DETEKTOR HPLC (High Performance Liquid

Chromatography)

DISUSUN OLEH :

NAMA KELOMPOK:
KHOFIA
LUTFIVA P. NIM 16013010
LIA FITRIANA DEWI NIM 16013011

S1 FARMASI
SEKOLAH TINGGI TEKNOLOGI INDUSTRI DAN FARMASI
BOGOR
 2016-2017

DETEKTOR HPLC (High Performance Liquid

Chromatography)

1. Pengertian Detektor HPLC

Tinggi Kromatografi cair berperforma (atau kromatografi cair tekanan tinggi, HPLC)
merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia
untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang

HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan kemasan (tahap

tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s) melalui kolom, dan detektor yang
menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi
antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan. 

Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan

tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode
kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. HPLC mempunyai keunggulan dibanding
kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor
merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang
modern.

2. Klasifikasi Detektor

Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

 1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :

 Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul
sampel maupun fase gerak (bulk property detector).
Detektor dapat dibedakan menjadi :
Detektor Indeks Bias 
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah
detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak
murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat
dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif
dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
  Detektor konduktivitas 
 Detektor tetapan dielektrika.
 Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute
property detector). 
Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak, 
• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi
sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel).
Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena
sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV
terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV
dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV
yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur.
Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada
 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang
gelombang tersebut. 
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini
dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus
fungsionalnya dapat diketahui.
• Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran.
2) Memerlukan pemisahan fase ferak terlebih dahulu
Termasuk didalamnya FID dan ECD.

Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu: 

1. Detektor spektrofotometrik 
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas.
Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang
sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai
macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan
digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus
berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern
merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi.
Dibandingkan dengan ribuan dollar yang harus dikeluarkan untuk spektrofotometer yang
hanya bahkan tergolong kelas dua saja, maka $2500 atau sekitar itu akan mendapatkan
sebuah detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada 254 atau 280 nm (harga-
harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis
lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator, penyaring-
penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum
merkuri. 
Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektor-
detektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang
menyerap semua pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan
hampir semua senyawa aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi
(yakni: purin, pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada
254 nm.
Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan
panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang
 melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat
“melihat” kuantitas nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih
sensitiv daripada detektor indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak
sensitif terhadap temperatur. 
2. Detektor Fluorometrik 
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang
paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di
sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah
sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana
digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan
radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada sisi eksitasi
maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang gelombang eksitasi yang
lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya
banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati
dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang
fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample
nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling
terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi
dengan reagen fluoresamin (fluorescamin). 
3. Detektor Elektrokimia 
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan
polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-
solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik.
Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut
mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga,
dimana komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian
jenis ini telah digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di
dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti
dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi
pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi
perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan
garam.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut :

Detektor Sensitifita Kisaran Karakteristik

s (g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 sering digunakan, selektif
spektrometer photo > 2 x 10-10 105 terhadap gugus-gugus dan
-diode array struktur-struktur yang
tidak jenuh.
-12 4
Fluoresensi 10 10 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
-7 4
Indeks bias 5 x 10 10 Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada
elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan
Amperometri 10-12 105 suhu dan kecepatan alir
fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut
ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan
adanya kontaminasi
elektroda.
JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. 
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam
dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase
normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar
90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai
reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.3)

4. Desain detector
Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan
kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa
pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa
mikroliter.

5. Pemilihan detektor 
Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan
pada persyaratan sebagai berikut :
a. cukup sensitive
b. stabilitas dan keterulangan tinggi
c. respon linear terhadap solute
d. waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir
e. relibilitas tinggi dan mudah digunakan
f. tidak merusak cuplikan.
Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan satu-satunya
detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv dan sangat peka tehadap
perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang yang variabel merupakan
pilihan yang paling baik bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat
spesifik dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia.

6. Analisis Kuantitatif 
Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai
korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut,
konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas
sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram. 
Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak
area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu
kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuat
kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.