

pepsinogens A. One-step and stepwise activation pathways and their relation to
intramolecular and intermolecular reactions. Eur J Biochem 165: 483-90.

Lehninger, A.L.. 1982 .Dasar-dasar biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga

Suranto. 2006. Electrophoresis Studies of Ranunculus Triplodantus Population.
Biodiversitas. 1(1) 1-7

Wang, I.C.. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. New York: John Wiley and Sons

Westermeier, 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice. John Wiley
& Sons inc. New-Jersey

Wilson K, Walker J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry Fifth Edition.
Cambridge University Press. United Kingdom

Wu, Y., S. Kaveti, et al. (2006). Extensive deuterium back-exchange in certain immobilized
pepsin columns used for H/D exchange mass spectrometry. Anal Chem 78: 1719-23.
 LAMPIRAN

I. Perhitungan
Panjang separating gel = 4,8 cm
Panjang pita sampel = 3,2 cm
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 3,2
RF(sampel)= 𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑠𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙 = = 0,667
4,8
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝐼 2,3
RF(1)= 𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑠𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙 = = 0,479
4,8
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝐼𝐼 2,6
RF(II)= 𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑠𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙 = = 0,542
4,8
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝐼𝐼𝐼 2,9
RF(III)= 𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑠𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙 = = 0,604
4,8
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝐼𝑉 3,5
RF(1V)= 𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑠𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙 = = 0,729
4,8
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝑉 4,1
RF(V)= = = 0,854
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑠𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑙 4,8

 Kurva log BM

Kurva log BM
2,5

2 y = -1,6552x + 3,0822
R² = 0,9551
Log BM

1,5

1 Log BM
Linear (Log BM)
0,5

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
RF

RF(sampel) = x
y = -1,6552x + 3,0822
y = -1,6552(0,677) + 3,00822 y = -1,104 + 3,0822
y = 1,978
y = log BM
BM = anti log y
BM = anti log 1,97788
BM = 95,060 KDa
II. Jawaban Pertanyaan
1. Jelaskan reaksi pembentukan polimer poliakrilamid dan sebutkan fungsi bis-
akrilamid, TEMED, amonium persulfat dan merkaptoetanol.
Jawab:
Gel poliakrilamida adalah gel yang secara kimia terbentuk dari polimerisasi akrilamid
yang berikatan secara cross-link dengan N,N'-methylenebisacryl-amide. Reaksinya
adalah polimerisasi radikal bebas dengan bantuan ammonium persulfat (APS) sebagai
inisiator dan N,N,N',N'-tetramethylenediamine (TEMED) sebagai katalis. Reaksi
yang terjadi adalah sebagai berikut.

Karena gel poliakrilamid dapat memisahkan DNA dengan resolusi tinggi dan hasilnya
sangat murni, maka sangat baik digunakan untuk analisa molekuler lanjut. Para
peneliti mencoba menemukan suatu formula atau komposisi gel akrilamid untuk
memperoleh kualitas yang baik dan uji efisiensi lainnya, antara lain penambahan
polietilen glikol, gliserol, variasi konsentrasi akrilamid, dan suhu elektroforesis
a. Bis-akrilamida, berfungsi sebagai cross‐linking agent yang membentuk kisi‐kisi
bersama polimer akrilamida. Kisi‐kisi tersebut berfungsi sebagai saringan
molekul protein. Perbandingan antara akrilamida dengan bis akrilamida dapat
diatur sesuai dengan berat molekul protein yang dipisahkan . Semakin rendah
berat molekul protein yang dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi
akrilamida yang digunakan agar kisi‐kisi yang terbentuk semakin rapat Amonium
Persulfat (APS) digunakan sebagai inisiator yang dapat mengaktifkan akrilamid
agar bereaksi dengan gel poliakrilamid lain membentuk rantai polimer yang
panjang.
b. TEMED (N,N,N’,N’ tetrametilendiamin), berfungsi sebagai katalisator reaksi
polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan
dalam pemisahan protein.
 c. Amonium persulfat (APS), berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan
akrilamida agar bereaksi dengan molekul akrilamida yang lainnya membentuk
rantai polimer yang panjang.
d. Merkaptoetanol berfungsi untuk memutus ikatan disulfida yang ditemukan antara
kompleks protein, yang membantu mengubah sifat protein lebih lanjut.

2. Jelaskan prinsip elektroforesis

Jawab:
Prinsip dari elektroforesis yaitu memisahkan protein berdasarkan berat molekul
dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid. Protein terseparasi dalam medan
listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan warna dan pembilasan gel.
Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat pita yang terbentuk oleh
marker

3. Jelaskan bagaimana cara memvisualisasikan protein hasil pemisahan dengan SDS-

PAGE
Jawab:
Caranya adalah dengan pewarnaan gel. Pewarnaan gel merupakan bagian dari metode
SDS-PAGE. Fungsi pewarnaan gel pada elektroforesis yaitu untuk membantu
memonitor jalannya elektroforesis. Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein
terdiri dari commasie blue staining dan silver salt staining. Pada pengecatan dengan
menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita-pita protein yang terbentuk
pada gel pemisah. Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh
oleh pewarna biru bromofenol. Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk
mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis.