VALIDASI METODE ANALISIS

REVIEW JURNAL
Development and Validation of a Normal Phase Chiral HPLC Method
for Analysis of Afoxolaner Using a Chiralpak AD-3 Column
Pengembangan dan Validasi Metode HPLC Chiral Fase Normal
untuk Analisis Afoxolaner menggunakan kolom Chiralpak AD-3

Disusun oleh :
Kelas A
Restina Rachmawati 3311161016
 PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI
CIMAHI
2018
1. Ringkasan Penelitian (Abstrak)
Afoxolaner adalah obat antiparasit baru turunan golongan isoxazoline
yang bekerja pada serangga yaitu pada reseptor glutamat dan acarine
gamma-aminobutyric acid. Golongan isoxazoline merupakan senyawa yang
telah digunakan sebagai bahan aktif farmasi dalam produk obat yang
diresepkan untuk mengendalikan atau melawan kutu pada anjing. Afoxolaner
merupakan senyawa dengan pusat kiral pada cincin isoxazoline, terutama
pada campuran rasemik. Kemudian dikembangkan sebuah metode analitik
kromatografi cair kinerja tinggi dengan fase normal untuk dapat
memverifikasi campuran rasemik afoxolaner seperi yang ditunjukan oleh
rotasi tertentu dan dapat menentukan kemurnian enansiomer dari sampel
enansiomer tunggal. Metode dilakukan dengan menggunakan kolom
Chiralpak® AD-3 (150 × 4,6 mm ID) suhu yang dipertahankan pada 35 ° C.
Analit dianalisis dengan elusi isokratik menggunakan n- Hexane / IPA /
MeOH (89: 10: 1, v / v / v) sebagai fase gerak dengan panjang gelombang
deteksi 312 nm. Pemisahan yang diinginkan dari dua enansiomer dicapai
dalam <10 menit dengan resolusi dan faktor selektivitas masing-masing 5,0
dan 1,54. Metode analisis divalidasi secara tepat sesuai dengan pedoman ICH
untuk tujuan penggunaannya.(Zhuang, Kumar, & Rustum, 2016)

2. Pendahuluan
a. Alasan menggunakan metode tersebut
Senyawa enansiomer tunggal kiral aktif biologis telah digunakan
dalam berbagai macam produk obat oleh industri farmasi selama beberapa
dekade. Enansiomer tunggal dari senyawa kiral berfotensi menunjukan
aktivitas farmakologi, toksikologi dan metabolisme yang berbeda dalam
sistem kehidupan. Karena hanya satu dari dua enansiomer yang
memberikan respon terapeutik yang diinginkan, sedangkan enansiomer
lainnya mungkin tidak atau atau memberikan efek yang merugikan. Oleh
karena itu, sangat penting untuk mengembangkan metode analisis yang
dapat mengidentifikasi dan menentukan kemurnian enansiomer dari bahan
aktif farmasi maupun produk obat. Untuk memberikan panduan industri
farmasi mengenai topik ini, US Food and Drug Admiinistration (FDA)
mengeluarkan panduan “ Pengembangan Obat Stereoisomerik Baru” pada
tahun 1992. Ddidalamnya tercantum bahwa spesifikasi untuk produk
akhir harus menjamin identitas, kekuatan, kualita dan kemurnian dari
sudut pandang stereokimia.
Kromatografi kiral telah terbukti sangat mampu untuk identifikasi
dan kuantitasi senyawa kiral. Analisis kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) untuk senyawa kiral dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu :
langsung dan tidak langsung. Cara tidak langsung HPLC kiral melibatkan
derivatif analit yang mengarah ke dua diasteromer yang diikuti oleh
 pemisahan menggunakan kromatografi fase balik. Sedangkan, metode
langsung menggunakan fase diam kiral atau dalam fase gerak untuk
membedakan enansiomer. Metode langsung merupakan metode yang
paling banyak digunakan untuk pemisahan kiral karena banyak tipe yang
dapat dipillih, seperti : Pirkle, siklodekstrin, fase chirobiotik, protein dan
polisakadia dan tidak ada pretreatment dari analit yang diperlukan. Dari
berbagai macam jenis fase diam kiral, tipe modifikasi selulosa dan
polisakarida berbasis amilosa yang awalnya dikembangkan oleh Okamoto
dan Yashima, telah menunjukan kemampuan penemuan kiral yang sangat
baik dalam berbagai aplikasi.
Sehingga dalam makalah ini menjelaskan pengembangan fase
normal metode HPLC kiral yang menggunakan kolom polisakarida
berbasis amilosa untuk pemisahan campuran rasemik afoxolaner.
b. Tinjauan umum metode tersebut
Afoxolaner adalah molekul insektisida acaricide baru dari golongan
isoxazoline. Senyawa ini digunakan sebagai bahan farmasi digunakan
pada obat-obatan hewan (misalnya, NexGard® ) untuk kontrol kutu
dengan bertindak pada reseptor gamma-aminobutyric acid dan reseptor
glutamat. Afoxolaner adalah molekul netral tanpa kelompok yang dapat
terionisasi. Afoxolaner memiliki log P dari 5,15 menunjukkan karakter
hidrofobik yang kuat dan memiliki satu pusat kiral pada cincin
isoxazoline. Untuk tujuan pengembangan metode, dua enansiomer dari
senyawa itu bernama " Enansiomer 1 " dan " Enansiomer 2 ".
Karena afoxolaner merupakan entitas kimia yang relatif baru, saat ini
tidak ada laporan yang dipublikasikan tentang pemisahan kiral
afoxolaner. Tujuan utama dari pengembangan metode ini adalah untuk
mengembangkan HPLC kiral fase normal yang sensitif, kasar dan ramah
QC yang dapat memverifikasi sampel afoxolaner adalah merupakan
campuran rasemik, serta dapat menentukan kemurnian enansiomer dari
enansioomer tunggal. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1
afoxolaner memiliki satu pusat kiral pada cincin isoxazoline.

Gambar 1. Satu Pusat Kiral pada cincin isoxazoline

 Selanjutnya, "Enansiomer 1" diperlakukan sebagai bahan baku
farmasi dan "Enansiomer 2" sebagai pengotor atau enansiomer yang
tidak diinginkan. Karena kedua enansiomer diharapkan untuk berperilaku
sama dalam kromatografi (kecuali waktu retensi), metode ini dapat
digunakan juga ketika "Enansiomer 1" diperlakukan sebagai pengotor.
Pemisahan yang diinginkan dari dua enansiomer dicapai dalam <10
menit pada kolom Chiralpak® AD-3 (150 × ID4,6 mm) pada 35° C
dengan elusi isokratik menggunakan n- Hexane / IPA / MeOH (89: 10: 1,
v / v / v). Analit dipantau dengan panjang gelombang deteksi 312 nm.
Metode analisis baru telah berhasil divalidasi untuk tujuan sesuai
pedoman ICH dan terbukti akurat, linear, tepat, spesifik, sensitif dan
kuat.

3. Metode Penelitian
a. Bahan
 Baku Standar dan sampel afoxolaner.
 Pelarut Fase Gerak : n –Hexane
 Alkohol : Isopropanol (IPA), metanol, etanol, n-propanol, 1-butanol,
2-butanol, t-butanol, 3-Metil-1-butanol, Hexanol dan sikloheksanol
b. Kolom HPLC
Kolom HPLC polisakarida yang berbeda digunakan untuk
pengembangan metode. Kolom yang digunakan adalah Chiralpak ® AD-
3 (150 × 4,6 mm, 3 μ m ukuran partikel), Chiralcel ® OD-H (150 × 4,6
mm, 5 μ m ukuran partikel) dan Chiralcel ® OJ-3 kolom (150 × 4,6 mm ,
3 μ ukuran partikel m). Kolom Chiralpak ® memiliki turunan amilosa
tris (3,5-dimethylphenyl- carbamate) sebagai fase diam yang dilapisi gel
silika. Sementara kolom Chiralcel ® OD dan Chiralcel ® OJ
mengandung selulosa yang dimodifikasi dengan tris (3,5-
dimethylphenylcarbate) dan tris (4-methylbenzoate), masing-masing pada
silika gel.
c. Analisis kromatografi
Agilent 1100 atau 1200 sistem HPLC seri (Agilent Technologies,
Santa Clara, CA) dengan detektor UV atau DAD yang dilengkapi dengan
ChromSword ® perangkat lunak pengembangan metode (Merck KGaA,
Darmstadt, Jerman) dan LC Spiderling line HPLC Column Selector
(Chiralizer Services, LLC , Newtown, PA) digunakan untuk
pengembangan metode dan / atau validasi metode. Bagian utama dari
fase
gerak adalah n -Hexane dan IPA. Beberapa pengubah organik (berbagai
alkohol) juga dievaluasi. Kinerja kromatografi dievaluasi dengan waktu
retensi (tR), selektivitas (α) , resolusi (Rs) dan puncak efisiensi (N) yang
dihitung oleh Chemstation atau Empower. Larutan referensi Afoxolaner
 (campuran rasemik) dan solusi enansiomer individu disiapkan di IPA.
Setiap solusi fase gerak disiapkan dengan pra-pencampuran jumlah yang
diperlukan dari n- Hexane / IPA dan pengubah organik (sesuai
kebutuhan).
4. Hasil
a. Optimasi kondisi kromatografi
Tujuan utama dari pekerjaan ini adalah untuk mengembangkan
metode HPLC Fase Normal yang cepat untuk memisahkan dan
mengkuantifikasi dua enansiomer dalam Afoxolaner (campuran rasemik).
Selama pekerjaan pengembangan metode, beberapa kolom HPLC kiral
berdasarkan selulosa dipilih berdasarkan struktur kimia dan lokasi pusat
kiral analit dan juga pada karakteristik fase kiral kolom analitis. Tiga
kolom yaitu Chiralcel ® OJ-3, Chiralcel ® OD-H dan Chiralpak ® AD-
3 dipilih dan disaring dengan menggunakan sistem fase gerak polaritas
rendah. Gambar 2 menunjukkan kromatogram berlebih menggunakan
kolom ini dengan fase gerak n -Heksan / IPA (95: 5, v / v). Selektivitas
dan resolusi kiral terbaik diperoleh pada kolom Chiralpak ® AD-3. Oleh
karena itu, kolom Chiralpak ® AD-3 dipilih untuk optimasi lebih lanjut.

Gambar 2. Kromatogram afoxolaner (0,1 mg / mL) pada berbagai kolom

HPLC kiral dengan fase gerak n-Hexane / IPA (95: 5, v / v); laju aliran:
0,8 mL / menit; panjang gelombang: 312 nm; suhu kolom: 35 ° C;
volume injeksi: 10 μL

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, pemisahan dua

enansiomer diperoleh menggunakan elusi isokratik dengan menggunakan
n- Hexane dan IPA dengan rasio 90:10 dan 95:5. Pemisahan yang lebih
baik dan cepat dicapai dengan n- Hexane / IPA (90:10, v / v). Untuk
optimalisasi fase gerak, efek dari berbagai pengubah organik seperti
metanol, etanol, 1-butanol, heksanol, t- butanol dan sikloheksanol
diselidiki. Fase gerak terakhir adalah n- Hexane / IPA / MeOH (89: 10: 1,
v / v / v). Tabel I merangkum kondisi kromatografi akhir. Metode
terakhir kemudian digunakan untuk analisis dari kedua Afoxolaner
(campuran rasemik) dan enansiomer 1 sampel.

Gambar 3. Kromatogram afoxolaner (0,8 mg / mL) pada kolom AD-3

dengan fase gerak yang berbeda; laju aliran: 0,8 mL / menit; panjang
gelombang: 312 nm; suhu kolom: 35 ° C; volume injeksi: 10 μL.

Tabel 1. Kondisi Kromatografi Akhir dari Metode

HPLC column  Chiralpak® AD-3 150 × 4.6 mm, 3 µm 

Mobile phase  n-Hexane/IPA/MeOH (89:10:1, v/v/v) 

Temperature  35°C 

Flow rate  0.8 mL/min 

Wavelength  312 nm 

Injection
volume  10 μl 

Afoxolaner  0.8 mg/mL 

Kromatogram khas dari afoxolaner (rasemik) dan "Enansiomer 1"

yang memiliki tingkat rendah "Enansiomer 2" sebagai pengotor
ditunjukkan masing-masing pada Gambar 4 dan 5. Gambar 4 adalah
kromatogram Afoxolaner (campuran rasemik) yang menunjukkan rasio
daerah puncak enansiomer 1 dan enansiomer 2 adalah 50:50. Kemudian
ditunjukkan pada Gambar 5 adalah kromatogram dari enansiomer 1
 diperoleh dengan menggunakan kondisi kromatografi akhir. Enansiomer
1 dan enansiomer 2 dipisahkan secara baik dengan R s 5,4. Persentase (%)
area puncak dari Enansiomer 1 dan Enansiomer 2 masing-masing adalah
99,63% dan 0,37%.

Gambar 4. Kromatogram khas 0,8 mg / mL rasemat afoxolaner

dianalisis menggunakan kondisi kromatografi akhir (Chiralpak®
AD-3 150 × 4,6 mm, 3 µm; fase gerak = n-Hexane / IPA / MeOH
(89: 10: 1, v / v) / v); laju aliran: 0,8 mL / menit; panjang
gelombang: 312 nm; suhu kolom: 35 ° C; volume injeksi: 10 μL).

Gambar 5. Kromatogram khas 0,4 mg / mL "Enantiomer 1" banyak

dianalisis menggunakan kondisi kromatografi akhir (Chiralpak® AD-3
150 × 4,6 mm, 3 µm; fase gerak = n-Hexane / IPA / MeOH (89: 10: 1,
v / v / v); laju aliran: 0,8 mL / menit; panjang gelombang: 312 nm; suhu
kolom: 35 ° C; volume injeksi: 10 μL).

b. Validasi metode
Untuk memastikan bahwa metode ini cocok untuk tujuan yang
dimaksudkan kunci karakteristik metode yaitu: spesifisitas, akurasi,
linearitas, presisi, DL (batas deteksi) dan QL (batas kuantisasi)
dievaluasi.
Hasil evaluasi ini diringkas dalam bagian di bawah ini. Persyaratan
kesesuaian sistem [baseline kosong: tidak ada puncak yang mengganggu
di atas level 0,1% pada waktu retensi dari dua penghantar afoxolaner,
0,2%
larutan standar memiliki rasio signal-to-noise (S / N) ≥1 0 untuk setiap
enansiomer; Kesepakatan persiapan solusi standar (≤ 2 .0%), faktor
resolusi (≥ 1 .2), perjanjian injektor (perbedaan antara dua suntikan ≤2 .
0%)] dipenuhi sebelum melakukan percobaan validasi metode.

1) Spesifikasi
Tidak ada perubahan signifikan yang mengganggu (area puncak
> 0,1%) diamati pada waktu retensi dari dua enansiomer dalam larutan
kosong. Selain itu, tidak ada bukti co-elusi tercatat menggunakan
analisis kemurnian puncak (kemurnian sudut kurang dari ambang
kemurnian menggunakan Empower Software) untuk dua enansiomer.
2) DL / QL evaluasi
DL dan QL metode dievaluasi menggunakan larutan standar
afoxolaner (rasemik) yang diencerkan. Perkiraan DL (S / N ~ 3)
adalah 0,06 μ g / mL (0,02%) untuk setiap enansiomer. Nilai QL
untuk metode ditetapkan (0,2 μ g / mL; 0,05%) sebagai S / N untuk "
Enansiomer 1 " dan " Enansiomer 2 " adalah 21 dan 15, masing-
masing. Hasil ini menunjukkan metode ini sensitif untuk deteksi dan
estimasi enansiomer afoxolaner.
3) Linearitas / akurasi
Dalam studi ini, " Enansiomer 1 " diperlakukan sebagai bahan
baku farmasi dan " Enansiomer 2 " diperlakukan sebagai pengotor.
Linearitas kedua enansiomer dievaluasi. Karena " Enansiomer 1 "
diperlakukan sebagai bahan baku farmasi, linearitasnya dievaluasi dari
0,2% hingga 125% dari konsentrasi nominal 0,4 mg / mL. Analisis
linier kuadrat terkecil dari data memberikan korelasi koefisien (r) dari
1.000. Y -intercept diperoleh adalah ≤ 0,5% dari level 100%
menunjukkan bahwa tidak ada bias signifikan untuk kuantitasi untuk
“enansiomer 1”. Metode ini dianggap akurat untuk “enansiomer 1”
karena sesuasi dengan presisi (lihat bagian presisi) metode Q2B ICH,
linearitas dan spesifisitas telah ditetapkan.
"Enansiomer 2" diperlakukan sebagai pengotor, kemudian
linearitas dan akurasi dipelajari bersama dengan menyiapkan
serangkaian larutan "Enansiomer 2" dengan konsentrasi 0,2%, 0,5%,
1,0%, 2,5% dan 5,0% dalam "Enansiomer 1" ( 0,4 mg / mL). Larutan
disiapkan dengan cara memacu Enansiomer 2 ke dalam larutan
“Enansiomer 1” (0,4 mg / mL) pada rasio yang dihitung. Pada setiap
level, injeksi duplikat dilakukan. Analisis linier kuadrat linier terkecil
dari data memberikan koefisien korelasi (r) dari 0,999. Y- intercept
diperoleh adalah ≤3 ,0% dari level 100% yang menunjukkan bahwa
 tidak ada bias signifikan untuk kuantisasi untuk " Enansiomer 2 ".
Metode ini terbukti linier dalam rentang penyelidikan. Akurasi dari
“enansiomer2” pada setiap tingkat juga dihitung dan hasilnya berkisar
antara 98% sampai 104% yang memenuhi persyaratan 70- 130%.
% RSD dari akurasi dari lima tingkat dalam studi linearitas /
akurasi dihitung dengan hasil 2% dan memenuhi kriteria dengan
syarat &RSD ≤ 10%. Hasil ini menunjukkan metode ini memenuhi
syarat validasi linearitas dan akurasi untuk "Enansiomer 1" (sebagai
bahan baku farmasi) dan "Enansiomer 2" (sebagai pengotor).
4) Presisi Ketelitian
Metode ketelitian dievaluasi dengan menganalisis enam larutan
Enansiomer 1 pada tingkat 100% (0.4mg / mL). Nilai kemurnian
enansiomer dihitung untuk setiap persiapan. Kemurnian enansiomer
rata-rata adalah 99,6% dan % RSD = 0,0% ( n = 6) sehingga
memenuhi kriteria % RSD ≤ 2%. Hasil ini menunjukkan bahwa
metode ini tepat untuk penentuan kemurnian enansiomer dari sampel
bahan baku farmasi.
5. Pembahasan
a. Kolom dan skrining fase gerak
Kolom HPLC polisakarida dipilih untuk pengembangan metode.
Karena fase diam kiral berbasis polisakarida tidak memiliki situs ionik,
mereka cocok untuk kromatografi senyawa netral seperti afoxolaner.
Selain itu, kolom berbasis polisakarida telah terbukti sangat berguna
dalam pemisahan spektrum rasemik yang luas dalam industri farmasi
karena keserbagunaan dan daya tahannya.
Kondisi kromatografi fase normal dipilih untuk metode ini. Karena
ikatan hidrogen, dipol - dipol dan π-π interaksi yang dianggap penting
untuk pengenalan kiral lebih efektif dalam kondisi fase normal. Di antara
sejumlah besar kolom berbasis polisakarida yang tersedia, Chiralcel ®
OD, Chiralpak ® AD dan Chiralcel ® OJ yang paling umum digunakan
untuk farmasi analisis. Oleh karena itu, ini dipilih untuk metode
pengembangan. Panjang gelombang deteksi 312 nm dipilih untuk analisis
karena afoxolaner memiliki λ maks di sekitar panjang gelombang ini
(Gambar 5 ).
 Gambar 5. Spektrum UV khas dari afoxolaner dalam n-
Heksan/IPA/MeOH (89:10:1, v / v / v).

Selain itu, pemilihan panjang gelombang yang lebih tinggi

meminimalkan gangguan potensial dari kontaminan pelarut umum /
reagen umum. Pada tahap awal pengembangan metode 0,1 mg / mL
referensi standar afoxolaner (campuran rasemik) digunakan. Untuk
meningkatkan sensitivitas metode, konsentrasi meningkat menjadi 0,8
mg / mL kemudian selama pengembangan metode. Kolom HPLC yang
digunakan adalah Chiralpak® AD-3 (150 × 4,6 mm, ukuran partikel 3
μm), Chiralcel® OD-H (150 × 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm) dan
Chiralcel® OJ-3 (150 × 4,6 mm, partikel ukuran 3 μm).
Untuk metode fase gerak isokratik lebih disukai daripada fase
gerak gradien karena ekuilibrium fase gerak lambat dalam kromatografi
fase normal. N-Hexane dan IPA dipilih sebagai komponen non-polar dan
polar, masing-masing karena mereka adalah kombinasi pelarut yang
paling umum digunakan dalam kromatografi fase normal dan ditemukan
sesuai untuk pemisahan afoxolaner. Analisis kromatografi dengan fase
gerak n-Hexane / IPA (95: 5, v / v) dan kolom Chiralcel® OJ-3
menunjukkan dua puncak luas sekitar 6 dan 37 menit. Dengan fase gerak
yang sama tidak ada pemisahan dua enansiomer pada kolom Chiralcel®
OD-H. Dengan menggunakan kombinasi fase gerak ini, pemisahan
terbaik dicapai pada kolom Chiralpak® AD-3 dengan faktor resolusi
(Rs) 6.0 dan selektivitas (α) 1,8 antara dua enansiomer (Gambar 1).
Namun, waktu retensi puncak “Enansiomer 1” dan “Enansiomer 2”
adalah ~ 17 dan 28 menit, masing-masing.
Untuk mengurangi waktu analisis, polaritas fase bergerak
digantung ke n-Hexane / IPA (90:10, v / v). Pada kolom Chiralpak®
AD-3, kolom dua puncak enansiomer terelusi pada 6 dan 8 menit,
masing-masing dengan resolusi 5,6 (lihat Gambar 2). Pada kolom
Chiralcel® OJ-3, dua puncak dielusi sekitar 22 dan 30 menit, secara
 khusus dengan Rs 1,6 dan selektivitas 1,4. Kedua puncak menunjukkan
peak tailing factor lebih besar dari 1,5. Tidak ada pemisahan yang
dicapai pada kolom Chiralcel® OD-H di bawah kondisi fase bergerak
ini.
Seperti yang telah dilaporkan dalam literatur perubahan dari satu
alkohol ke alkohol lain dapat mempengaruhi pemisahan kiral (termasuk
urutan elusi), alkohol selain IPA dipelajari juga dalam kombinasi dengan
IPA. Alkohol lain yang dievaluasi adalah metanol, etanol, n-propanol, 1-
butanol, 2-butanol, t-butanol, 3-Metil-1-butanol, Hexanol dan
sikloheksanol. Alkohol ini berbeda dalam hal polaritas mereka, panjang
rantai dan efek steril. Butanol yang berbeda dipelajari memiliki efek
steril yang bervariasi. Semua analisis dilakukan pada kolom Chiralpak®
AD-3 dengan larutan standar afoxolaner (0,8 mg / mL) dengan n-
hexane / alkohol (95: 5, v / v) sebagai fase gerak. Pemisahan parsial atau
tidak diperoleh untuk semua alkohol kecuali 3 Metil-1-butanol. Namun,
faktor selektivitas untuk 3-Metil-1- Butanol (α = 1,23) jauh lebih rendah
daripada IPA (α = 1,60). Berdasarkan eksperimen ini hanya IPA yang
dikerutkan lebih jauh sebagai komponen kutub dalam fase gerak.
b. Pengaruh pengubah pelarut organik
Pada kromatografi kiral fase normal, adalah umum untuk
menggunakan pengubah organik seperti asam atau alkohol untuk
meningkatkan selektivitas kolom HPLC. Penambahan asam organik
dalam fase gerak adalah untuk meminimalkan interaksi dengan residu
silanol untuk bentuk puncak dan resolusi yang lebih baik (20). Juga,
seperti yang dilaporkan dalam literatur penambahan sejumlah kecil
alkohol juga mempengaruhi selektivitas kolom. Berbagai alkohol
dievaluasi sebagai pengubah organik ke fase gerak. Pertama, n-Hexane /
IPA (90:10, v / v) telah dimodifikasi untuk memasukkan 1% metanol.
Penambahan metanol 1% meningkatkan baik resolusi dan selektivitas
dibandingkan dengan n-Hexane / IPA (90:10, v / v). Tampaknya jumlah
kecil metanol mengubah lingkungan steril di sekitar rongga kiral
sehingga mendukung diferensiasi lebih lanjut dari dua enansiomer.
Namun, penambahan lebih banyak metanol (hingga 3%) tidak
meningkatkan resolusi atau selektivitas (Tabel 2).
Tabel 2. Efek dari MeOH sebagai Modifikator Organik dalam
Fase Gerak menggunakan Kolom AD-3
 RT (min)

n- Enan Enan
Hexane IPA MeOH tiomer tiomer Resolution Selectivity
(%) (%) (%) 1 2 (Rs) (α)

90  10    6.1  8.3  5.9  1.36 

89  10  1  6.3  9.0  8.2  1.45 

87  10  3  5.6  7.4  7.0  1.3 

Selain metanol, beberapa alkohol lain juga dievaluasi sebagai pengubah

organik pada tingkat 1%. Ini adalah alkohol linier yang lebih panjang
seperti etanol, 1-butanol dan heksanol, alkohol bercabang seperti t-
butanol dan sikloheksanol dan diol (propilena glikol). Hasil evaluasi ini
dirangkum dalam Tabel 3. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, metanol
memberikan selektivitas terbaik. Jadi berdasarkan data n-Hexane / IPA /
MeOH (89: 10: 1, v / v / v) terpilih sebagai fase gerak untuk metode
terakhir.

Gambar 3. Efek dari Macam-Macam Alkohol sebagai Modifikator

Organik dalam Fase Gerak dengan Kolom AD-3

RT (min) 
n-
Hexa Enant Enant
ne IPA Organic iomer iomer Resolution Selectivity
(%)  (%)  modifier  1  2  (Rs)  (α) 

1%
89  10  MeOH  5.9  8.5  5.0  1.54 

1%
89  10  Ethanol  6.2  8.7  4.5  1.48 

89  10  1% 1- 6.0  8.2  4.2  1.46 

 RT (min) 
n-
Hexa Enant Enant
ne IPA Organic iomer iomer Resolution Selectivity
(%)  (%)  modifier  1  2  (Rs)  (α) 

Butanol 

1% 2-
89  10  Butanol  6.1  8.6  4.5  1.50 

1% t-
89  10  Butanol  6.3  9.0  4.5  1.50 

1%
89  10  Hexanol  6.0  8.3  4.1  1.45 

1%
Cyclohex
89  10  anol  5.8  7.8  4.1  1.42 

1%
Propylen
89  10  e Glycol  5.8  8.0  4.3  1.47 

c. Suhu kolom
Pengaruh suhu kolom pada pemisahan dua enansiomer dipelajari pada
25, 30, 35 dan 40 ° C. Pada suhu yang lebih rendah (25 ° C) pemisahan
yang lebih baik dicapai (Rs: 6.6) dibandingkan dengan suhu yang lebih
tinggi (35 ° C) (Rs: 5.0) dan 40 ° C (Rs: 4.2). Untuk metode HPLC kasar,
suhu kolom yang terkontrol dengan baik sangat penting. Idealnya, suhu
kolom harus setidaknya 10 ° C di atas atau di bawah suhu sekitar (~ 25 °
C) untuk kontrol suhu yang lebih baik. Suhu kolom yang diatur di sekitar
ambien sulit dikontrol dengan ketat karena fluktuasi lingkungan.
Selanjutnya, 40 ° C adalah suhu yang direkomendasikan tertinggi untuk
jenis kolom ini. Berdasarkan alasan-alasan ini suhu kolom 35 ° C dipilih
untuk metode terakhir.
d. Studi ketangguhan
ketangguhan metode ini ditunjukkan dengan menunjukkan kapasitas
metode tetap tidak terpengaruh ketika sengaja mengubah parameter
HPLC. Beberapa parameter kunci, termasuk % IPA dalam fase gerak,
 laju alir, panjang gelombang detektor, suhu dan volume injeksi bervariasi
di sekitar nilai prosedural. Resolusi dari dua enansiomer di bawah setiap
variasi parameter HPLC dinilai terhadap parameter prosedural. Kecuali
variasi % IPA dalam fase bergerak, semua parameter ketangguhan
metode lainnya dievaluasi menggunakan ChromSword AutoRobust,
perangkat lunak komputer yang menguji kengguhan metode dengan
intervensi analis minimal. Hasil ketangguhan metode dirangkum dalam
Tabel IV. Dalam semua kondisi bervariasi, dua enansiomer dipisahkan
dengan baik dengan faktor resolusi minimum 4 dan runtime <10 menit.
Ini menunjukkan metode yang kuat serta efisien dan cocok untuk analisis
tinggi di laboratorium QC.

Tabel 4. Ringkasan Hasil untuk Metode Robustness

Retention time (min) 

Enantiomer Enantiomer Resolution

Parameters  Variation  1  2  (Rs) 

Normal  None  6.2  8.6  4.4 

−2°C  6.3  8.8  4.7 

Column
Temperature  +2°C  6.1  8.3  4.2 

−0.1 (mL/min)  7.1  9.8  4.5 

Flow rate  +0.1 (mL/min)  5.5  7.6  4.4 

−2 µl  6.2  8.6  5.0 

Injection
volume  +2 µl  6.2  8.6  4.0 

Wavelength  −2 nm  6.3  8.8  4.7 

+2 nm  6.3  8.8  4.7 

 Retention time (min) 

Enantiomer Enantiomer Resolution

Parameters  Variation  1  2  (Rs) 

n-
Hexane/IPA/MeOH
(91:8:1, v/v/v)  6.8  9.3  4.5 

n-
Hexane/IPA/MeOH
%IPA  (87:12:1, v/v/v)  4.6  6.0  3.5 

6. Kesimpulan
Metode HPLC kiral baru berhasil dikembangkan dan divalidasi untuk
afoxolaner API. Metode telah terbukti linier, akurat, tepat, kuat dan sensitif.
Metode ini dapat digunakan untuk memverifikasi bahwa afoxolaner adalah
campuran rasemik seperti yang ditunjukkan oleh rotasi tertentu, serta untuk
menentukan kemurnian enansiomer dari sampel enansiomer tunggal. Metode
ini juga dianggap ramah QC karena kuat, menggunakan fase bergerak
isokratis dengan waktu elusi enansiomer dalam <10 menit, dan menggunakan
pelarut yang umum digunakan sebagai fase gerak.

7. Pustaka
Zhuang, J., Kumar, S., & Rustum, A. (2016). Development and validation of
a normal phase chiral HPLC method for analysis of afoxolaner using a
Chiralpak® AD-3 column. Journal of Chromatographic Science,
54(10), 1813–1819. https://doi.org/10.1093/chromsci/bmw162