FIKSASI N SIMBIOTIK DAN NON SIMBIOTIK

DALAM MENGATASI CEKAMAN HARA N

BIOLOGI TANAH TNH 526 1

FIKSASI N SIMBIOTIK DAN NON SIMBIOTIK DALAM
MENGATASI CEKAMAN HARA N

BIOLOGI TANAH TNH 526 2

 Sumber N dalam tanah
Nitrogen dalam tanah berasal dari:
1. Nitrogen yang turun bersama curah hujan (reaksi
Haber-Bosch ketika terjadi petir)
2. Bahan organik (dekomposisi jaringan hewan dan
tumbuhan yang jatuh ke tanah)
3. Fiksasi N bebas dari udara secara simbiotik atau
non simbiotik
4. Pemupukan
Nitrogen tidak diperoleh dari pelapukan mineral tanah

BIOLOGI TANAH TNH 526 3

SUMBER N DALAM TANAH

BIOLOGI TANAH TNH 526 4

 N Fixation

Energetics
• NN
• Haber-Bosch (100-200 atm, 400-500°C, 8,000
kcal kg-1 N)
• Nitrogenase (4,000 kcal kg-1 N)

BIOLOGI TANAH
5 TNH 526
In the industrial Haber process, N2 is reduced to NH3 by H2 at
high temperature and pressure with an iron oxide catalyst

N2 3H2

The reaction is exothermic

by + 92.4 kJ/mol at standard
200 oC temperature & pressure, but
200 Atm has a very high activation
energy
FeO catalyst

2 NH3

BIOLOGI TANAH TNH 526 6

BIOLOGI TANAH TNH 526 7
To break the triple bond, energy input in necessary

BIOLOGI TANAH TNH 526 8

 Nitrogen fixation
N2 fixed (106 metric tons
Type of fixation
per year)
Non-biological
Industrial ~ 50
Combustion ~ 20
Lightning ~ 10
Total ~ 80

Biological
Agricultural land ~ 90
Forest and non-agricultural land ~ 50
Sea ~ 35
Total ~ 175
BIOLOGI TANAH TNH 526 9
BIOLOGI TANAH TNH 526 10
 Importance of Nitrogen in
Biochemistry
• Nitrogen, carbon, hydrogen and oxygen are the main
elemental constituents of living organisms
• Peptide backbone in proteins
• Functional side chains (His, Lys, Arg, Trp, Asn, Gln) in
proteins
• Nucleobases in DNA and RNA
• Found in several cofactors (NAD, FAD, Biotin … )
• Found in many small hormones (epinephrine)
• Found in many neurotransmitters (serotonin, GABA…)
• Found in many pigments (chlorophyll, heme…)

BIOLOGI TANAH TNH 526 11

 TRANSFORMASI N
DALAM TANAH
• N dalam tanah diserap tanaman dalam bentuk kation
NH4+ (ammonium) dan anion NO3- (Nitrat)
• N yang ada dalam bahan organik (protein) dihidrolisis
menjadi asam amino dan kemudian nantinya akan
melepaskan NH4+ (ammonifikasi)
• NH4+ yang terbentuk bisa diserap tanaman atau
dioksidasi menjadi NO2-(Nitritasi) kemudian NO3-
(Nitratasi) jika aerasi baik (aerobik) dan tereduksi
menjadi gas NO, N2O atau N2 melalui proses
denitrifikasi

BIOLOGI TANAH TNH 526 12

• Jika tanaman menyerap N dalam bentuk NO3-
maka dalam sel untuk bisa digunakan dalam
sintesis asam amino harus kembali direduksi
menjadi bentuk NH4+ dengan enzim nitrat
reduktase, jika tanaman tidak memiliki sistem
enzim ini maka terjadi gangguan
pertumbuhan jika bentuk N yang tersedia
dalam bentuk NO3-

BIOLOGI TANAH TNH 526 13

 SINTESIS ASAM AMINO
Jika tanaman menyerap N dalam bentuk NH4+ maka dalam sel
langsung dimetabolisir ke dalam bentuk asam amino. NH4+ tidak bisa
disimpan dalam vakulola karena meracun dalam sel

Glutamate deshydrogénase Glutamine synthetase

BIOLOGI TANAH TNH 526 14

 Assimilasi Ammonium
Dua lintasan utama asimilasi ammonium
• Lintasan Utama : GDH/GS dalam organisme yang
kaya N . Kedua langkah disebut assimilasi N
• Lintasan Kedua: GS/GOGAT dalam organisme yang
menghadapi kekurangan N
• GOGAT merupakan glutamate synthase atau
glutamate: oxo-glutarate amino transferase

BIOLOGI TANAH TNH 526 15

 Biosintesis glutamate
1. Glutamate synthase
• Main pathway in bacteria & plants; not present in animals

NADPH + H+ NADP +

-ketoglutarate + glutamine 2 glutamate

2. L-glutamate dehydrogenase (in all organisms)

NADPH NADP +

-ketoglutarate + NH4+ L-glutamate + H2O

3. Transamination of -ketoglutarate
• in animals
• amino groups provided by amino acids during catabolism
BIOLOGI TANAH TNH 526 16
The glutamate dehydrogenase reaction

BIOLOGI TANAH TNH 526 17

The glutamine synthetase reaction

Glutamate Glutamine

Glutamine
BIOLOGI TANAH TNH 526 18
 Tubuh manusia dapat mensisntesis 10 dari 20 asam amino yang
dibutuhkan

ASAM AMINO ESSENSIAL DAN

NON ESSENSIAL BAGI MANUSIA
Asam amino dimana
organisme tidak dapat
mensisntesisnya Essential Non essential
dalam jumlah yang
cukup dibawah kondisi
yang ada disebut
Arginine* Alanine
“essential.” Asam Histidine Asparagine
amino yang bisa Isoleucine Aspartate
disintesis dalam Leucine Cysteine
jumlah yang cukup
Lysine Glutamate
“nonessential.”
Methionine Glutamine
Umumnya bakteria Phenylalanine Glycine
dan tanaman dapat
mensintesis ke 20
Threonine Proline
asam amino Tryptophan Serine
Valine Tyrosine

*Arginine merupakan essential bagi

anak-anak tetapi tidak untuk dewasa
BIOLOGI TANAH TNH 526 19
EKOLOGI MIKROORGANISME
PEMFIKSASI N

BIOLOGI TANAH TNH 526 20

BIOLOGI TANAH TNH 526 21
 MIKROORGANISME PEMFIKSASI Nitrogen
Berdasarkan kebutuhan karbon dalam fiksasi nitrogen:
Heterotrophic dan Autotrophic

BAKTERI PEMFIKSASI N

Fiksasi bebas Simbiotik

Tanaman
Aerobik Anaerobik Legumes lain
Clostridium (some)
Azotobacter Desulfovibrio
Beijerinckia Purple sulphur Rhizobium,
Frankia
Klebsiella (some) bacteria* Bradyrhizob-
Azospirill
Cyanobacteria* (e.g. Purple non-sulphur ium and
-um
Nostoc and bacteria* Azorhizobium
Anabaena Green sulphur
bacteria*
BIOLOGI TANAH TNH 526 22
 Bakteri fiksasi N
Organotrophs
• Azotobacter -> neutral to alkaline soils
• Azospirillum -> lives between root cells, microaerophlic
• Beijerinckia -> broad pH dominate in acid soils
• Bacillus -> facultative anaerobe
• Klebsiella -> facultative anaerobes on leaves and bark
• Clostridium -> obligate anaerobe
• Rhizobium -> aerobe to microaerobphilic

Phototrophs
• Cyanobacteria
• Anabaena -> aerobe, heterocystous filamentous
• Nostoc -> aerobe, heterocystous filamentous
• Plectonema -> filaments, no heterocysts

23 TNH 526
BIOLOGI TANAH
 Organisme Pemfiksasi N
• Organisme yang dapat memfiksasi N terdiri atas :

– Bakteri pemfiksasi N bebas

• Aerobic (Azotobacter, Klebsiella)
• Anaerobic (Desulfovibrio, Clostridium)

– Cyanobacteria
• (Nostoc biasa lichen)

– Symbionts = hidup symbiosis dengan tanaman tertentu

• legumes (Rhizobium)
• Tanaman lain (Frankia)

BIOLOGI TANAH TNH 526 24

 Types of Biological Nitrogen Fixation
Azospirillum
Cyanobacteria

Lichen

25 TNH 526
BIOLOGI TANAH
 Azolla

26 TNH 526
BIOLOGI TANAH
 MEKANISME FIKSASI N
1. Fiksasi N non simbiotik
2. Fiksasi N simbiotik

Perbedaan antara keduanya terletak pada:

a. Sumber karbon yang digunakan. Pada fiksasi N secara
simbiotik kebutuhan karbon (karbohidrat) di supplai
oleh tanaman inang sedangkan non simbiotik
menggunakan sumber karbon dari lingkungan.
b. Tidak membentuk nodul pada bakteri fiksasi N non
simbiotik sebaliknya ditemukan bintil akar sebagai
organ bersama.

BIOLOGI TANAH TNH 526 27

 FIKSASI NITROGEN
• Fikasi N2 merupakan reaksi eksergonik
N2 + 3H2 2NH3 DG’°= - 33.5 kJ/mol

• Fiksasi N2 sangat mahal

Nitrogenase complex
N2 + 10H+ + 8e- + 16ATP 2NH4 + + 16ADP + 16Pi + H2

BIOLOGI TANAH TNH 526 28

 • Reaksi
N2 + 3 H2 = 2 NH3
• Bersifat
– exothermic (DH0 = -92.4 kJ/mol)
– exergonic (DG0 = -33.5 kJ/mol)
– Berlangsung sangat lambat dikarenakan sifat
nitrogen yang tidak mudah bergerak (inertness)

BIOLOGI TANAH TNH 526 29

 Reaksi Redox pada Dinitrogenase
• Rekasi Nitrogenase dalam fiksasi N dapat ditulis secara lengkap
N2 + 8 H+ + 8 e- + 16 ATP = 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

• Dinitrogenase reductase mengkatalis

– transfer 8-electron kepada dinitrogenase
– hidrolisis ATP dengan melepas proton
• Dinitrogenase mengkatalis
– transfer 6 electron ke nitrogen: membentuk NH3
– transfer 2 electron ke proton: membentuk H2

BIOLOGI TANAH TNH 526 30

 Nitrogenase

Protein dengan Mo-Fe-S (Mo-

Fe protein) dengan berat
molukul ± 220 kd
Protein ini memiliki 2 sub unit

Memiliki 2 atom Mo, 32 Fe, dan 25 sp 30 asam sulfat labil.

Komponen lainnya adalah Fe protein dengan berat molekul ± 66

kd.
BIOLOGI TANAH TNH 526 31
 Nitrogenase
Fd(ox) FeMo Cofactor

Fd(red) N2 + 8H+
8e-

nMgATP 2NH3 + H2

nMgADP + nPi 4C2H2 + 8H+ 4C2H2

Dinitrogenase
Dinitrogenase
reductase
N2 + 8H+ + 8e- + 16 MgATP  2NH3 + H2 + 16MgADP
BIOLOGI TANAH TNH 526 32
 Mekanisme fiksasi
Nitrogen

Fe protein pertama sekali direduksi oleh elektron yang dihasilkan

ferredoxin.

Fe protein tereduksi kemudian mengikat ATP dan mereduksi

protein molybdenum-iron, yang memberikan elektron ke N2,
menghasilkan HN=NH.

Dalam dua siklus selanjutnya dari proses ini (setiap siklus

membutuhkan elektron yang didapatkan dari ferredoxin), HN=NH
direduksi lagi menjadi H2N-NH2, dan selanjutnya direduksi lagi
menjadi 2NH3. BIOLOGI TANAH TNH 526 33
BIOLOGI TANAH TNH 526 34
BIOLOGI TANAH TNH 526 35
REVIEW
FIX N
• Enzyme Nitrogenase sangat
sensitif terhadap oxygen.

BIOLOGI TANAH TNH 526 37

SYARAT DIKATAKAN SIMBIOSIS adalah:
• Adanya aliran makanan antara mikrosimbion
dengan makrosimbion
• Terjadi kontak secara fisik
• Terbentuknya jaringan bersama seperti :
Nodul (bintil akar) pada legum dan arbuskul
atau bundle sheath (selubung akar) dan Hartig
Net (Jaringan hartig) pada mikoriza
BIOLOGI TANAH TNH 526 38
KHARAKTERISTIK DARI NITROGENASE

• Terdiri atas dua jenis: Dinitrogen reduktase and

Dinitrogenase
• Enzyme terdenaturasi oleh oksigen
• Dinitrogen reductase - memilki transitional metal
iron...Dinitrogenase memiliki the transition metal atoms --
iron and molybdenum...
• Membutuhkan ion Mg untuk mengaktifkan ATP...
• membutuhkan 16 ATP mereduksi N2 to 2NH4 +
• Hydrogen merupakan inhibitor kompetitif bagi
Dinitrogenase...
• NH4 + menekan sintesis enzyme...
• Mereduksi bentuk ikatan triple lainnya selain N2 seperti
acetylene (CH≡CH), cyanide (H-C≡N),

BIOLOGI TANAH TNH 526 39

MEKANISME FIKSASI-N SECARA SIMBIOTIK

BIOLOGI TANAH TNH 526 40

PEMBENTUKAN BINTIL AKAR PADA LEGUM

BIOLOGI TANAH TNH 526 41

 Rhizobium Infection and Alfalfa root nodule

nodule
formation

Dazzo & Wopereis, 2000

Root hair curling around rhizobia

Rhizobia reproduce
in infection threads
M. Barnett

Bacteroids filling a single cell

Dazzo & Wopereis, 2000

Michael Russelle - USDA-ARS

Plant Science Research Unit
Gage and Margolin, 2000 TNH 526
BIOLOGI TANAH Vance et al.,42
1980
 Development of a soybean root nodule

Rhizobium
(1) Roots emit chemical bacteria Dividing cells (2) The bacteria penetrate the
signals that attract in root cortex cortex within the Infection thread.
Infection Cells of the cortex and pericycle
Rhizobium bacteria. The thread
bacteria then emit signals begin dividing, and vesicles
that stimulate root hairs to Bacteroid Dividing cells in containing the bacteria bud into
elongate and to form an pericycle cortical cells from the branching
infection thread by an
1 2.
infection thread. This process
Infected
invagination of the plasma root hair 2 results in the formation of
bacteroids
membrane.

Developing
root nodule

3 Bacteroid

(4) The nodule develops 4

vascular
4 tissue that supplies (3) Growth
3 continues in the
nutrients to the nodule and affected regions of the cortex
carries nitrogenous and pericycle, and these two
compounds into the vascular masses of dividing cells fuse ,
cylinder for distribution forming the nodule.
throughout the plant. Nodule
vascular
Bacteroid tissue

Figure 37.11 BIOLOGI TANAH TNH 526 43

The Molecular Biology of Root Nodule Formation
• The development of a nitrogen-fixing root nodule depends on
chemical dialogue between Rhizobium bacteria and root cells of
their specific plant hosts
Activation of Expression of
Nod box by Nod gene
activated Nod D
Synthesis of
Nod factor
Activation of
factor Nod D
by flavonoid Chemical Signal
between root and
Rhizobium

Flavonoid released
by root as signal Nod factor trigger development by the
root of the infection thread and nodule
 “ Infection” of legumes
1) Developing roots of a legume release
flavonoid compounds into the
surrounding soil.

2) Soilpopulations of free-living Rhizobia

(and related genera) respond to specific
flavonoids and begin producing and
releasing Nod factors.

3) Plant cells respond to Nod factors and undergo

developmental change.
- binding of bacteria to walls of plant root hairs
- Hair deforms and wraps around bacteria
- formation of an infection tube into which the bacteria enter.
BIOLOGI TANAH TNH 526 45
 PROSES FIKSASI N SECARA SIMBIOTIK
(cellule végétale)

Transporteurs H+ / e-
PHB (cytochrome, quinone, …)
O2 e- / H +

Leghémoglobine ADP + Pi ATP

(piège à O2) METABOLISME
bactérien FAD
Métabolites N2
nitrogénase
carbonés CO2
FADH2 NH4+
(Bactérie)

METABOLISME
végétal Glutamate NH4+

PHOTOSYNTHESE

BIOLOGI TANAH TNH 526 46

BIOLOGI TANAH TNH 526 47
TAHAPAN PEMBENTUKAN NODUL AKAR

BIOLOGI TANAH TNH 526 48

TAHAPAN PEMBENTUKAN NODUL AKAR

BIOLOGI TANAH TNH 526 49

BINTIL AKAR DARI Alfalfa

BIOLOGI TANAH
50 TNH 526
BINTIL AKAR KEDELAI

http://www.york.ac.uk/res/dcms/josenodules.GIF

BIOLOGI TANAH
51 TNH 526
Types of Biological Nitrogen Fixation

52 TNH 526
BIOLOGI TANAH Frankia
• Berdasarkan hasil percobaan menggunakan enzyme yang dipurifikasi
ditemukan bahwa dalam setiap reaksi selalu ditemukan H2 dalam setiap
reduksi N2 Produksi H2 bervariasi terhadap perbandingan konsentrasi
dari dua komponen nitrogenase. Kekurangan Mg-ATP memperlambat
transfer elektron antara dua komponen. Akibatnya meningkatkan
kebutuhan ion H+ dan otamatis meningkatkan jumlah H2 yang terbentuk
untuk setiap reduksi N2 (Burris et al, 1980). Schubert and Evans (1976)
mendefinikan perbandingan antara kecepatan sintesis H2 dengan
kecepatan reduksi acetylen sebagai aktivitas relative (Relative Activitity).

• Pada keadaan tanpa Hydrogenase nilai E maksimal adalah 0.75 yang

berarti 75% dari elektron digunakan untuk reduksi N2

• Nilai RE bervariasi terhadap: varietas tanaman, konsentrasi Nitrat dalam

larutan nutritif (Kimou et al. 1985) dan kandungan oksigen pada daerah
akar tanaman (Drevon et al,. 1982) dan juga tergantung kepada
mikrosimbion (bakteri pemfiksasi N) (Kimou and Drevon, 1988; Tillard
and Drevon, 1988; Evans et al,. 1987)

BIOLOGI TANAH TNH 526 53

PERSPEKTIF PENELITIAN

DALAM PENELITIAN KESEIMBANGAN KEBUTUHAN

KARBOHIDRAT DAN NITROGEN PADA TANAMAN LEGUM
DITENTUKAN OLEH JUMLAH DAN BERAT BINTIL AKAR OSI
FOKUS PENELITIAN DIARAHKAN KEPADA :
• ARA MAKSIMAL TERHADAP KANDUNGAN OKSIGEN TINGGI
DALAM TANAH
• MENGURANGI ENERGETIC COST DALAM FIKSASI N DENGAN
MENGURANGI TERBENTUKNYA H2 OLEH NITROGENASE
(Nif)
• MEMPELAJARI TRANSPORT MALAT, SUKSINAT DAN
FUMARAT KE BAKTEROID SEBAGAI SUMBER ENERGI UTAMA

BIOLOGI TANAH TNH 526 54

BIOLOGI TANAH TNH 526 55
 Genetik Nitrogenase
Gene Properties and function
nifH Dinitrogenase reductase
nifDK Dinitrogenase
nifA Regulatory, activator of most nif and fix genes
nifB FeMo cofactor biosynthesis
nifEN FeMo cofactor biosynthesis
nifS Unknown
fixABCX Electron transfer
fixK Regulatory
fixLJ Regulatory, two-component sensor/effector
fixNOQ Electron transfer
P Transmembrane complex
BIOLOGI TANAH TNH 526 56
fixGHIS
nod Gene Expression

Common
nod genes

Nod factor–LCO
(lipo-chitin oligosaccharide)
BIOLOGI TANAH TNH 526 57
 Metoda DNA Rekombinan
• Amplifikasi gen
– Plasmid dan
bacteriophage vectors
mengandung gen asing
dan jumlahnya
ditingkatkan sebelum
diekspresikan
• Kloning DNA
rekombinan
– Menggunakan bakteri
atau sel yang lainnya

BIOLOGI TANAH TNH 526 58

Biotechnology
• Genetic engineering dalam Fikasi N
– Fiksasi Nitrogen
• Menyisipkan gen pemfiksasi N ke dalam tanaman untuk mengurangi
penggunaan pupuk N

Bintil akar yang

mengandung bakteri
pemfiksasi N

BIOLOGI TANAH TNH 526 59

BIOLOGI TANAH TNH 526 60
BIOLOGI TANAH TNH 526 61
BIOLOGI TANAH TNH 526 62
BIOLOGI TANAH TNH 526 63
BIOLOGI TANAH TNH 526 64