BAB 2.

METODE

2.1 Alat dan Bahan

2.1.1 Alat
a. Mikropipet dan Tip
b. Mikrotube/tabung sentrifugasi
c. Blender/homogenizer
d. QIA Shredder column
e. Sentrifugasi
f. RNAsy spin column
g. Cartidge
h. Rak tmikrotube
i. Tabung kolom RNA
2.1.2 Bahan
a. Sampel sel atau jaringan yang segar atau beku
b. Sampel rumput gandum (wheatgrass)
c. Etanol absolut (98%)
d. RNAse free water
e. Buffer RW1
f. Buffer RPE
g. Buffer RLT
h. Kit isolasi RNA
i. TRIzol reagent
j. Buffer elution
k. Chloroform
l. Etanol 70%
m. Wash buffer I dan II
2.2 Langkah Kerja
2.2.1 Isolasi RNA dari tumbuhan

Memindahkan 480 mikroliter buffer RLT kedalam 1.5 ml tabung

Memindahkan kira-kira 200 mikrograms sampel jaringan tanaman

kedalam tabung

Menghomogenkan sample di dalam tabung menggunakan blender

bermotor atau homogenizer

Menambahkan QIA shadder column yang berwarna ungu sebagai

sistem penghancur, terdiri dari dua bagian yaitu bagian atas berwarna
ungu dan berisi kartrid dan bagian bawah yang pada dasarnya adalah
koleksi untuk mentransfer potongan itu ke sampul atas

Memindahkan lysat sel ke kolom atas

Melakukan sentrifugasi pada 12000 xg selama 1 menit pada suhu

25°C

Menambahkan etanol absolut (98%) dengan volume sama kedalam

tabung sentrifugasi dan mencampurnya dengan pipet

Menyiapkan RNEasy spin column yang terdiri dai dua bagian yaitu
bagian bawah adalah tabung pengumpul dan bagian atas adalah
membran yang mengandung elemen. Kemudian memindahkan hasil
sentrifugasi kedalam kolom

Melakukan sentrifugasi pada 13000 xg selama 15 detik

Membuang tabung koleksi bagian bawah dan memindahkan bagian

atas ke tabung koleksi baru
Memindahkan 500 mikroliter larutan buffer RW1 kadalam kolom
tabung bagian atas dan melakukan sentrifugasi pada 13000 xg
selama 15 detik
Mengulangi langkah tersebut menggunakan tabung koleksi baru
pada setiap tahapan untuk mencegah kontaminasi
 Memindahkan 500 mikroliter larutan buffer RPE (mengandung etanol)

Melakukan sentrifugasi pada 13000 xg dan dapat diulangi dua kali

Melakukan pengeringan kolom untuk menghilangkan sisa kelembababn

atau alkohol yang dapat mengganggu proses hilir RNA yang dilakukan
dengan memindahkan colum ke tabung koleksi baru

Memindahkan tabung kolom pink pada tabung koleksi baru dan melakukan
sentrifugasi pada 13000 xg selama 2 menit

Memindahkan kolom pink ke tabung koleksi 1,5 ml baru dan steril

Menambahkan 50 mikroliter RNAse bebas air ke bagian engah kolom

(rehidrasi dapat dilakukan menggunakan RNAse bebas air yang terdapat
dalam kit)

Membiarkan kolom selama 2 menit pada rak sebagai tahap inkubasi

Melakukan sentrifugasi pada 13000 xg selaam 1 menit

RNA sekarang siap untuk kuantifikasi dan proses hilir seperti Transkripsi
Terbalik menjadi cDNA

RNA tercakup dalam tabung koleksi, pemrosesan hilir RNA melibatkan

pengujian kualitas menggunakan spektrofotometer diikuti dengan sintesisi
cDNA untuk sekunsing
2.2.2 Isolasi DNA dari Mamalia
 Menyiapkan sampel dapat dimulai dengan 50 hingga 100 mikrogram
jaringan segar atau beku. ukuran sampel dapat mencapai 200mg atau 5x 10
sel, lihat manual produk online untuk detailnya

Menambahkan reagent TRIzol sebanyak 1 ml

Melakukan homogenisasi secara menyeluruh menggunakan jaringan
atau homogenizer stator rator, dan membiarkan sampel pada suhu
kamar selama 5 menit

Menambahkan 2 ml kloroform dan mengkocok tabung dengan kuat

selama sekitar 15 detik

Mendiamkan tabung selama 2-3 menit pada suhu kamar

Melakukan sentrifugasi pada 12000 xg selama 15 detik pada suhu

4°C. kemudian akan terlihat tiga lapisan berbeda didalam tabung,
lapisan atas yang tidak berwarna berisi RNA

Memindahkan larutan paa lapisan atas ke tabung bebas RNAse dan

menambahkan volume yang sama dari campuran etanol 70% dengan
baik menggunakan vortex

Menjalankan larutan RNA terisolasi (isolasi RNA) melalui kolom

membran silika tautan murni yang disediakan dalam kit untuk
memebersihkan kontaminan (mengulangi tahap ini sampai dapat
memindahkan seluruh sampel kedalam kolom)

Memindahkan 700 mikroliter sampel ke kolom yang telah

dimasukkan kedalam tabung koleksi 2 ml

Melakukan sentrifugasi pada 12000 xg selama 15 detik

Mencuci RNA dengan menambahkan 700 mikroliter wash buffer I

dan mesentrifugasi pada 12000 xg selama 15 detik. Membuang aliran
dan tabung pengumpul dengan kolom membran silika dalam tabung
pengumpul baru

Menambahkan 500 mikroliter larutan wash buffer II dan sentrifugasi

pada 12000 xg selama 15 detik. Membuang aliran dan ulangi.

Mengeringkan membran silika dengan mensentrifugasi kolom pada

12000 xg selama 1 menit

Membuang tabung koleksi untuk meng-elusi RNA dari membran

silika, dan memasukkan kolom ke tabung pemulihan

Menambahkan volme buffer elusi yang sesuai berdasarkan pada

jumlah awal, dan menginkubasi pada suhu kamar selama 1 menit

Mesentrifugasi kolom pada tabung pemulihan pada 12000 xg selama

2 menit, RNA ultra murni siap digunakan atau disimpan pada -20°C.