perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.

id

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini bersifat experimental laboratorium dengan rancangan penelitian

post test only control group, karena pengukuran hanya dilakukan setelah pemberian

perlakuan pada hewan uji (Taufiqurrahman, 2004).

B. Lokasi Penelitian

Dilaksanankan di Laboratorium Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.

C. Subyek Penelitian

Tikus Putih Jantan (Rattus norvegicus) yang diinduksi larutan NaCl 8 % sehingga

menjadi hipertensi.

D. Teknik Sampling

Teknik sampling yang digunakan adalah purposive sampling, yaitu subyek

penelitian berupa Tikus Putih (Rattus norvegicus) dipilih dengan kriteria tertentu dan

dibagi menjadi 5 kelompok secara acak (randomisasi) (Notoadmodjo, 2002).

E. Hewan Percobaan

Hewan uji yang digunakan dalam percobaan berupa tikus putih jantan (Rattus

norvegicus) karena tidak terpengaruh siklus menstruasi dan proses kehamilan, dengan

galur Wistar (supaya didapat latar belakang genetik yang seragam) yang diperoleh

dari Laboratorium Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta, dengan usia kurang

lebih 2-3 bulan dengan berat badan kira-kira 100-200 gram. Sampel sebanyak 30 ekor

yang dibagi secara acak dalam 5 kelompok masing-masing kelompok terdiri atas 6
commit to user

33
perpustakaan.uns.ac.id 34
digilib.uns.ac.id

ekor tikus putih jantan. Semua tikus tersebut sebelumnya telah diinduksi larutan

NaCl.

Besar sampel tersebut didapat melalui perhitungan dengan menggunakan rumus

Federer, yaitu :

(k-1)(n-1) ≥ 15

k : jumlah kelompok

n : jumlah sampel dalam tiap kelompok

(k-1)(n-1) ≥ 15

(5-1)(n-1) ≥ 15

n-1 ≥ 3,75

n ≥ 4,75 ≈ 5 (dibulatkan)

Pada penelitian ini jumlah sampel untuk tiap kelompok ditentukan sebanyak 6

ekor tikus putih (Notoadmodjo, 2002; Hernani, 2009).

F. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas : ekstrak etanol daun belimbing wuluh

2. Variabel terikat :

a. Tekanan Darah. Tekanan darah diukur setelah induksi larutan NaCl 8%

sebelum dan sesudah pemberian perlakuan dosis ekstrak daun belimbing

wuluh.

b. Efek diuresis. Diukur dengan menghitung volume urin tikus putih jantan tiap 6

jam sebanyak 4 kali dimulai dari pukul 09.00 sampai pukul 09.00 sehari

setelahnya.

3. Variabel pengganggu :
commit to user
a. Variabel pengganggu yang terkendali
perpustakaan.uns.ac.id 35
digilib.uns.ac.id

1) Kondisi fisik hewan uji yang meliputi berat badan, usia, jenis kelamin,

galur, kondisi laboratorium, alat-alat penelitian, dan pengamatan peneliti.

2) Adanya stres yang terjadi pada hewan uji akibat adaptasi lingkungan

tempat percobaan.

b. Variabel pengganggu yang tidak terkendali

1) Variasi kepekaan tikus putih jantan terhadap zat dan obat yang digunakan.

2) Keadaan ginjal tikus putih jantan.

G. Definisi Operasional

1. Ekstrak etanol daun belimbing wuluh

Ekstrak adalah sediaan sari pekat tumbuh-tumbuhan atau hewan yang

diperoleh dengan cara melepaskan zat/senyawa aktif dari masing-masing obat,

menggunakan pelarut yang cocok, uapkan semua atau hampir semua dari

pelarutnya, dan sisa endapan atau serbuk diatur untuk ditetapkan standarnya

(Ansel, 1989). Ekstrak etanol daun belimbing wuluh adalah ekstrak dari daun

belimbing wuluh yang telah dikeringkan kemudian diproses dengan suatu cairan

pengekstraksi yaitu etanol 70% dengan menggunakan metode perkolasi. Ekstrak

tersebut akan diberikan ke hewan uji secara peroral, yang dibagi kedalam 3 dosis

perlakuan.

2. Uji Tekanan Darah

Tekanan darah hewan uji diukur dengan cara tail cuff method menggunakan

alat blood pressure analyzer untuk hewan uji. Metode ini memungkinkan peneliti

untuk mengetahui tekanan darah sistolik dan diastolik. Tekanan darah hewan uji

diukur sebelum dan sesudah pemberian perlakuan dosis ekstrak daun belimbing

wuluh.
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id 36
digilib.uns.ac.id

3. Uji Efek Diuresis

Efek diuresis adalah volume urine yang dikeluarkan oleh hewan uji setelah

pemberian perlakuan dan dihitung selama 24 jam. Pengamatan dilaksanakan

setiap 6 jam setelah pemberian perlakuan. Skala yang digunakan adalah skala

rasio. Alat ukur yang digunakan adalah spuit injeksi.

4. Variasi genetik, jenis kelamin, berat badan, dan umur tikus

Tikus putih yang digunakan berjumlah 30 ekor dengan galur Wistar agar

variasi genetiknya seragam, berjenis kelamin jantan dan memiliki berat 150-200

gr dan berumur 2-3 bulan.

5. Makanan dan Minuman

Makanan digunakan adalah pakan standar yakni pelet BR-II dan minum

selama 7 hari adaptasi dan 7 hari pemberian induksi larutan NaCl. Selanjutnya

tikus putih dipuasakan selama lebih kurang 18 jam sebelum perlakuan, tetapi air

minum tetap diberikan (Fitriyani et al., 2011). Tujuannya adalah untuk

mengosongkan lambung tikus agar ekstrak biji pepaya yang diberikan akan

bekerja maksimal.

6. Suhu

Tikus putih dikandangkan selama 14 hari dalam kandang yang sama dengan

suhu ruangan berkisar 250-280C agar dapat beradaptasi dan untuk menyamakan

kondisi psikologis antar tikus yang dipengaruhi lingkungan sekitar.

7. Variasi kepekaan tikus terhadap zat atau obat yang diberikan

Ada kemungkinan tikus memiliki kepekaan yang berbeda-beda terhadap zat

atau obat yang diberikan selama penelitian.

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id 37
digilib.uns.ac.id

H. Rancangan Penelitian

1. Uji Tekanan Darah

K1 P1 T1

K2 P2 T2

S I T0 K3 P3 T3 A

K4 P4 T4

K5 P5 T5

Gambar 3.1 Skema Rancangan Penelitian Uji Tekanan Darah

2. Uji Efek Diuresis

K1 P1 U1

K2 P2 U2

K3 P3 U3 A

K4 P4 U4

K5 P5 U5

Gambar 3.2 Skema Rancangan Penelitian Uji Diuresis

Keterangan :

K1 : kelompok kontrol negatif

K2 : kelompok kontrol positif

commit to user
K3 : kelompok uji dosis I
perpustakaan.uns.ac.id 38
digilib.uns.ac.id

K4 : kelompok uji dosis II

K5 : kelompok uji dosis III

P1 : pemberian aquadest 2,5 ml/100 g BB tikus putih jantan hipertensi

P2 : pemberian HCT dosis 0,225 mg/100 g BB tikus putih jantan/2,5 ml air

P3 : pemberian ekstrak daun belimbing wuluh dosis I (57,5 mg/100 g BB)

P4 : pemberian ekstrak daun belimbing wuluh dosis II (115 mg/100 g BB)

P5 : pemberian ekstrak daun belimbing wuluh dosis III (172,5 mg/100 g BB)

U1 : pengukuran volume urin kelompok kontrol negatif

U2 : pengukuran volume urin kelompok kontrol positif

U3 : pengukuran volume urin kelompok uji dosis I

U4 : pengukuran volume urin kelompok uji dosis II

U5 : pengukuran volume urin kelompok uji dosis III

A : analisis data

S : subjek penelitian (30 ekor tikus putih jantan)

I : induksi hipertensi dengan larutan NaCl 8%

T0 : pengukuran tekanan setelah induksi (sebelum pemberian dosis perlakuan)

T1 : pengukuran tekanan darah kelompok kontrol negatif setelah perlakuan

T2 : pengukuran tekanan darah kelompok kontrol positif setelah perlakuan

T3 : pengukuran tekanan darah kelompok dosis I setelah perlakuan

T4 : pengukuran tekanan darah kelompok dosis II setelah perlakuan

T5 : pengukuran tekanan darah kelompok dosis III setelah perlakuan

commit to user
perpustakaan.uns.ac.id 39
digilib.uns.ac.id

I. Instrumentasi Penelitian

1. Alat yang diperlukan :

a. Kandang tikus putih untuk tempat mengadaptasi tikus putih jantan pada

tempat percobaan.

b. Timbangan hewan untuk mengukur berat badan tikus putih jantan.

c. Spuit pencekok untuk memasukkan sampel uji ke tikus putih jantan per oral.

d. Metabolic cage for rats kandang uji diuretik untuk tikus putih jantan.

e. Kantong plastik untuk menampung urin hasil percobaan.

f. Stopwatch/jam untuk mengetahui waktu pengukuran volume urin tikus putih

jantan.

g. Injection spuit untuk mengukur volume urin hasil uji diuretik.

h. Tensimeter untuk tikus untuk mengukur tekanan darah tikus putih jantan.

2. Bahan yang diperlukan :

a. Ekstrak daun belimbing wuluh

b. HCT dosis 0,225 mg/100 g BB tikus putih jantan sebagai kontrol positif

c. Aquadest sebagai kontrol negatif

d. CMC sebagai bahan pensuspensi bahan uji

e. Makanan standar tikus putih brailer-II pellet

f. Larutan NaCl 8% sebagai penginduksi hipertensi

J. Perhitungan Dosis

1. Hidroklorotiazid (HCT)

Faktor konversi manusia dengan berat badan (BB) 70 Kg ke tikus putih

dengan BB 200 gram adalah 0,018. Dosis HCT yang digunakan sebagai diuretik

adalah 25 mg/hari (Nafrialdi, 2007).

commit tokeuser
Dosis terapi manusia 70 Kg dikonversi tikus 200 gram adalah
perpustakaan.uns.ac.id 40
digilib.uns.ac.id

= 25 mg x 0,018/200 g BB tikus putih

= 0,45 mg/200 g BB tikus putih

= 0,225 mg/100 g BB tikus putih

Volume cairan maksimal yang dapat diberikan per oral pada tikus putih

adalah 5 ml/100 g BB. HCT tab 25 mg dilarutkan dalam 100 ml aquadest,

sehingga dalam 100 ml larutan terdapat 25 mg HCT.

Untuk mendapatkan 0,225 mg HCT maka :

25 𝑚𝑔 0,225 𝑚𝑔
=
100 𝑚𝑙 𝑥 𝑚𝑙

100 𝑥 0,225
X= 25

X = 0,9 ml

Jadi, dalam setiap 0,9 ml larutan terdapat 0,225 mg HCT (perbandingan

larutan : HCT adalah 4 : 1).

2. Ekstrak Daun Belimbing Wuluh

Volume maksimal yang dapat diberikan per oral pada tikus putih adalah 5

ml/200 g BB. Jadi, dalam memperkirakan volume ekstrak etanol daun belimbing

wuluh yang akan diuji tidak boleh melebihi 5 ml/200 g BB atau 2,5 ml/100 g BB

tikus putih.

Dalam menentukan dosis ekstrak etanol daun belimbing wuluh pada

penelitian ini mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Hernani et al. (2009)

yang menggunakan hewan uji berupa kucing. Faktor konversi kucing dengan berat

badan (BB) 2 Kg ke tikus putih dengan BB 200 gram adalah 0,23. Dosis ektrak

daun belimbing wuluh yang diberikan adalah 25 mg/KgBB. Dosis I merupakan

angka konversi dosis tersebut, sedangkan dosis II adalah 2 kali dosis I dan dosis

III adalah 3 kali dosis I. Masing-masing kelompok diberikan ekstrak selama 1 hari
commit to user
sesuai dengan dosisnya.
perpustakaan.uns.ac.id 41
digilib.uns.ac.id

Dosis I = 25 mg x 0,23/Kg BB tikus putih

= 5,75 mg/Kg BB tikus putih

= 57,5 mg/100 g BB tikus putih

Dosis II = 2 x 25 mg x 0,23/Kg BB tikus putih

= 11,5 mg/Kg BB tikus putih

= 115 mg/100 g BB tikus putih

Dosis I = 3 x 25 mg x 0,23/Kg BB tikus putih

= 17,25 mg/Kg BB tikus putih

= 172,5 mg/100 g BB tikus putih

3. Kontrol Negatif

Volume cairan maksimal yang dapat diberikan per oral pada tikus putih

adalah 5 ml/100 g BB. Penentuan takaran dosis maksimal yang digunakan untuk

penelitian tidak disarankan untuk menggunakan lebih dari setengah volume cairan

maksimal yang diberikan. Dengan demikian, maka :

Volume cairan maksimal dengan BB 100 g = 5 ml

Setengah dari dosis maksimal = 2,5 ml

4. Larutan NaCl 8%

Volume larutan NaCl 8 % yang diberikan sebagai penginduksi hipertensi

adalah 3 ml per hari untuk tikus putih jantan selama 14 hari. Dosis tersebut sesuai

dengan penelitian yang dilakukan oleh Lailani et al. (2013).

commit to user
 perpustakaan.uns.ac.id 42
digilib.uns.ac.id

K. Cara Kerja

Tikus Putih Jantan diadaptasi selama 7 hari

Induksi Hipertensi dengan Larutan NaCl 8%

3 ml per hari selama 14 hari

Ukur Tekanan Darah

Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok

Kontrol Kontrol Positif Perlakuan I Perlakuan II Perlakuan III
Negatif
2. Tikus putih 3. Tikus putih 4. Tikus putih 5. Tikus putih
1. Tikus putih jantan jantan jantan jantan
jantan hipertensi hipertensi hipertensi (6 hipertensi (6
hipertensi (6 ekor) + (6 ekor) + ekor) + ekor) +
(6 ekor) + 2,5 ml HCT ekstrak ekstrak ekstrak daun
daun daun belimbing
aquadest dosis 0,225
belimbing belimbing wuluh dosis
2,5 ml/100 mg/100 g
wuluh wuluh dosis 172,5
g BB BB selama
dosis 57,5 115 mg/100g BB
selama 1 1 hari
mg/100g mg/100g BB selama 1 hari
hari BB selama selama 1
1 hari hari

Masukkan hewan uji ke dalam Metabolic

cage for rats dengan tetap memberikan
induksi larutan NaCl

Ukur volume urin dari semua Ukur tekanan darah dari semua
kelompok perlakuan setiap 6 jam kelompok perlakuan

Urin 6 jam Urin 6 jam Urin 6 jam Urin 6 jam

pertama kedua ketiga keempat
Analisis Data

Analisis data

commit to user

Gambar 3.3 Skema Cara Kerja Penelitian

perpustakaan.uns.ac.id 43
digilib.uns.ac.id

1. Membuat ekstrak etanol daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.)

Pembuatan ekstrak etanol daun belimbing wuluh dilakukan Laboratorium

Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Daun belimbing wuluh (Averrhoa

bilimbi L.) diperoleh dari Merapi Farma Herbal, Jalan Kaliurang KM 21,

Yogyakarta. Pembuatan ekstrak tersebut besasal dari bahan berupa daun

belimbing wuluh yang telah dikeringkan kemudian diproses dengan suatu cairan

pengekstraksi yaitu etanol 70% dengan menggunakan metode pembuatan ektraksi

yaitu perkolasi.

2. Langkah Penelitian

a. Membuat Model Hipertensi pada Hewan UJi

Hewan uji dipuasakan selama 18 jam sebelum perlakuan, setelah

diadaptasi selama kurang lebih 1 minggu di tempat percobaan. Hewan uji

kemudian dibagi menjadi 5 kelompok secara acak, masing-masing terdiri atas

6 ekor tikus putih jantan. Kemudian tikus putih jantan ditimbang dengan

menggunakan timbangan hewan, setelah itu diberi perlakuan (Fitriyani et al.,

2011).

Semua kelompok perlakuan sebelumnya diinduksi hipertensi dengan

menggunakan larutan NaCl 8% per oral dengan volume 3 ml per hari pada

tikus putih jantan selama 14 hari (Lailani et al., 2012).

Pengukuran tekanan darah dapat dilakukan pada tikus hipertensi spontan

atau hipertensi buatan. Pengukuran tekanan darah dengan cara Tail Cuff

method menggunakan alat blood pressure analyzer untuk hewan uji. Metode

ini memungkinkan peneliti untuk mengetahui tekanan darah sistolik dan

commit to user
diastolik. Prinsip kerja pengukuran tekanan darah adalah cuff pada ekor
perpustakaan.uns.ac.id 44
digilib.uns.ac.id

digelembungkan sampai mencapai tekanan darah diatas tekanan darah

sistolik, sehingga nadi menghilang kemudian tekanan cuff dikurangi perlahan-

lahan. Pada saat tekanan darah mencapai di bawah tekanan sistolik nadi akan

muncul kembali. Cara pengukuran ini sesuai dengan cara pengukuran tekanan

darah menggunakan sphigmomanometer pada manusia. Pengukuran tekanan

darah pada metode Tail Cuff selain digunakan pada tikus juga dapat digunakan

pada mencit, anjing, dan primata kecil. Tekanan darah sistol normal untuk

tikus putih jantan adalah 122,25 ± 7,63 mmHg dan diastol 78 ± 9,44 mmHg.

Apabila nilai tekanan darah diatas normal maka dapat dikatakan hipertensi

(Ngatidjan, 2006; Lailani et al., 2012).

b. Pemberian Perlakuan

1) Kelompok I yaitu tikus putih jantan diberi 2,5 ml aquadest sebagai kontrol

negatif selama 1 hari.

2) Kelompok II yaitu tikus putih jantan 2,5 ml HCT dosis 0,225 mg/100 g

BB, sebagai kontrol positif selama 1 hari.

3) Kelompok III yaitu tikus putih jantan diberi ekstrak daun belimbing wuluh

dosis I (57,5 mg/100 g BB) selama 1 hari.

4) Kelompok IV yaitu tikus putih jantan diberi ekstrak daun belimbing

wuluh dosis II (115 mg/100 g BB) selama 1 hari.

5) Kelompok V yaitu tikus putih jantan diberi ekstrak daun belimbing wuluh

dosis III (172,5 mg/100 g BB) selama 1 hari.

c. Uji Tekanan Darah

Tekanan darah hewan uji diukur sebanyak 2 kali yaitu saat sebelum

perlakuan pasca induksi dengan larutan NaCl 8% dan setelah pemberian

commit to
perlakuan sesuai dengan kelompok usermasing-masing.
dosis
perpustakaan.uns.ac.id 45
digilib.uns.ac.id

d. Uji Efek Diuresis

Setelah pemberian perlakuan, setiap tikus putih langsung dimasukkan ke

dalam kandang khusus untuk uji diuretik (metabolic cage for rats) dengan

tetap memberikan larutan NaCl 8 % sebagai penginduksi hipertensi.

Penampungan dan pengukuran urin tikus dilakukan setiap 6 jam, selama 24

jam.

L. Teknik dan Analisis Data

1. Uji Tekanan Darah

Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan melakukan uji

normalitas menggunakan Uji Saphiro-Wilk, dilanjutkan uji Friedman, yang

dilanjutkan dengan uji Wilcoxon (Dahlan, 2010).

2. Uji Efek Diuresis

Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan melakukan uji

normalitas menggunakan Uji Saphiro-Wilk, dilanjutkan Kruskall-Wallis, yang

dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney (Dahlan, 2010).

commit to user