TUGAS BIOKIMIA

“PEMURNIAN PROTEIN”
REKOMBINAN SUKROSAFOSFORILASE DARI LEUCONOSTOC
MESENTEROIDES MBFWRS-3(1) YANG DIEKSPRESIKAN DI
ESCHERICHIA COLI BL21DE

Dosen Pengampu :
Jena Hayu W., M. Farm., Apt

Disusun oleh :

Priskila Glory R.N (24185513A)

UNIVERSITAS SETIA BUDI

SURAKARTA
2019
 BAB I
PENDAHULUAN

Dasar Teori

Kata protein berasal dari protos atau proteos yang berarti pertama atau utama. Protein
merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karena sel itu
merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai
zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh. Proses kimia dalam tubuh dapat
berlangsung dengan baik, karena adanya enzim, suatu protein yang berfungsi sebagai biokatalis.
Kita memperoleh protein dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Protein yang
berasal dari hewan disebut protein hewani, sedangkan yang berasal dari tumbuhan disebut
protein nabati.

Beberapa makanan sumber protein ialah daging, telur, susu, ikan, beras, kacang, kedelai,
gandum, jagung, dan buah-buahan. Klasifikasi protein berdasarkan daya kelarutannya
1). Albumin : protein yang dapat melarut dalam air, dan dapat dipresipitatkan dari larutan pada
konsentrasi garam yang tinggi.
2). Globulin : protein ini umumnya tidak melarut dalam air yang basa, garam, dan dapat melarut
dalam larutan garam encer.
3). Glutelin : protein yang tidak melarut dalam larutan netral, retapi melarut dalam asam atau alkali
encer.
4). Prolamine : protein yang melarut dalam 70-80% etanol dan tidak melarut dalam air atau etanol
absolute
 BAB II
PEMBAHASAN
1. Saliva

Saliva adalah sekresi yang berkaitan dengan mulut, diproduksi oleh tiga padang kelenjar
saliva utama: kelenjar sublingual, submandibula dan parotis. Yang terletak diluar rongga mulut
dan menyalurkan saliva melalui duktus-duktus pendek kedalam mulut. Pada saliva mengandung
beberapa elektrolit (Na+, K+, Cl-, HCO3+, Ca2+, Mg2+HPO42+, SCN-, F-), protein (amilase,
musin, histatin, cystatin, peroxidase, lisozim dan laktoferin), immonuglobulin (sIgA, Ig G, dan Ig
M), molekul organik (glukosa, asam amino, urea, asam uric dan lemak) dan komponen-
komponen lain seperti Epidermal Growth Factor (EGF), insulin, cyclic adenosine
monophosphate binding protein dan serum albumin.

Fungsi saliva / air liur sebagai berikut :

1. Menghaluskan dan membentuk makanan menjadi bolus-bolus sehingga dapat ditelan dengan
mudah.

2. Melarutkan makanan secara kimia untuk pengecapan rasa

3. Melembabkan dan melumasi makanan sehingga dapat ditelan.

4. Saliva juga memberikan kelembaban pada bibir dan lidah sehingga terhindar dari kekeringan.

5. Memecah karbohidrat,zat tepung menjadi polisakarida dan maltose, suatu disakarida. ( karena
adanya enzim amilase dalam saliva).

6. Berfungsi untuk membersihkan rongga mulut dan gigi serta mencegah kerusakan gigi oleh
karena ada zat antibakteri dan antibodi dalam saliva.

7. Mencegah kerusakan dan erosi pada gigi.

8. Meminimalisir keasaman dalam rongga mulut, mencegah kerusakan struktur gigi saat terjadi
muntah.

9. Proses remineralisasi karena dalam saliva terkandung Ion-ion seperti Ca, P.

10. Membantu proses bicara dengan memudahkan gerakan bibir dan lidah.
Aliran saliva lambat sehingga saliva yang sampai dimulut bersifat hipotonik, agak asam, kaya K+
tetapi kurang Na+ dan Cl-.
2. Pemurnian Protein

Langkah pertama dalam pemurnian protein tertentu kebanyakan dilakukan dengan teknik
pengendapan. Teknik ini terutama ditujukan untuk memisahkan protein dari senyawaan bukan
protein yang terlarut. Protein dapat diendapkan dengan penambahan garam (salting out),
pengaturan pH, pengaturan suhu dan penambahan pelarut organic seperti alcohol atau aseton.
Namun beberapa jenis protein tidak dapat diendapkan dengan garam, bahkan penambahan garam
akan mempertinggi kelarutannya (salting in). Sifat protein seperti ini dapat juga digunakan untuk
pemurnian protein tersebut. Sentrifugasi banyak digunakan untuk mempercepat pengendapan
protein (Tim Penyusun, 2009). Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau
3000 rpm (Holme and Peck, 1993).

3. Fraksinasi dengan salting out

Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan ukuran
molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan dengan menambahkan
garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa
pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut “salting
out”. Metode “salting out” ini mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua fenomena tersebut
yang penting di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion
garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion dari garam
dengan air (Cantarow and Schepartz, 1963).
 Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang
didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang
konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk
mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya (Mayes
dkk, 1990). Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung
pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan
jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein (Yazid dan
Nursanti, 2006).

Suatu campuran protein, seperti yang dapat diekstraksi dari jaringan dengan
menggunakan atau larutan garam encer, dapat dipisah-pisahkan dengan penambahan sedikit
demi sedikit ammonium sulfat. Pertama-tama globulin akan diendapkan dan kemudian dapat
dipisahkan dengan sentrifus atau dengan penyaringan. Albumin mengendap apabila ammonium
sulfat dalam larutan tersebut telah jenuh. Pemisahan dengan menggunakan garam ini,
digabungkan dengan perubahan keadaan keasaman larutan dapat memisahkan campuran protein
dengan cukup baik. Pemurnian selanjutnya mungkin memerlukan prosedur kromatografi yang
lebih teliti (Montgomery dkk, 1993).

Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam-
garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi,
sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air.
Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein
akan berkurang (Mayes dkk, 1990).

Pemurnian Protein Rekombinan

Proses pemurnian protein dari kultur sel merupakan tahapan yang sangat penting dalam
produksi protein rekombinan. Umumnya produk hasil rekayasa genetika terdapat dalam larutan yang
sangat encer. Kadar senyawa terendah berkisar antara 10-200 mg/l, sedangkan kadar tertinggi antara
500
Tahapan yang harus dilakukan pada proses purifikasi produk hasil rekayasa genetika
adalah:

1. Memekatkan larutan kultur sel agar lebih pekat, sehingga dengan volume yang lebih kecil proses
purifikasi dapat dilakukan dengan baik.

2. Menghilangkan sebagian besar kontaminan utama termasuk DNA yang berasal dari kultur sel.

3. Setelah proses purifikasi, senyawa yang diperoleh harus dikarakterisasi sesuai dengan sifat-sifat
fisikokimia senyawa, uji bioaktivitas dan kemudian dilanjutkan dengan proses formulasi dan
sterilisasi untuk menghasilkan produk yang stabil untuk digunakan sebagai obat.

Pengembangan proses hilir suatu produk hasil rekayasa genetika, yaitu proses isolasi dan
purifikasi produk yang diinginkan skala besar atau skala industri, pada dasarnya tergantung pada dua
aspek penting yaitu, aspek perencanaan dan purifikasi, kedua adalah aspek peningkatan skala
produksi (scaleup).

Proses pemisahan senyawa protein rekombinan dari kontaminan memerlukan proses

perencanaan yang baik. Umumnya kultur sel mengandung sel hopses, pecahan sel, dan komponen
medium yang harus dihilangkan. Dengan memahami komponen utama kontaminan produk hasil
rekayasa genetila yang dihasilkan, dapat dijadikan dasar utama dalam proses pemecahan dan
purifikasi. Informasi harus jelas tentang sumber bahan yang digunakan apakah bakteri atau sel
mamalia, dan kontaminan utama, misalnya albumin atau senyawa sejenis, sifat-sifat fisikokimia dari
produk protein antara lain stabilitas produk terhadap pemanasan, titik isoelektrik, berat molekul,
hidrofobisitas, densitas dan sifat ikatan protein spesifik, merupakan faktor yang sangat menentukan
dalam proses perencanaan dan purifikasi senyawa protein.

Scale up adalah suatu proses untuk meningkatkan prosedur produksi skala laboratorium ke
skala industri yang lebih ekonomis. Selama fasa peningkatan skala laboratorium menjadi skala
industri, biasanya dilakukan terlebih dahulu suatu fasa pilot projek. Tujuan dari scale up adalah
untuk memproduksi produk hasil rekayasa genetika yang berkualitas dan lebih ekonomis yang
mampu bersaing secara komersial. Karena proses pemurnian yang merupakan komponen utama
produksi, mencapai 50-80% dari biaya proses produksi, harus dipilih metode purifikasi yang
ekonomis, agar produk hasil rekayasa genetika yang dihasilkan dapat bersaing di pasaran.
 Metode yang digunakan untuk mengisolasi dan memurnikan molekul protein, sedapat
mungkin dihindari menggunakan metode yang dapat mempengaruhi stabilitas protein, misalnya
pemanasan atau suasana pH yang ekstrem. Produk protein yang digunakan sebagai preparat
injeksi harus bebas dari pirogen dan harus steril. Proses pemurnian protein harus mampu
mengeleminasi dan menghilangkan virus kontaminan. Demikian pula berbagai kontaminan
minor termasuk DNA asing harus dapat dihilangkan dari produk hasil rekayasa genetika. Dewasa
ini berbagai metode purifikasi protein rekombinan telah dikembangkan dan divalidasi. Beberapa
metode pemurnian antara lain adalah filtrasi, sentrifugasi, prespitasi, dan berbagai cara
kromatografi, yaitu kromatografi adsorbsi, kromatografi pertukaran ion, kromatografi affinitas,
kromatografi interaksi hidrofobik dan kromatografi permiasi gel. Metode purifikasi yang
digunakan untuk memurnikan produk hasil rekayasa genetika tergantung pada jenis dan sifat
fisikokimia senyawa yang diproduksi.
 BAB III
PENUTUP

Kesimpulan
Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau
manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein yang
terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan
pertumbuhan tubuh. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik,
karena adanya enzim, suatu protein yang berfungsi sebagai biokatalis. Kita
memperoleh protein dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Protein
yang berasal dari hewan disebut protein hewani, sedangkan yang berasal dari
tumbuhan disebut protein nabati.

Daftar Pustaka

http://teguhs-atu.blogspot.com/2010/01/senyawa-organik.html
http://ruangilmu.com/index.php?action=artikel&cat=83&id=122&artlang=id
http://lisadyprotein.blogspot.com/
http://id.wikipedia.org/wiki/Protein
http://www.postmodern.com/~jka/rnaworld/nfrna/nf-rnadefed.html.
Poedjiadi Anna dan F.M. Titin Supriyanti, 2005, Dasar-Dasar Biokimia (Revisi), Jakarta:
Universitas Indonesia.
 ABSTRAK
Judul :Pemurnian protein rekombinan sukrosafosforilase dari Leuconostoc mesenteroides
MBFWRS-3(1) yang diekspresikan di Escherichia coli BL21DE

Enzim sukrosafosforilase termasuk dalam kelompok enzim glukosiltransferase yang

dapat mengkatalisis sukrosa dan fosfat menjadi Ɗ-fructose dan α-Ɗ-glucose 1-phospate. SPase
berperan dalam pemindahan gugus glukosil ke sejumlah senyawa (transglikosilasi). Reaksi
transglkosilasi dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan stabilitas kimia dan memperbaiki
karakteistik senyawa bioaktif.

Tujuan penelitian ini adalah melakukan pemurnian SPase rekombinan yang dihasilkan
oleh Escherichia coli BL21DE yang membawa gen penyandi sukrosafosforilase asal
Leuconostoc mesenteroides dengan kromatografi affinitas pada kondisi optimum dan menguji
aktivitas SPase rekombinan dengan metode spektofotometri. Pada esei enzimatis, SPase
direaksikan menggunakan substrat sukrosa dan produk akhirnya diukur sebagai NADPH pada
340 nm. Hasil SDS PAGE ,menunjukan SPase rekombinan berhasil dimurnikan dengan berat
molekul yang telah diidentifikasi dari penelitian sebelumnya adalah 55-57 kDa. Hasil esei
aktivitas enzimatis menggunakan metode spektofotometri menunjukan bahwa SPase rekombinan
ini terbukti aktif meskipun aktivitasnya lebih rendah dibandingkan SPase standar dari
Leuconostoc mesenteroides.

Kata kunci : sukrosafosforilase, SDS PAGE, spektrofotometri, aktivitas enzimatis,

transglikosilasi xvi+70 halaman :16 gambar ; 8 tabel; 10 lampiran Daftar Pustaka : 25 (1990-
2011) Pemurnian protein..., Pauline Leon Artha, FT UI, 2012