Pembahasan Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis
molekuler. Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses ekstraksi DNA
tanaman adalah kehadiran senyawa kontaminan pada sampel yang diisolasi seperti
senyawa polisakarida, polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder
(Varma et al., 2007).
Menurut Fatchiyah et al. (2011), beberapa permasalahan yang sering muncul saat
ekstraksi DNA yaitu DNA patah-patah selama proses ekstraksi, DNA mengalami
degradasi akibat kehadiran enzim nuklease, adanya kontaminasi senyawa
polisakarida, dan ikut terisolasinya senyawa metabolit sekunder.

Pembahasan Polymerase Chain Reaction (PCR)

PRINSIP-PRINSIP UMUM PCR
PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan
pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA
templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian
didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer
menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA
digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini
dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product)
akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target
(long product) akan meningkat secara linier seperti tampak pada bagan di atas
(Newton and Graham, 1994).
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA;
sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan
enzim polimerase DNA
Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu:
(1) pra-denaturasi DNA templat
(2) denaturasi DNA templat
(3) penempelan primer pada templat (annealing)
(4) pemanjangan primer (extension)
(5) pemantapan (postextension).
Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada
setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA

Pembahasan Elektroforesis
Prinsip dan Teori Elektroforesis
Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan
untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam
nukleat, asam amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta
skala preparatif. keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi
yang lebih tinggi dari pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul
besar.(Andreas Manz, et.al, 2010)
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas
teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis free boundary,
elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008).
Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase
tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau anoda
sesuai dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu
ketidakhomogenen atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim
menunjukan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat
digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila
senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat
serkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free boundry dapat diatasi secara
parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum proses
elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan
memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian biarkan menyerap
vertikal pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradien
perbedaan kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis
dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi
oleh gradien kerapatan dan temperatur. Pada medium tersebut aliran cairan dalam
tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang
tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan
karena memiliki rongga-rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang paling sering
digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola.
Pemisahan dapat dilakuakan baik horizontal maupun vertikal dan interferensi anomali
paling kecil pada boundary. Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan
untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transfor fisik zat terlarut yang bermuatan
didalam medium kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar, 2008).

Gambar 1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al, 2010)