METODA DAN TEKNIK PENGAMATAN DALAM

PENELITIAN
BIOLOGI TANAH

BIOLOGI TANAH S2 12
• PREDIKSI PERANAN DAN AKTIVITAS MIKROBIA
TANAH SERING MENGGUNAKAN PARAMETER KIMIA
TANAH DAN PENAMPAKKAN PERTUMBUHAN
TANAMAN SEHINGGA TIDAK BISA SECARA
MENDALAM MENJELASKAN FENOMENA YANG
SESUNGGUHNYA TERJADI DI DALAM TANAH
• HAL INI SERING MENIMBULKAN KERAGUAN DAN
KETIDAKYAKINAN

BIOLOGI TANAH S2 13
• PENGGUNAAN PARAMETER BIOLOGIS
PENJELASAN MELALUI PENDEKATAN BIOLOGIS
MERUPAKAN CARA TERBAIK DALAM
MENJELASKAN FENOMENA YANG TERJADI
DALAM TANAH

BIOLOGI TANAH S2 14
 BAGAIMANA PENDEKATANNYA???
JIKA TANAH MERUPAKAN SUATU MEDIA YANG
KOMPLEKS ??

BIOLOGI TANAH S2 15
BIOLOGI TANAH berkaitan erat dengan
• Mikrobiologi
• Biokimia
• Biomolekuler
• Genetika
• Kimia
• Fisika
• Ilmu Tanah
Oleh sebab itu metoda pengamatan populasi
dan aktivitas m.o tanah dapat dilakukan
melalui pendekatan keilmuan di atas
BIOLOGI TANAH S2 16
• PENELITIAN DAPAT DILAKUKAN
MENGGUNAKAN :
• Metoda Survei
• Penelitian empiris
• Sampel tanah :
• Rhizosfir
• Non Rhizosfir

BIOLOGI TANAH S2 17
RHIZOSFIR

BIOLOGI TANAH S2 18
 Pengamatan Fauna Tanah

Gambar Monolith berukuran 25x25x30 cm dasar bagi pengamatan fauna

dengan hand sorting

BIOLOGI TANAH S2 19
 Sampel dari lapangan, Profil, Lanskap,
lingkungan perakaran tanaman

Komposit, Ulangan, transportasi,

pengadukan, subsampling, fraksionasi

Mikroskopis Analisis Kimia Asam Nukleat Analisis Studi proses

struktur molekul fisiologis

Biotransformasi,
Mikroskop transmisi, Fungsional atau
CFI-CFE, Lipid, Plate counts, penjejakan CH4, CO2, NO3-
elektron phylogenetic
phospholipid, MPN, Biolog, , SO42-, N2, Fraksi Bahan
atau scanner, probes, gen
ergosterol, ATP, DNA, Enzime, absorbsi organik tanah
fluorescence, probes %G+C reporter, PCR, Thymidine dan
immunologik ribosomal RNA
leucine

Pertumbuhan dan
Jumlah, Transfer gen,
Morfologi, jumlah, Nomenklatur Biokimia, pengembalian
identitas, stabilitas
biovolume, identitas, kemampuan fisiologis, hara, ketersediaan,
struktur populasi,
fungsi, dan karakteristik kualitas
komunitas struktur
pengaturannya komunitas, pertumbuhan biogeokimia
lingkungan
phylogenetik

Aktivitas Biotik, Biomassa dan Biodiversiti dalam

tanah, endapan, air ataupun sampel geologis

BIOLOGI TANAH S2 20
 Prosedur pengambilan
contoh tanah
• Dapat dilakukan secara komposit, sitematis (proporsional) dan
random ( non proporsional) tergantung pada tujuan dan
sasaran yang akan dicapai
• Kedalaman pengambilan contoh tanah pada kedalam olah (20
cm) bisa 10 cm jika perakaran padat
• Contoh tanah satelit dari profil tanah
• Contoh tanah rhizosfir atau rhizoplane atau non rhizosfir
• Data keadaan fisik lingkungan perlu dicatat (lereng, vegetasi,
altitude, dan latitude, keadaan permukaan tanah)
• Contoh tanah diberi label dan disimpan dalam termos pada
temperatur 2-40C atau -200C untuk waktu lama

BIOLOGI TANAH S2 21
1. METODA PENGHITUNGAN POPULASI DAN
AKTIVITAS MIKROORGANISME TANAH

a. Menggunakan media kultur

b. Non Media kultur

BIOLOGI TANAH S2 22
Pseudomonas
corrugata Pythium
sporangium
BIOLOGI TANAH S2 23
 Table 1. Some Methods used to measure bacterial growth
Method
Direct microscopic count
Viable cell count (colony
counts)
Turbidity measurement
Measurement of total N or
protein
Measurement of Biochemical
activity e.g. O2 uptake CO2
production, ATP production,
etc.
Measurement of dry weight
or wet weight of cells or
volume of cells after
centrifugation
Application
Enumeration of bacteria in
milk or cellular vaccines
Enumeration of bacteria in
milk, foods, soil, water,
laboratory cultures, etc.
Estimations of large numbers
of bacteria in clear liquid
media and broths
Measurement of total cell
yield from cultures very
dense
Microbiological assays
Measurement of total cell
yield in cultures
BIOLOGI TANAH S2
Comments
Cannot distinguish living
from nonliving cells
Very sensitive if plating
conditions are optimal
Fast and nondestructive, but
cannot detect cell densities
less than 107 cells per ml
only practical application is
in the research laboratory
Requires a fixed standard to
relate chemical activity to
cell mass and/or cell numbers
probably more sensitive than
total N or total protein
measurements
24
 PLATE COUNT (CAWANG TUANG)

• Siapkan satu seri pengenceran ( biasanya 104 – 108)

• Tuangkan larutan dengan pengenceran tertentu pada
petri dish yang terisi media agar yang sesuai
• Hitung jumlah koloni yang tumbuh (30-300) setelah
7-14 hari inkubasi. Setiap koloni yang muncul pada
petri dish mencerminkan jumlah propagul yang ada

BIOLOGI TANAH S2 25
Colony-Forming Unit
When we observe
colonies, we cannot
assume each arose from
just one cell originally
planted on the medium,
however. A pair, chain or
cluster of cells which
'land' on the medium in
close proximity to each
other can multiply and
produce a single colony.
Thus, we use the term
colony-forming unit
when we consider the
common origin for the
cells of any colony." This
term is usually
abbreviated CFU.
BIOLOGI TANAH S2 26
 Table . Generation times for some common bacteria
under optimal conditions of growth.

Generation Time
Bacterium Medium
(minutes)
Escherichia coli Glucose-salts 17
Bacillus megaterium Sucrose-salts 25
Streptococcus lactis Milk 26
Streptococcus lactis Lactose broth 48
Staphylococcus aureus Heart infusion broth 27-30

Lactobacillus acidophilus Milk 66-87

Mannitol-salts-yeast
Rhizobium japonicum 344-461
extract

Mycobacterium
Synthetic 792-932
tuberculosis

Treponema pallidum Rabbit testes 1980

BIOLOGI TANAH S2 27
METODA PENGHITUNGAN
EKSTRAKSI DARI TANAH

PETRI DISH TERISI MEDIA

YANG SESUAI

BIOLOGI TANAH S2 28
 DARI MEDIA KULTUR CAIR

BIOLOGI TANAH S2 29
METODA PENGHITUNGAN

• PLATE COUNT (Cawan Tuang)

Plate count digunakan untuk menghitung populasi bakteria,
jamur dan aktinomisetes

Group Media
Bakteri Media Thornton, Ekstrak Tanah
Jamur Media Martin, Agar masam, Antibiotik
Aktinomisetes Agar chitin, media Jansens

BIOLOGI TANAH S2 30
 KEUNTUNGAN METODA PLATE COUNT (CAWAN
TUANG)

• Isolasi terhadap mikrobia dapat berlanjut kepada

proses identifikasi
• Karakter biokimia dari setiap koloni dapat langsung
diketahui jika menggunakan media yang sesuai
(Contoh : produksi CO2 pada media yang mengandung CaCO3,
kelarutan fospat pada media yang ada Ca2HPO4, atau
kemampuan hydrolisis pati pada media mengandung pati)

BIOLOGI TANAH S2 31
PENAMPAKAN KOLONI YANG TUMBUH PADA MEDIA DALAM
PETRI DISH ( setiap koloni yang tumbuh dianggap berasal dari satu sel
diistilahkan dengan cfu= colony forming unit atau satuan pembentuk koloni)
BIOLOGI TANAH S2 32
BIOLOGI TANAH S2 33
 KEKURANGAN METODA PLATE COUNT (CAWAN
TUANG)
• Satu media tidak memungkinkan tumbuhnya
keseluruhan mikrobia yang ada dalam tanah ( tidak
bisa ditumbuhi oleh semua jenis bakteri)
• Kondisi inkubasi yang aerobik menyebabkan
kelompok anaerobik tidak dapat tumbuh
• Ada kesulitan dalam melepaskan mikrobia dari
partikel tanah menyebabkan tidak semuanya dapat
terhitung
• Produk ekstraselular yang dihasilkan oleh suatu
mikrobia pada petri dish mungkin dapat
menghambat atau memacu pertumbuhan koloni
yang lain
BIOLOGI TANAH S2 34
METODA PENGHITUNGAN

PENGHITUNGAN LANGSUNG DENGAN MIKROSKOP

• Siapkan serangkaian pengenceran

• Teteskan suspensi hasil pengenceran pada objek gelas
• Sebarkan merata pada luasan 1cm2 dan lakukan fiksasi warna
• Lakukan pewarnaan (staining) dengan menggunakan pewarna
bersifat masam (Acid Fuchsin, Rose bengal, Erythrosin) dan
lakukan pengamtan dan penghitungan di bawah mikroskop
Dapat juga menggunakan Haemacytometer

BIOLOGI TANAH S2 35
 2. NON MEDIA KULTUR (SECARA
MIKROSKOPIS)

• PADA PENGHITUNGAN DENGAN MIKROSKOP

KITA DAPAT MENGHITUNG JUMLAH BAKTERI,
SPORA DAN MISELIA, SERTA MISELIA
AKTINOMISETES

BIOLOGI TANAH S2 36
HAEMACYTOMETER

BIOLOGI TANAH S2 40
 HAEMACYTOMETER
• Penampang haemacytometer

BIOLOGI TANAH S2 41
BIOLOGI TANAH S2 42
 Volume dengan
Dimensi Luas area
kedalaman 0.1 mm
1 x 1 mm 1 mm2 100 nl
0.25 x 0.25 mm 0.0625 mm2 6.25 nl
0.25 x 0.20 mm 0.05 mm2 5 nl
0.20 x 0.20 mm 0.04 mm2 4 nl
0.05 x 0.05 mm 0.0025 mm2 0.25 nl

BIOLOGI TANAH S2 43
1 mm2

1 mm

1 mm

1 mm

BIOLOGI TANAH S2 44
 Hemocytometer grid:
Kotak merah = 1 mm2,
100 nl
Kotak hijau =
0.0625 mm2, 6.25 nl
Kotak kuning = 0.04 mm2,
4 nl
Kotak biru =
0.0025 mm2, 0.25 nl
Kedalaman 0.1 mm.

BIOLOGI TANAH S2 45
marked grid, giving each square a defined volume.[1]

Volume at
Dimensions Area
0.1 mm depth
1 x 1 mm 1 mm2 100 nl
0.25 x 0.25 mm 0.0625 mm2 6.25 nl
0.25 x 0.20 mm 0.05 mm2 5 nl
0.20 x 0.20 mm 0.04 mm2 4 nl
0.05 x 0.05 mm 0.0025 mm2 0.25 nl

BIOLOGI TANAH S2 46
METODA PENGHITUNGAN

KEUNTUNGAN METODA MIKROSKOPIS

• Dapat melihat distribusi ruang mikrobia dalam tanah

dan hubungannya dengan partikel tanah
• Dapat melihat koloni dan morfologi mikrobia dalam
tanah dan sebagaimana adanya

BIOLOGI TANAH S2 47
METODA PENGHITUNGAN

KELEMAHAN METODA MIKROSKOPIS

• Tidak dapat membedakan antara sel hidup dengan
sel mati
• Sulit membedakan spora bakteri dengan
aktinomisetes
• Tidak memungkinkan karakterisasi mikrobia lebih
lanjut
• Sulit menghitung bakteri yang hidup berkoloni
• Sulit membedakan mikrobia dengan partikel tanah

BIOLOGI TANAH S2 48
BIOLOGI TANAH S2 49
METODA PENGHITUNGAN

ALTERNATIF LAIN
• Menggunakan pewarna Fluorescent (Acridine
orange) untuk membedakan sel hidup dengan
yang mati
• Pewarna Fluorescent dan antibodi
(Fluorescent antiserum) untuk mikrobia
tetentu dan dapat digunakan pada permukaan
tanah

BIOLOGI TANAH S2 50
METODA PENGHITUNGAN

MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

• Siapkan serangkaian pengenceran
• Inokulasikan suspensi dengan pengenceran 103 – 105
ke dalam tube yang berisi media yang sesuai
• Setelah diinkubasi beberapa hari tube yang
memperlihatkan pertumbuhan dilakukan
penghitungan
• Gunakan tabel MPN dalam penghitungan populasi

BIOLOGI TANAH S2 51
METODA PENGHITUNGAN

KEUNTUNGAN MPN
• Memungkinkan penghitungan mikrobia
spesifik
• Isolasi dapat dilakukan dengan tingkat
pengenceran rendah

BIOLOGI TANAH S2 52
METODA PENGHITUNGAN

KELEMAHAN MPN
• Tidak akurat
• Membutuhkan tenaga, tempat dan peralatan
yang cukup banyak

BIOLOGI TANAH S2 53
 Sources

Sources: Insam, H. 2001. Developments in soil microbiology since the

mid 1960s. Geoderma 100 : 389–402
BIOLOGI TANAH S2 54
 3. Penghitungan biomassa
• Fumigasi dengan Chloroform (CHCl3)
• Sampel tanah ditimbang seberat 5 g, kemudian ditambahkan 25 ml
chlroform, diinkubasikan selama 24 jam diruang asam (fume hood) sampai
seluruh chloroform menguap
• Choloroform berfungsi dalam melysis dinding sel sehingga sel menjadi
hancur
• Hasil lysis dinding sel diekstrak dengan menggunakan larutan K2SO4,
kemudian biomassa mikroorganisme dapat dihitung berdasarkan
kandungan N atau C atau P dengan perlakuan tanpa inkubasi chloroform
sebagai kontrol
• Selisih kandungan N, C atau P antara sampel yang diinkubasi khloroform
dengan tanpa kholoroform yang dikalikan dengan nilai konstanta
merupakan berat biomassa mikroorganisme tanah

BIOLOGI TANAH S2 55
Sources: Insam, H. 2001. Developments in soil microbiology since the mid
1960s. Geoderma 100 : 389–402

BIOLOGI TANAH S2 56
Sources: Insam, H. 2001. Developments in soil microbiology since the mid 1960s.
Geoderma 100 : 389–402

BIOLOGI TANAH S2 57
 4. PENGUKURAN AKTIVITAS
MIKROORGANISME
1. Pengukuran Respirasi
• Pemakaian O2
• Jumlah CO2 yang dikeluarkan
2. Penghitungan Biomassa mikrobia
• Fumigasi dengan Chloroform (CHCl3)
• Penghitungan ATP (reaksi Luciferase)
3. Pengukuran aktivitas enzimatik
• Pengukuran terhadap produk yang dihasilkan atau
kehilangan substrat

BIOLOGI TANAH S2 58
1. PENGUKURAN RESPIRASI

BIOLOGI TANAH S2 59
METODA PENGHITUNGAN POPULASI

4. IDENTIFIKASI IMMUNOLOGI

• Menggunakan Polyclonal antibody

• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

BIOLOGI TANAH S2 60
AKTIVITAS ENZIMATIK

BIOLOGI TANAH S2 61
 3. PENGUKURAN AKTIVITAS MIKROORGANISME

PRODUKSI FITOHORMON (AUKSIN, CYTOKININ, GIBBERELIN, ABA DLL

BIOLOGI TANAH S2 62
Activity
assays

BIOLOGI TANAH S2 63
AKTIVITAS BAKTERI PELARUT FOSFAT DARI RHIZOSFIR TITHONIA

BIOLOGI TANAH S2 64
AKTIVITAS TERHADAP ANTIBIOTIK

BIOLOGI TANAH S2 65
AKTIVITAS ENZIMATIK

Aktivitas enzimatik dapat dilihat dengan menumbuhkan bakteri atau jamur

pada media yang mengandung substrat tertentu

BIOLOGI TANAH S2 66
JUMLAH DAN AKTIVITAS

• JUMLAH DAN AKTIVITAS MIROBIA

Hal-hal yang berlaku umum :

1. Menurun dengan kedalaman tanah
(Cenderung maksimum pada lapisan atas karena adanya O2
dan ketersediaan makanan)
2. Meningkat seiring dengan pertumbuhan tanaman
3. Meningkat bila aerasi, kadar air dan temperatur optimum
4. Meningkat segera setelah pengolahan tanah
5. Meningkat baik pada tanpa ataupun pengolahan terbatas

BIOLOGI TANAH S2 67
METODA PENGHITUNGAN

5. Isolasi DNA (teknik biomolekuler)

• Sel bakteri diekstrak dari tanah
• Kemudian dilysis dan DNA yang lepas
diekstrak
• Dilakukan Amplifikasi DNA dengan PCR
(Polymerase Chain Reaction)
• Dilakukan komparasi (pembandingan) dengan
segment DNA dari mikrobia target yang sudah
ada dalam DNA bank
BIOLOGI TANAH S2 68
 Vortex Macerating
Shaking
Washing with sterile water
or phosphate buffer

centrifuge

Non-adhering soil BIOLOGI TANAH S2 grinding

69
Ultrasonic bath
 Lolium perenne Trifolium repens

Bulk soil
Soil adhering to the root Washed root
(endorhizosphere/rhizoplane)
Purify DNA

Amplify 16S rDNA

16S rDNA cloning

16S rDNA characterized by

PCR restriction analysis

OUT measurement

Calculate the diversity

BIOLOGI TANAH S2 70
Marilley et al., 1998
Bioteknologi Tanaman

PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Reaksi Berantai Polymerase

BIOLOGI TANAH S2 71
Bioteknologi Tanaman

PCR

PCR : Reaksi amplifikasi/penggandaan molekul DNA secara in-

vitro dengan menggunakan bantuan enzim Taq-Polymerase

Prinsip Kerja Mesin PCR:

menyediakan kondisi reaksi optimal untuk terjadinya denaturasi
ds-DNA, pengikatan primer (annealing), dan ekstensi primer
dengan menggunakan molekul dNTPs bebas melalui bantuan
enzim Taq-Polymerase.

BIOLOGI TANAH S2 72
Bioteknologi Tanaman

PCR
Ditemukan oleh: Kary Mullis pada tahun 1984-5 (USA)

Gambar: T-Gradient PCR produksi Biometra-

Gmbh.-Jerman

BIOLOGI TANAH S2 73
Bioteknologi Tanaman

PCR
Taq-Polymerase ditemukan oleh: David Gelfant dan Susanne Stoffel
Diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.

Prasyarat:
1. DNA Template, DNA yang akan diamplifikasi
2. Primer (Oligonukleotida), (8-35 basa nukleotid) (spesifik,
arbitrary).
3. Enzim Taq-Polymerase, untuk mensintesis (memperpanjang
rantai DNA dengan kecepatan 150 nukleotid/detik.
4. dNTPs (dCTP, dGTP, dTTP, dATP), baik yang mixed atau single
5. MgCl2

BIOLOGI TANAH S2 74
 Enzim Restriksi

Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan

bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi,
internal = endonuklease

Aktifitas:
Memutuskan ikatan rantai phospodiester pada ujung 5‘ rantai DNA

BIOLOGI TANAH S2 75
Bioteknologi Tanaman
PCR

Siklus 3

Siklus 2

5‘ 3‘
Primer /
Oligonukleotid
3‘ 5‘ Siklus 1

5‘ 3‘
Templet
3‘ 5‘

BIOLOGI TANAH S2 76
 Electrophoresis:
Proses pemisahan molekul-molekul dengan
menggunakan arus listrik

Diperkenalkan tahun 1973 bersamaan dengan penemuan agarose

(Sambrook, et al. 1973)

BIOLOGI TANAH S2 77
 ALAT ELEKTROPHORESIS

Digunakan untuk pemisahan protein dan DNA

visualisasi aktivitas enzimatik pada gel serta karakterisasi sifat
fisikokimianya
BIOLOGI TANAH S2 78
Bioteknologi Tanaman

Prinsip:
DNA bermuatan negatif, karena itu mengalir dari negatif menuju positif
Molekul besar bermigrasi lambat, molekul kecil bermigrasi cepat

Power Supply

Horizontal electrophoresis Vertical electrophoresis

BIOLOGI
Dr. Jamsari, TANAH
Prog. S2 Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA
Studi 79
Bioteknologi Tanaman

Gambar Bak Elektrophoresis

Sumber: Bio Rad (Jerman)

BIOLOGI TANAH S2 80
Bioteknologi Tanaman

Faktor penentu laju migrasi

1. Berat molekul,
2. Konsentrasi gel,
3. Bentuk konformasi dari molekul DNA,
4. dan kekuatan arus listrik

1. Berat molekul,
Semakin berat semakin lambat

BIOLOGI TANAH S2 81
DNA MARKER

BIOLOGI TANAH S2 82
Identifikasi dengan DNA- Sequence
• Rantai pendek dari DNA produk amplifikasi
(PCR) menggunakan primer spesifik
selanjutnya dilakukan sequencing (pembacaan
urutan basa-basa) dari potongan DNA
tersebut. Kemudian urutan basa-basa tersebut
dilakukan komparasi (pembandingan) dengan
data base bakteri yang dimiliki oleh DNA Bank
Data menggunakan software BLASTN

BIOLOGI TANAH S2 83
TEKNOLOGI BARU TEST DNA

• Affymetrix
• “DNA Chip”
• Ratusan test dalam
waktu yang sama.
• Hasil yang
diperoleh di scan
dengan laser dan
file bisa disimpan
di komputer
BIOLOGI TANAH S2 84
BIOLOGI TANAH S2 85
Analisis data DNA yang diperoleh dapat
dianalisis dengan menggunakan berbagai
software gratis seperti Blast yang disediakan
oleh berbagai Bank Data DNA seperti NCBI
(USA), EBI (Eropa), dan DDBJ (Japan) yang
dapat diakses lewat internet ke website
lembaga tersebut

BIOLOGI TANAH S2 86
 Commitment to
USTPO International Collaboration EPO
GenBank EMBL
NCBI EBI
(USA) (Europe)
Since 1982 Since 1980

ーDNA Data Bank of

Japanー （DDBJ）
DDBJ
DDBJ
(Japan)
Since 1986 JPO
BIOLOGI TANAH S2 87
BIOLOGI TANAH S2 88
• TEKNIK DGGE (Different Gradient GEL
Electrophoreses)

BIOLOGI TANAH S2 89
BIOLOGI TANAH S2 90
CHUKA cahier de labo en page 81
droit
2/DGGE 2 sens gauche vers
e
Du 06/12/2010

Puits 1à5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

1Kb+ 1Kb+ 1Kb+ 1Kb+ 1Kb+ à 32

L
Sol L 1648 1649 1652 1653 1654 1657 1660 1661 1664 L 1665 1668 1671 1672 1675 1676 1677 9 10 L L DGGE
DGGE

Bulk

BIOLOGI TANAH S2 91
BIOLOGI TANAH S2 92
 Identifikasi dengan teknik
DGGE (Different Gradient Gel Electrophoresis

agustian agustian
100
20

40

60

80

sol 10 agustian
sol 9 agustian
ladder1 agustian
ladder2 agustian

BIOLOGI TANAH S2 93
BIOLOGI TANAH S2 94
9 (1) 9 (1) 9 (1) 9 (1) 10 (2) 10 (2) 10 (2) 10 (2)
Band No Position Band % Rf Band No Position Band % Rf
1 15 1,38 0,030 1 9 0,68 0,021
2 24 4,61 0,053 2 13 2,13 0,030
3 37 3,42 0,084 3 23 5,90 0,054
4 47 1,03 0,109 4 35 4,70 0,083
5 52 0,87 0,121 5 44 1,39 0,105
6 71 3,00 0,170 6 50 1,04 0,119
7 75 1,70 0,181 7 54 1,47 0,129
8 89 0,81 0,217 8 70 1,71 0,169
9 97 4,17 0,237 9 74 2,97 0,179
10 101 2,37 0,247 10 87 0,68 0,212
11 111 1,66 0,271 11 96 3,88 0,235
12 116 1,42 0,283 12 100 1,69 0,245
13 122 3,13 0,297 13 111 0,60 0,272
14 127 0,93 0,310 14 115 3,07 0,282
15 133 1,39 0,326 15 121 2,72 0,297
16 137 3,65 0,336 16 126 0,97 0,310
17 143 2,28 0,352 17 132 1,20 0,326
18 149 0,79 0,367 18 136 2,84 0,336
19 156 5,02 0,385 19 142 1,73 0,352
20 161 7,51 0,398 20 148 1,08 0,367
21 168 3,58 0,416 21 155 7,74 0,385
22 177 3,30 0,439 22 160 7,77 0,398
23 181 2,87 0,449 23 167 3,57 0,416
24 197 1,72 0,490 24 174 2,23 0,434
25 205 2,11 0,510 25 181 1,61 0,453
26 210 1,51 0,523 26 196 2,18 0,491
27 215 5,94 0,535 27 204 1,25 0,512
28 230 1,27 0,572 28 210 1,72 0,527
29 234 1,82 0,582 29 213 5,64 0,535
30 241 2,78 0,600 30 234 1,15 0,587
31 245 0,83 0,610 31 240 2,51 0,601
32 251 1,91 0,624 32 244 1,29 0,611
33 263 2,99 0,654 33 250 1,51 0,626
34 269 2,28 0,669 34 261 2,79 0,653
35 275 0,42 0,684 35 268 2,23 0,670
36 282 3,37 0,701 36 275 0,30 0,687
37 295 1,21 0,736 37 281 3,95 0,701
38 303 1,13 0,757 38 294 1,15 0,735
39 313 1,51 0,784 39 303 0,84 0,759
40 331 1,64 0,832 40 312 1,54 0,782
41 340 1,35 0,856 41 331 1,64 0,832
42 350 1,26 0,884 42 340 0,72 0,857
43 357 1,11 0,902 43 349 0,55 0,882
44 371 0,95 0,940 44 358 0,95 0,906
45 372 0,73 0,945

BIOLOGI TANAH S2 95
METODA PENGHITUNGAN

KELEMAHAN IDENTIFIKASI rDNA

• Ekstraksi DNA dan prosedur purifikasinya
sangat melelahkan
• Kebanyakan sel mikrobia sulit dilysis
• Humus dan komponen tanah lainnya sering
menjadi penghambat dalam proses ekstraksi

BIOLOGI TANAH S2 98
 Bio 97-Genetics

Recombinant DNA

BIOLOGI TANAH S2
©2001-2005 Lee Bardwell
99
 Plasmids and genetic engineering
• How does a vector plasmid looks like?
multiple cloning site or polylinker

His-tag
AmpR
(resistance for ampicillin) promoter

plasmid vector
The region called polylinker
contains a large number of
restriction enzyme recognition
sequences.

BIOLOGI TANAH S2 100

 Plasmids and genetic engineering
• Ligation: Inserting a gene into a plasmid.
Ligation
des Gens in den Vektor
Information about how to build Laktase!

gene for β-galctosidase (lacZ)

module 0

cleavage pattern
his-tag
ampR ampR

cut the plasmid vector with restriction enzymes ligation:

The ends are linked
by the enzyme: ligase religation

BIOLOGI TANAH S2 101

 Plasmids and genetic engineering
• Possible products after a ligation:
We have a mixture of both plasmids!

plasmid
plasmid
without insert.
4671 bp with insert
7752 bp

The gene for Lactase has not been inserted.

The gene for Lactase has been inserted.

BIOLOGI TANAH S2 102

BIOLOGI TANAH S2 103
BIOLOGI TANAH S2 104
BIOLOGI TANAH S2 105
 Transfer gen
dari bakteri
tanah yang
mengkode
pembentukan
suatu protein

Protein yang
terbentuk
bersifat toksin
dan bisa
membunuh
serangga
tertentu

BIOLOGI TANAH S2 106

BIOLOGI TANAH S2 107
BIOLOGI TANAH S2 108
 Rhizosphere zone

BIOLOGI TANAH S2
http://biology.kenyon.edu/courses/biol272/agriculture/agriculture.htm 109
 Mucilage
• Insoluble organic compounds of four different origins.

- mucilage secreted by Golgi organelles in the root cap cells.

- hydrolysates of the polysaccharides of the primary cell wall between

epidermal cells of the primary wall and sloughed root cap call.

- mucilage secreted by epidermal cells and root hairs.

- mucilage produced by bacterial degradation of dead epidermal cells.

BIOLOGI TANAH S2 110

 Root exudates

• Low molecular weight

compounds.

• Act as a messengers

• Energy for microbes

Root exudates as drops

on root surface

BIOLOGI TANAH S2 111

Chemical composition of exudates

BIOLOGI TANAH S2 112

Felix.D and Donald. A, 2002
• AKTIVITAS ENZIMATIK

BIOLOGI TANAH S2 113

AKTIVITAS ENZIMATIK

BIOLOGI TANAH S2 114

AKTIVITAS BAKTERI PELARUT FOSFAT DARI RHIZOSFIR TITHONIA

BIOLOGI TANAH S2 115

 3. PENGUKURAN AKTIVITAS MIKROORGANISME

PRODUKSI FITOHORMON (AUKSIN, CYTOKININ, GIBBERELIN, ABA DLL

BIOLOGI TANAH S2 116

Activity
assays

BIOLOGI TANAH S2 117

AKTIVITAS TERHADAP ANTIBIOTIK

BIOLOGI TANAH S2 118

AKTIVITAS ENZIMATIK

Aktivitas enzimatik dapat dilihat dengan menumbuhkan bakteri atau jamur

pada media yang mengandung substrat tertentu

BIOLOGI TANAH S2 119

 Thanks and
See you next week

BIOLOGI TANAH S2 120