ARTIKEL PENELITIAN

Produksi Direkayasa Asam Lemak Rantai Pendek pada PT Escherichia

coli Menggunakan Jalur Sintesis Asam Lemak

Kamran Jawed 1, Anu Jose Mattam 1, Zia Fatma 1, SaimaWajid 2, Malik Z. Abdin 2, Syed Shams Yazdani 1,3 *

1 Grup Teknik Mikroba, Pusat Internasional untuk Rekayasa Genetik dan Bioteknologi, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi, India, 2 Departemen
Bioteknologi, Jamia Hamdard, Hamdard Nagar, New Delhi, India, 3 DBT-ICGEB Center for Advanced Bioenergy Research, International Center for
Genetic Engineering and Biotechnology, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi, India

* shams@icgeb.res.in
a11111

Abstrak
Asam lemak rantai pendek (SCFA), seperti asam butirat, memiliki berbagai aplikasi dalam industri kimia dan bahan bakar.

AKSES TERBUKA
Kutipan: Jawed K, Mattam AJ, Fatma Z, Wajid S, Abdin MZ, Yazdani
SS (2016) Direkayasa Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di Escherichia
coli Menggunakan Jalur Sintesis Asam Lemak. PLoS ONE 11 (7):
e0160035. doi: 10.1371 / journal.pone.0160035
Permintaan bahan bakar dan bahan kimia berkelanjutan di seluruh dunia telah mendorong para peneliti untuk sintesis
mikroba SCFA. Dalam studi ini kami membandingkan tiga tioesterase, yaitu TesAT dari Anaerococcus tetradius, TesBF dari Bryantella
formatexigens dan TesBT dari Bacteroides thetaiotaomicron, untuk produksi SCFA di Escherichia coli memanfaatkan jalur
sintesis asam lemak asli (FASII) dan memodulasi parameter genetik dan bioproses untuk meningkatkan hasil dan
produktivitasnya. E. coli ketegangan mengekspresikan tesBT

gen menghasilkan titer asam butirat maksimum pada 1,46 g L- 1, diikuti oleh tesBF pada 0,85 g L- 1 dan
Editor: Patrick C. Cirino, Universitas Houston, AMERIKA

SERIKAT tesAT pada 0,12 g L- 1. Titer asam butirat bervariasi secara signifikan tergantung pada nomor salinan plasmid dan genotipe

regangan. Modulasi faktor genetik yang diketahui mempengaruhi produksi asam lemak rantai panjang, seperti penghapusan
Diterima: 20 April 2016
asam lemak iseng dan luntur yang memulai siklus degradasi asam lemak dan ekspresi berlebih fadR yang merupakan
Diterima: 12 Juli 2016
aktivator transkripsi global biosintesis asam lemak dan penekan siklus degradasi, tidak meningkatkan titer asam butirat
Dipublikasikan: 28 Juli 2016
secara signifikan. Penggunaan penghambat kimiawi cerulenin, yang membatasi siklus pemanjangan asam lemak,

Hak cipta: © 2016 Jawed dkk. Ini adalah artikel akses terbuka meningkatkan titer asam butirat sebesar 1,7 kali lipat dalam kasus TesBF, sementara itu berdampak buruk pada kasus
yang didistribusikan di bawah persyaratan
TesBT. In vitro uji enzim menunjukkan bahwa cerulenin juga menghambat tioesterase spesifik rantai pendek, meskipun
Lisensi Atribusi Creative Commons , yang mengizinkan penggunaan,
konsentrasi hambat bervariasi sesuai dengan jenis tioesterase yang digunakan. Optimalisasi proses lebih lanjut diikuti
distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, dengan

mencantumkan nama penulis dan sumber aslinya. dengan budidaya batch pakan dalam kondisi terbatas fosfor menghasilkan produksi 14,3 g L- 1 asam butirat dan

Pernyataan Ketersediaan Data: Semua data yang relevan ada di dalam

kertas dan file Informasi Pendukungnya. 17,5 g L- 1 total asam lemak bebas pada 28% dari hasil teoritis. Studi ini memperluas pemahaman kami tentang

Pendanaan: Pekerjaan ini didukung oleh Departemen Bioteknologi (DBT), produksi SCFA di E. coli melalui jalur FASII dan menyoroti peran genetik dan optimalisasi proses untuk meningkatkan
Pemerintah India ( http: // www. dbtindia.nic.in ) melalui hibah Pusat produk yang diinginkan.
Bioenergi no. BT / PB / Center / 03/2011 kepada SSY. Pemberi dana tidak

memiliki peran dalam desain studi, pengumpulan dan analisis data,

keputusan untuk menerbitkan, atau persiapan naskah.

Minat Bersaing: Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada

kepentingan yang bersaing.

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 1/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

pengantar
Asam lemak rantai pendek (SCFA), seperti asam butirat (C4), merupakan perantara yang menjanjikan dari banyak molekul
kimia dan biofuel. Misalnya, asam butirat adalah prekursor alkohol lemak rantai pendek seperti butanol, yang lebih unggul dari
etanol dalam hal kepadatan energi, tekanan uap, dan higroskopisitas, dan merupakan pengganti langsung bensin [ 1 , 2 ].
Alkana rantai pendek seperti propana, dengan sifat fisikokimia yang sangat disukai sebagai bahan bakar dan komponen
utama gas minyak cair telah diproduksi di E. coli melalui asam butirat sebagai perantara [ 3 , 4 ]. Alkil ester lemak rantai pendek
(SCFAEs), juga dikenal sebagai ester yang mudah menguap, diproduksi dengan esterifikasi asam rantai pendek dan alkohol,
terjadi secara alami di banyak buah dan bunga yang matang dan memiliki aplikasi luas dalam rasa, wewangian, kosmetik,
pelarut, cat dan pelapis industri [ 5 - 7 ]. Selain itu, asam butirat juga memiliki aplikasi terapeutik karena turunannya digunakan
untuk pengobatan penyakit seperti kanker, anemia sel sabit dan alopecia [ 5 , 8 , 9 ].

Saat ini asam butirat diproduksi dalam skala industri dengan sintesis kimiawi dari minyak mentah yang melibatkan oksidasi
butirraldehida. Itu juga dapat diekstraksi dari mentega karena konsentrasinya dalam mentega berkisar dari 2% hingga 4%.
Namun, cara kimia untuk menghasilkan asam butirat ini mahal dan tidak ramah lingkungan [ 5 , 9 , 10 ]. Oleh karena itu, diperlukan
produksi asam butirat dari sumber karbon terbarukan menggunakan platform mikroba untuk menggantikan sintesis kimianya.

Produksi asam butirat dengan fermentasi mikroba telah diteliti dengan mikroba penghasil asli seperti Clostridium
tyrobutyricum, C. beijerinckii, dan C. thermobutyricum
[ 11 ]. Namun, mikroba ini benar-benar anaerobik dan pembentukan spora di alam, dan kemampuannya untuk menghasilkan asam
butirat dalam kondisi tertentu, seperti jendela dengan pH sempit, konsentrasi ATP tinggi, rasio NADH / NAD + rendah, dll.,
Menuntut pengembangan platform serbaguna lainnya [ 8 ].

E. coli sebagai pekerja keras industri untuk produksi banyak bahan kimia berbasis bio menjadi pilihan alami. Sejak E. coli tidak secara

alami menghasilkan asam butirat, seseorang dapat mentransfer jalur fermentasi lengkap dari anaerob ke E. coli dan dengan demikian

membatasi pertumbuhannya ke kondisi anaerobik, atau mengeksploitasi siklus sintesis asam lemak yang aktif secara aerobik ( Gambar

1 ). Teknik E. coli jalur biosintesis asam lemak (FASII) merupakan cara yang menjanjikan untuk menghasilkan bahan bakar dan bahan

kimia yang diturunkan dari asam lemak [ 12 ]. Kemajuan yang signifikan telah dibuat dalam rekayasa jalur ini untuk produksi FFA rantai

menengah dan panjang. Misalnya, FFA rantai menengah C12 dan C14 diproduksi secara endogen oleh BTE tioesterase yang

diekspresikan secara heterologis dari Umbellularia californica di E. coli [ 13 ] dan konversi selanjutnya menjadi alkohol yang sesuai juga

telah dilaporkan [ 14 ]. E. coli strain yang membawa gen thioesterase dari Ricinus communis dan Jatropha curcas

terakumulasi lebih dari 2.0 g L- 1 FFA dengan panjang rantai C14, C16: 1 dan C16 selama fermentasi 48 jam [ 11 ]. Sampai
saat ini, perhatian yang diberikan untuk memproduksi SCFA jauh lebih sedikit E. coli melalui jalur FASII [ 15 , 16 ]. Titer
maksimum ~ 0,44 g L- 1 untuk asam butirat telah dicapai sejauh ini melalui jalur ini [ 3 ]. Terdapat laporan produksi SCFA tak
jenuh yaitu asam butenoat, menggunakan jalur FASII dengan titer 4 g L- 1 setelah 48 jam fermentasi kelompok pakan [ 16 ]
dan melalui pembalikan β- jalur oksidasi 500 mg L- 1 Asam 3-ketobutirat, 150 mg L- 1 3-hidroksibutirat dan 200 mg L- 1 asam
trans-2-butenoat telah dilaporkan [ 17 ]. Ada juga upaya untuk mengimpor jalur fermentatif dari Clostridium sp menjadi E. coli dalam
bentuk perancah gen sintetis, yang menghasilkan produksi 7,2 g L- 1 asam butirat di bawah fermentasi batch makan [ 2 ].
Dalam kasus kedua, bukan thioesterase, kata penulis atoDA untuk mengubah asetat dan butiril-KoA menjadi butirat dan
asetil-KoA dan mencapai 10 g L- 1 dari asam butirat; Namun 8 g L- 1 asam asetat telah ditambahkan dalam umpan glukosa
untuk mencapai titer ini [ 10 ].

Baru-baru ini, Jing et al. [ 18 ] menganalisis beberapa tioesterase dari organisme yang berbeda dan menunjukkan kemampuannya untuk

menghasilkan asam lemak dengan panjang rantai yang berbeda. Kami memilih tiga tioesterase, yaitu TesAT dari Anaerococcus tetradius, TesBT

dari Bacteroides thetaiotaomicron dan TesBF dari Bryantella formatexigens, untuk kemampuannya menghasilkan asam lemak rantai

pendek,

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 2/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Gambar 1. Representasi skematis dari berbagai strategi yang diadopsi untuk insinyur E. coli untuk produksi asam butirat. Sintesis asam lemak dan siklus degradasi masing-masing telah digambarkan
dengan panah biru dan oranye. Protein pengatur telah ditampilkan dalam kotak bertitik dalam warna hijau dan merah yang masing-masing menunjukkan aktivasi dan represi. Gen yang diekspresikan secara
berlebihan dalam penelitian ini ditandai dengan panah ke atas berwarna hijau, sedangkan gen yang telah dihapus ditunjukkan dengan tanda silang merah. Singkatan: TesAT - thioesterase dari Anaerococcus
tetradius; TesBT -
thioesterase dari Bacteroides thetaiotaomicron; TesBF - thioesterase dari Bryantella formatexigens; Acc * - asetil-KoA karboksilase dari
Corynebacterium glutamicum; FabD - malonyl CoA-ACP transacylase; FabH - β- ketoasil-ACP sintase III; FabG - β- ketoasil-ACP reduktase; FabA dan FabZ - β- hidroksiasil-ACP dehydratase; FabI - reduktase
enoyl-ACP; FabB - β- ketoasil-ACP sintase I; FadD - lemak asil-CoA sintetase; Luntur - asil KoA dehidrogenase; FabR - penekan transkripsi dari FASII; FadR - peningkat transkripsional FASII dan penekan β-

oksidasi.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g001

mengekspresikan mereka secara berlebihan E. coli dan menganalisis peran jalur sintesis asam lemak inang dan jaringan pengaturannya

dalam produksi asam butirat. Kami selanjutnya melakukan optimasi proses dan menunjukkan tingkat titer asam butirat tertinggi dari 14,3 g L- 1

dilaporkan oleh direkayasa E. coli sejauh ini dengan budidaya kelompok pakan.

Bahan dan metode

Strain mikroba, reagen dan media

E. coli strain yang digunakan dalam penelitian ini telah terdaftar di Tabel 1 . E. coli DH5 α digunakan sebagai host untuk kloning

molekuler. Penghapusan gen dalam inang produksi dicapai melalui fag P1

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 3/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Tabel 1. Strain, plasmid dan primer yang digunakan dalam penelitian ini.

Nama Deskripsi Referensi

E. coli Strain

MG1655 F-, λ-, rph-1 CGSC # 6300

JM109 endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB + Δ ( lac-proAB) e14- [F 'traD36 proAB + lacIq lacZ Δ M15] hsdR17 (rK-mK +) F- Promega

E. coli B CGSC # 2507

DH5 α F- Φ 80lacZ Δ M15 Δ ( lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 F- thi lac mtl, pREP4 Invitrogen

M15 plasmid Qiagen

BW25113 rrnB DElacZ4787 HsdR514 DE (araBAD) 567DE (rhaBAD) 568 rph-1 F- ompT gal dcm lon CGSC # 7636

BL21 (DE3) hsdSB (rB - mB -) λ ( DE3) MG1655, Δ iseng :: FRT-kan-FRT Invitrogen

MG1655 Δ iseng Pelajaran ini

MG1655 Δ luntur MG1655, Δ luntur:: FRT-kan-FRT Pelajaran ini

MG1655 Δ iseng Δ luntur MG1655, Δ iseng Δ luntur:: FRT-kan-FRT MG1655, Δ fabR Pelajaran ini

MG1655 Δ fabR :: FRT-kan-FRT Pelajaran ini

Plasmid

pQE30 ColE1 ori T5 Lac O Amp r Invitrogen

pZA31 MCS p15A ori PLtetO-1 Cm r Expressys

pZS21 MCS pSC101 ori PLtetO-1 Kan r Expressys

pCP20 bla, fl p, pUC57 replika bersyarat suhu menyimpan tesAT CGSC # 7629

pUC-tesAT Pelajaran ini

pUC-tesBT pUC57 menyembunyikan tesBT Pelajaran ini

pUC-tesBF pUC57 menyembunyikan tesBF Pelajaran ini

pUC-acc pUC57 menyembunyikan acc Pelajaran ini

pQE-tesAT pQE30 menyembunyikan tesAT Pelajaran ini

pQE-tesBT pQE30 menyembunyikan tesBT Pelajaran ini

pQE-tesBF pQE30 menyembunyikan tesBF Pelajaran ini

pZA-tesAT pZA31 menyembunyikan tesAT Pelajaran ini

pZA-tesBT pZA31 menyembunyikan tesBT Pelajaran ini

pZA-tesBF pZA31 menyembunyikan tesBF Pelajaran ini

pZS-tesAT pZS21 menyembunyikan tesAT Pelajaran ini

pZS-tesBT pZS21 menyembunyikan tesBT Pelajaran ini

pZS-tesBF pZS21 menyembunyikan tesBF Pelajaran ini

pZS-fadR pZS21 menyembunyikan fadR Pelajaran ini

pZS-fabZ pZS21 menyembunyikan fabZ Pelajaran ini

pZS-fadR-fabZ pZS21 menyembunyikan fadR dan fabZ Pelajaran ini

pZS-acc pZS21 menyembunyikan acc Pelajaran ini

Primer

fadR_ salI_F GATA GTCGAC AAAGAGGAGAAATTAACTATGGTCATTAAGGCGCAAAGC Pelajaran ini

fadR_ claI_R AGCT ATCGAT TTAGTGATGGTGATGGTGATGTCGCCCCTGAATGGCTAAATC Pelajaran ini

fabZ_ claI_F AGCT ATCGAT AAAGAGGAGAAATTAACTATGTTGACTACTAACACTCATACTCTGC GCA AAGCTT TCAGTGATGGTGATGGTGATGGGCCTCCCGGCTACG Pelajaran ini

fabZ_ HindIII_R Pelajaran ini

phage_ fabR_ F CGTTCATTCACAATACTGGA Pelajaran ini

phage_ fabR_ R TACCTCTATCTTGATTTGCTT Pelajaran ini

Phage_ fadD_ F CGCATTTTAGAGGTGAAGAA Pelajaran ini

Phage_ fadD_ R GTCTGACGACTGACTTAAC Pelajaran ini

Phage_ luntur_ F ACAAGTAAGGGGCTTTTCG Pelajaran ini

Phage_ luntur_ R GCCTTTCGGCTCCGTTATTC Pelajaran ini

Catatan: situs enzim digarisbawahi dan daerah homolog dicetak miring.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.t001

metode transduksi [ 19 , 20 ] menggunakan strain knockout gen tunggal dari Coli Genetic Stock Center (CGSC), Universitas Yale,
AS. Gen penanda resisten kanamisin telah dihilangkan dengan plasmid pembantu pCP20 yang mengekspresikan flippase (FLP)
dan strain yang dihasilkan digunakan untuk

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 4/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

putaran sekuensial knockout gen. Penghapusan dikonfirmasi melalui PCR menggunakan primer menuju daerah mengapit gen,

seperti yang disebutkan dalam Tabel 1 .

Semua reagen kimia dibeli dari Sigma Aldrich, Hichem Pvt. Ltd. Ltd dan TCI Chemicals (India) Pvt. Ltd. Kit dan
enzim yang digunakan untuk tujuan biologi molekuler dan sumbernya adalah sebagai berikut: kit isolasi DNA
genomik (Qiagen), kit miniprep plasmid (Himedia), PCR dan kit pemurnian gel (Genetix), Phusion DNA polymerase
(Finnzymes), Taq DNA polimerase (Himedia Pvt Ltd), dNTPs (Fermentas, USA), enzim restriksi dan T4 DNA ligase
(New England Biolab).

Konstruksi plasmid dan regangan

Gen untuk tioesterase dari A. tetradius ( TesAT), B. thetaiotaomicron ( TesBT) dan B. formatexigens ( TesBF) dan asetil CoA
karboksilase (Acc) dari Corynebacterium glutamicum adalah kodon yang dioptimalkan bersama dengan C-terminal 6xHis-tag,
disintesis secara komersial dan dikloning dalam vektor pUC57 oleh Genscript, USA untuk mendapatkan pUC-tesAT, pUC-tesBT,
pUC-tesBF dan pUC-acc plasmid, masing-masing. Untuk membangun plasmid pQE-tesAT / pQE-tesBT / pQE-tesBF, pZA-tesAT /
pZA-tesBT / pZA-tesBF, dan pZS-tesAT / pZS-tesBT / pZS-tesBF, gen-gen thioesterase dari pUCtesAT / pUC-tesBT / pUC-tesBF
dicerna dengan Kpn SAYA/ Sal I dan subklon di situs restriksi yang sesuai di pQE30, pZA31MCS dan pZS21MCS plasmid,
masing-masing. Demikian pula, gen kodon yang dioptimalkan dari asetil KoA karboksilase (Acc) dari C. glutamicum disubklon ke
dalam pZS21MCS di Kpn SAYA/ Cla Saya situs untuk mendapatkan plasmid pZS-acc.

Untuk konstruksi plasmid pZS-fabZ dan pZS-fadR, file fabZ dan fadR gen diamplifikasi dari E. coli Genom MG1655
menggunakan set primer fadR_ salI_F / fadR_ salI_R dan fabZ_ claI_F /
fabZ_ claI_R dan digandakan pada Sal SAYA/ Cla saya dan Cla SAYA/ Belakang III situs restriksi di pZS21MCS plasmid, masing-masing ( Tabel

1 ). Untuk membuat plasmid pZS-fadR-fabZ, fabZ gen diperkuat menggunakan set primer fabZ_ claI_F / fabZ_ claI_R telah dikloning di

pZS-fadR di Cla saya dan Belakang III situs pembatasan.

Kondisi budaya
Untuk budidaya volume kecil, masing-masing strain diinokulasi dari koloni tunggal yang baru ditransformasikan pada cawan
agar LB ke dalam media 5 mL LB yang mengandung antibiotik μ g mL- 1

ampisilin, 30 μ g mL- 1 kanamycin atau 34 μ g mL- 1 Kloramfenikol untuk sel yang masing-masing mengandung plasmid berbasis
pQE30, pZS21MCS atau pZA31MCS) dalam tabung kultur dan ditanam semalaman. 1% dari kultur benih ini digunakan untuk
menginokulasi 3 mL kaldu hebat (TB) ditambah dengan 8 g L- 1 glukosa dan antibiotik yang sesuai dalam tabung kultur. Kultur
diinduksi dengan 0,1 mM IPTG dalam kasus pQE30 dan 100 ng mL- 1 anhydrotetracycline dalam kasus pZS21MCS dan

sistem ekspresi pZA31MCSketika OD 600 mencapai ~ 0,4 dan dibiarkan tumbuh selama 72 jam tambahan pada 37 ° C dan
180 rpm. Sel kemudian dipanen dan digunakan untuk menganalisis butirat
produksi asam.
Produksi asam butirat pada media yang berbeda ditentukan dengan menumbuhkan galur rekayasa dalam media 5
mL LB untuk semalaman sebagai kultur benih, 1% di antaranya digunakan untuk menginokulasi media berbeda yang
memiliki 8 g L- 1 glukosa dan antibiotik yang sesuai. Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) minimal medium [ 21 ]
dilengkapi dengan 8 g L- 1 glukosa, 1,32 mM kalium fosfat dibasa, 0,276 mM kalium sulfat, dan 9,5 mM amonium klorida
digunakan dengan variasi tergantung pada batasan nutrisi. Untuk pembatasan nitrogen dan fosfor, jumlah amonium
klorida dan kalium fosfat dibasa dalam medium adalah 4,75 mM dan

0,240 mM, masing-masing [ 22 ]. Media M9 dan M9-MOPS disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 23 ,

24 ]

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 5/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Analisis Western blot

Tingkat ekspresi gen thioesterase yang diklon dalam berbagai plasmid dikonfirmasi dengan Western blotting.
Singkatnya, kultur ditanam dan diinduksi dengan induser yang sesuai di
OD 600 ~ 0,4 dan dipanen setelah 4 jam setelah induksi. Setelah sonikasi, lisat sel larut dan pellet yang
diperoleh dipisahkan pada gel poliakrilamida 12,5%. Protein adalah trans-
difermentasi ke membran nitroselulosa (0,2 μ m, Amersham Protran, GE Healthcare Life Sciences), diperiksa dengan anti - penta-antibo
nya (H1029, Sigma) diikuti oleh antibodi IgG anti-tikus terkonjugasi HRP (A4416, Sigma). Perkembangan warna pita protein
pada noda dilakukan dengan menggunakan DAB (3, 3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride) dan hidrogen peroksida.

Analisis HPLC
HPLC digunakan untuk mengukur glukosa, asam asetat, asam laktat, asam suksinat, asam butirat, asam butenoat dan
etanol. Kultur (1 ml) E. coli regangan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit dan supernatan disaring melalui
0,22- μ m filter jarum suntik. Sampel yang diklarifikasi diaplikasikan pada sistem HPLC Seri Infinity (Agilent) HPLC 1260
yang dilengkapi dengan kolom penukar anion Aminex HPX87H (Bio-Rad) dan indeks bias (RI). Disaring dan

degassed 4 mMH 2 BEGITU 4 digunakan sebagai fase gerak pada laju aliran 0,3 mL menit 1. Suhu kolom
dipertahankan pada 40 ° C di ruang termostat. Konsentrasi metabolit
secara kuantitatif ditentukan oleh kurva kalibrasi yang dibuat menggunakan standar yang diperoleh dari Absolute
Standards, AS. Semua hasil disajikan sebagai rata-rata dan deviasi standar data dari dua percobaan independen.

Identifikasi dan kuantifikasi asam lemak bebas

Asam lemak bebas (FFA) dianalisis seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 15 ]. Singkatnya, 0,4 mL supernatan kultur dilengkapi

dengan 50 μ L dari 10% (w / v) NaCl dan 4 μ L campuran 10 mg / mL masing-masing asam lemak C5, C11 dan C17 sebagai standar

internal. Larutan selanjutnya diasamkan dengan 50 μ L asam asetat glasial diikuti penambahan 200 μ L dari etil asetat. Campuran

disentrifugasi pada 16.000 g selama 10 menit dan diesterifikasi dengan etanol dengan menambahkan 900 μ L dari campuran etanol

30: 1 dan 37% (v / v) HCl sampai 100 μ L dari fase organik, dan diinkubasi pada suhu 55 ° C selama 1

hr. Lemak asil etil ester diekstraksi dengan menambahkan 500 μ L dH 2 O dan 500 μ L hexane dan vortexing selama 20 detik. Ekstrak

lapisan heksana atas (300 μ L) dianalisis dengan GC-MS / MS secara lengkap

mode pemindaian menggunakan Agilent 7890 GC dengan sistem Agilent 7000 Triple Quadrupole GC / MS. Kolom yang

digunakan adalah Zebron ZB-5MS (panjang: 30 m; diameter 0,25 mm; tebal film:

0.25 μ m) dan metode termasuk volume injeksi sebagai 1 μ L tanpa mode split dan suhu oven dinaikkan dari 40 menjadi 325 ° C (ramp

awal pada kecepatan 5 ° C per menit dari 40 menjadi 75 ° C dan kemudian 10 ° C per menit hingga 325 ° C) dan total waktu pengerjaan

adalah 41 menit Identitas senyawa ditentukan melalui waktu retensi GC dari standar yang diketahui (campuran FAEES dari Sigma

Aldrich) dan diverifikasi dengan spektrum massa menggunakan perpustakaan NIST.

Uji enzim
Aktivitas thioesterase diukur secara spektrofotometri menggunakan metode yang dilaporkan sebelumnya [ 25 ] dengan
sedikit modifikasi. Campuran reaksi untuk tioesterase mengandung 60 mM buffer kalium fosfat (pH 7,4), 100 μ M
5,5'-dithiobis- (asam 2-nitrobenzoic) (DTNB), 0,08 mg albumin serum sapi, 20 μ M butyryl-CoA, dan enzim kasar dari
ekstrak sel. Reaksi diawali dengan penambahan enzim. Pengurangan DTNB oleh CoA yang dibebaskan dalam reaksi
tioesterase diukur pada 412 nm menggunakan spektrofotometer Ultraspec 3100 pro (Amersham Biosciences). Satu
unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalis

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 6/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

pembelahan 1 nmol asil-KoA per menit dalam kondisi di atas. Koefisien kepunahan molar dari DTNB tereduksi
dianggap sebagai 13.600 M- 1 cm- 1.

Budidaya batch
Budidaya batch dilakukan dalam bioreaktor berpengaduk 0,5 L (Sartorius BIOSTAT 1 Qplus). Koloni tunggal yang baru
ditransformasi ditanam semalaman dalam media 5 mL LB dengan 34 μ g mL- 1

kloramfenikol pada 37 ° C dan 180 rpm. Kultur sekunder disiapkan dengan menginokulasi 1% kultur primer ke 30
mL media TB yang dilengkapi dengan 8 g L- 1 glukosa dan 34 μ g mL- 1

kloramfenikol dan ditanam pada suhu 37 ° C sampai OD 600 mencapai 2 - 3. Kultur sekunder yang telah ditumbuhkan
diinokulasi dalam bioreaktor dengan volume kerja 350 mL media TB beserta 8 g
L- 1 glukosa, 100 ng mL- 1 anhydrotetracycline dan 34 μ g mL- 1 kloramfenikol. Untuk mengidentifikasi kondisi aerasi yang
optimal, oksigen terlarut (DO) dipertahankan pada saturasi 5, 20, 40 dan 60% dan pH dipertahankan pada 7 melalui
penambahan 2N NaOH melalui pengontrol PID (proporsional, integral dan turunan). Sampel dikumpulkan secara berkala
untuk menganalisis pertumbuhan dan produksi metabolit.

Budidaya kelompok makan

Untuk budidaya fed-batch, sel ditanam dalam 0,5 L bioreaktor yang diaduk seperti dijelaskan di atas. Reaktor dioperasikan dalam

mode batch selama 3 jam, diikuti dengan pemberian pakan yang mengandung 20% ekstrak ragi dan 50% glukosa yang diinisiasi

dan laju umpan dipertahankan untuk menjaga konsentrasi efektif glukosa dalam reaktor di bawah 5 g L- 1. Oksigen terlarut (DO)

dipertahankan pada saturasi 40% dan pH dipertahankan pada 7 melalui penambahan 2N NaOH melalui pengontrol PID. Sampel

dikumpulkan pada interval waktu yang berbeda untuk mengukur kepadatan sel dan konsentrasi metabolit.

Untuk budidaya batch pakan dalam media MOPS dengan batasan fosfor, koloni tunggal yang baru ditransformasikan
pertama kali ditanam semalaman dalam media 5 mL LB dengan 34 μ g mL- 1 kloramfenikol pada 37 ° C dan 180 rpm. Kultur
primer (1%) digunakan untuk menginokulasi 300 ml MOPS
media minimal memiliki 10 g L- 1 glukosa tanpa batasan fosfor. Saat OD 600
mencapai ~ 3, kultur sekunder ini digunakan untuk menginokulasi 3 L media yang sama dalam 5 L bioreak-

tor (Applikon). Setelah mencapai OD 600 dari ~ 4, kultur tersier disentrifugasi dan sel disuspensi kembali
dalam 350 ml media MOPS dengan batasan fosfor (0,53 mM fosfor-
phate bukannya 1,32 mM) yang mengandung 10 g L- 1 glukosa (rasio C / P 630 yang telah dilaporkan terbaik untuk
produksi FFA [ 22 ]), 100 ng mL- 1 anhydrotetracycline dan 34 μ g mL- 1

kloramfenikol dan ditanam dalam bioreaktor 500 ml (Sartorius BIOSTAT 1 Qplus) dalam kondisi terkontrol seperti yang
disebutkan sebelumnya. Pakan yang mengandung 50% glukosa dan 26,5 mM dibasa kalium fosfat, dimulai setelah
inokulasi dan laju umpan dipertahankan untuk menjaga konsentrasi glukosa di bawah 5 g L- 1. Oksigen terlarut (DO)
dipertahankan pada saturasi 40%
dan pH dipertahankan pada 7 melalui penambahan 10% (v / v) NH 4 Basis OH melalui pengontrol PID. Sampel dikumpulkan
pada interval waktu yang berbeda untuk mengukur kepadatan sel dan metabolit
konsentrasi.

Hasil

Pemilihan thioesterase untuk produksi asam butirat

Kami memilih tiga thioesterases, yaitu TesAT, TesBT dan TesBF, dari A. tetradius, B. thetaiotaomicron dan B. formatexigen, masing-masing,

berdasarkan kemampuan mereka untuk menghasilkan SCFA [ 18 ] dan mensintesis gen mereka mengikuti pengoptimalan kodon untuk

ekspresi optimal dalam E. coli. Gen-gen ini selanjutnya disubklon ke dalam tiga plasmid pQE30, pZA31MCS dan pZS21MCS yang

memiliki

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 7/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Gambar 2. Dampak jenis plasmid pada produksi asam butirat di E. coli MG1655 menggunakan tioesterase yang berbeda. ( A) Gen untuk TesAT, TesBF dan TesBT thioesterase
dikloning dalam plasmid nomor salinan rendah (pZS21mcs), sedang (pZA31mcs) dan tinggi (pQE30), diubah menjadi E. coli MG1655 dan dievaluasi untuk produksi asam butirat.
Western blot dilakukan dengan fraksi larut (B) dan tidak larut (C) dari lisat sel yang mengekspresikan gen untuk TesAT, TesBF dan TesBT. Pita protein dengan berat molekul yang
diinginkan diamati untuk setiap konstruksi di salah satu atau kedua fraksi seluler. M menunjukkan penanda protein dalam kilodalton.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g002

nomor salin yang berbeda (pQE30> pZA31mcs> pZS21mcs) dan ditransformasikan E. coli untuk menganalisis kemampuannya dalam

menghasilkan asam butirat. Kami menemukan perbedaan mencolok antara tioesterase dan nomor salinan plasmid yang digunakan

dalam hal titer asam butirat yang diperoleh. Gen untuk TesAT dan TesBF yang dikloning dalam plasmid nomor salinan tinggi pQE30

menghasilkan akumulasi asam butirat yang lebih tinggi dibandingkan dengan plasmid nomor salinan sedang dan rendah. Namun,

ekspresi TesBT dalam plasmid salinan tinggi merugikan produksi asam butirat ( Gambar 2A ). Kami menganalisis ekspresi gen ini di

Western blot dan menemukan bahwa ekspresi larut TesAT, TesBF dan TesBT berkorelasi baik dengan titer asam butirat ( Gambar 2B

dan 2C ). TesBT yang diekspresikan melalui plasmid salinan tinggi sebagian besar terakumulasi sebagai badan inklusi ( Gambar 2C ).

Data juga menunjukkan bahwa karena TesAT diekspresikan dengan baik sebagai protein terlarut, titer asam butirat yang lebih rendah

dalam hal ini bukan karena masalah ekspresi, tetapi lebih karena aktivitas yang lebih rendah terhadap butiril-ACP.

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 8/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Gambar 3. Dampak genotipe E. coli pada produksi asam butirat menggunakan tioesterase yang berbeda. Berbeda E. coli strain ditransformasikan dengan plasmid pQE-tesAT, pQE-tesBF dan
pQE-tesBT untuk ekspresi thioesterase TesAT (direpresentasikan sebagai AT), TesBF (direpresentasikan sebagai BF) dan TesBT (direpresentasikan sebagai BT), masing-masing, dan
digunakan untuk produksi asam butirat.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g003

Latar belakang genetik berbeda E. coli strain telah ditemukan memainkan peran penting dalam produksi biokimia [ 19 ]. Oleh
karena itu kami menganalisis berbagai E. coli strain, yaitu MG1655, JM109, M15, BW25113, DH5 α, BLR (DE3) dan B untuk
produksi asam butirat dengan mentransformasi plasmid yang mengandung gen untuk TesAT, TesBF dan TesBT untuk ekspresi
optimalnya, yaitu, pQE-tesAT, pQE-tesBF dan pZA-tesBT. Kami menemukan variasi yang signifikan dalam titer asam butirat antara
strain berbeda yang diuji. Di antara mereka, strain MG1655 mengakumulasi lebih banyak asam butirat dibandingkan dengan strain
lain ketika diubah dengan salah satu dari tiga tioesterase ( Gambar 3 ). Namun, titer diperoleh dengan mentransformasi kandungan
plasmid tesBT atau tesBF adalah urutan besarnya lebih tinggi dari yang diperoleh saat mentransformasi yang mengandung plasmid tesAT
untuk sebagian besar strain ( Gambar 3 ). Jadi, kami memilih TesBT dan TesBF untuk studi lebih lanjut kami. Kami memeriksa
konsentrasi induser yang optimal dan menemukan bahwa 0,1 mM IPTG dan 100 ng ml- 1

anhydrotetracycline optimal untuk produksi asam butirat dalam kasus TesBF dan TesBT, masing-masing ( S1 Gambar ).

Kekhususan panjang rantai TesBF dan TesBT

Profil asam lemak lengkap dari E. coli MG1655 yang ditransformasikan dengan pQE-tesBF dan pZA-tesBT menunjukkan produksi asam

butirat yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan asam lemak lain oleh TesBF dan TesBT ( Gambar 4 ). Karena itu, kami ingin

menganalisis kekhususan panjang rantai kedua enzim ini dalam sebuah in vitro pengujian enzim. Ekstrak protein dari kultur yang diinduksi

digunakan untuk penilaian aktivitas. TesBT telah menunjukkan aktivitas lebih dari dua kali lipat lebih tinggi daripada TesBF terhadap

butyryl-CoA ( Meja 2 ). Menariknya, kami menemukan 2 - Aktivitas spesifik 3 kali lipat lebih tinggi dari TesBF dan TesBT terhadap prekursor

asam lemak rantai yang lebih panjang dari panjang rantai C6 dan C8 dibandingkan dengan prekursor asam butirat. Di antara perantara

siklus FASII lainnya, aktivitas melawan

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 9/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Gambar 4. Dampak penghapusan gen yang memiliki efek penghambatan pada biosintesis asam lemak inang pada produksi asam lemak bebas
menggunakan TesBF (A) dan TesBT (B) thioesterase. Fungsi gen: iseng - lemak asil-CoA sintetase; luntur - asil-KoA dehidrogenase; fabR - penekan
transkripsional FASII.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g004

Prekursor asam malonat dapat diabaikan, tetapi aktivitas melawan prekursor asam asetoasetat mendekati prekursor asam butirat.

TesBF menunjukkan aktivitas rendah terhadap prekursor asam asetat, sedangkan

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 10/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Tabel 2. Kekhususan panjang rantai tioesterase.

Thioesterase

Substrat TesBF (nmol min- 1 mg- 1) TesBT (nmol min- 1 mg- 1)

Asetil KoA (C2) 0.11 4.62

Malonyl CoA (C3) 0,00 0.18

Asetoasetil KoA (C4) 0.76 1.38

Butenoyl CoA (C4: 1) 0.43 0.79

Butyryl CoA (C4) 1.28 2.91

Hexanoyl CoA (C6) 2.32 6.63

Oktanoyl CoA (C8) 2.06 5.57

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.t002

TesBT menunjukkan aktivitas yang jauh lebih tinggi terhadapnya. Alasan produksi asam butirat lebih tinggi di bawah in vivo Kondisi

tersebut dapat disebabkan oleh ketersediaan prekursornya yang lebih tinggi, yaitu butyryl-ACP, untuk tioesterase dari jalur FASII

dibandingkan dengan prekursor untuk asam heksanoat atau asam oktanoat, yaitu heksanoil-ACP atau Oktanoyl-ACP. Hal penting

lainnya yang kami perhatikan adalah preferensi TesBF dan TesBT untuk prekursor asam butirat dibandingkan dengan prekursor

asam butenoat mitra tak jenuh ( Meja 2 ), menunjukkan alasan untuk mengamati titer yang jauh lebih tinggi untuk asam butirat

dibandingkan dengan asam butenoat.

Peran jalur sintesis dan degradasi asam lemak inang terhadap produksi asam butirat

Beberapa strategi telah dilaporkan dalam literatur untuk meningkatkan produksi asam lemak bebas. Beberapa di
antaranya termasuk penghapusan β- oksidasi, ekspresi berlebih dari enzim kunci dari jalur biosintesis asam lemak dan
ekspresi berlebih / penghapusan regulator transkripsi. Semua modifikasi ini diuji untuk produksi asam lemak rantai
menengah dan panjang [ 23 , 26 - 29 ], dan sangat sedikit upaya telah dilakukan untuk produksi SCFA [ 16 ].

Karena itu, kami pertama kali menguji produksi asam butirat dengan melumpuhkan iseng ( pengkodean lemak asil-CoA

sintetase) dan iseng ( pengkodean asil-KoA dehidrogenase) untuk memblokir β- siklus oksidasi ( Gambar 1 ). Sebelumnya, knock out iseng

atau luntur peningkatan akumulasi FFA [ 16 , 23 , 30 ] serta produksi alkohol berlemak [ 31 ]. Namun, kami mengamati 25 - 30% dan 5 - 6%

penurunan titer asam butirat jika ekspresi berlebih dengan tesBF dan tesBT, masing-masing, setelah menghapus

iseng dan / atau iseng ( Gambar 4A dan 4B ). Kami memang mengamati peningkatan simultan dalam asam lemak rantai sedang
dan panjang ( Gambar 4 ). Ini menyarankan fungsional itu β- Siklus oksidasi membantu asam lemak bebas rantai panjang untuk
diubah menjadi lemak asil-KoA dan selanjutnya teroksidasi menjadi butiril-KoA. TesBF atau TesBT kemudian mengubah
butyryl-CoA, selain substrat alami butyryl-ACP, menjadi asam butirat ( Gambar 1 ). Pengamatan ini juga mendukung temuan kami
sebelumnya bahwa FadD tidak efisien untuk aktivasi asam lemak rantai pendek, yaitu asam butirat menjadi butiril-KoA [ 19 , 32 ],
yang jika tidak dapat menyebabkan degradasi selanjutnya. Jadi iseng penghapusan mengakibatkan penurunan titer asam butirat
daripada peningkatannya.

FabR adalah penekan transkripsi yang mengontrol biosintesis asam lemak di E. coli dengan menekan ekspresi kedua gen

tersebut, fabA dan fabB, dan penghapusannya telah terbukti meningkatkan titer dan rendemen asam lemak, terutama untuk asam

lemak tak jenuh [ 27 , 33 , 34 ]. Saat kami memeriksa efek penghapusan fabR pada produksi asam butirat, kami menemukan 78% dan

20% penurunan titer asam butirat dalam kasus TesBF dan TesBT, masing-masing ( Gambar 4A dan 4B ). Untuk mencoba perbaikan

lebih lanjut dalam titer asam butirat, kami mengungkapkannya secara berlebihan iseng, pengatur transkripsi global dari jalur asam

lemak yang mengontrol ekspresi beberapa gen yang terlibat dalam biosintesis asam lemak, degradasi, dan transportasi dan telah

terbukti membantu dalam meningkatkan

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 11/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Gambar 5. Dampak ekspresi berlebih dari gen yang memiliki efek positif pada biosintesis asam lemak inang pada produksi asam butirat. E. coli MG1655
ditransformasikan bersama dengan gen yang mengandung plasmid untuk TesBT tioesterase bersama dengan gen yang mengandung plasmid yang memiliki
positif pada biosintesis asam lemak inang dan dianalisis untuk produksi berbagai asam lemak bebas panjang rantai. Fungsi gen: fabZ - β- hidroksiasil-ACP
dehydratase; fadR -
peningkat transkripsional FASII dan penekan β- oksidasi; acc - asetil-KoA karboksilase dari Corynebacterium
glutamatum.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g005

Titer FFA [ 23 ]. Kami juga menguji ekspresi berlebih dari gen lain dari jalur sintesis asam lemak pada produksi asam
butirat, seperti fabZ ( pengkodean 3-hidroksi-asil-ACP dehydratase) dari E. coli
dan accABCD ( pengkodean asetil-KoA karboksilase) dari Corynebacterium glutamicum, yang ekspresi berlebihnya telah terbukti

meningkatkan titer asam lemak bebas E. coli [ 35 ]. Kami mengamati peningkatan titer asam lemak rantai menengah dan panjang

pada kasus fabZ dan fadR ekspresi berlebih, tetapi semuanya tidak menunjukkan dampak atau dampak negatif pada titer asam

butirat ( Gambar 5 ).

Penghambatan kimiawi dari perpanjangan asam lemak untuk meningkatkan produksi asam butirat

Siklus pertama jalur sintesis asam lemak masuk E. coli menghasilkan butyryl-ACP, yang kemudian memasuki siklus perpanjangan

berikutnya yang akan menurunkan ketersediaan butyryl-ACP untuk thioesterase spesifik rantai pendek. Cerulenin, antibiotik

antijamur, menghambat pemanjangan asam lemak dengan memblokir FabB dan FabF dan mengakumulasi asil-ACP rantai pendek [ 15

, 36 ]. Untuk menguji apakah penambahan cerulenin meningkatkan produksi asam butirat, kami menggunakan konsentrasi cerulenin

yang berbeda dalam media dan menganalisis sintesis asam butirat oleh sel yang ditransformasikan dengan plasmid yang

mengandung tesBF atau tesBT. Kami menemukan beragam dampak cerulenin pada produksi asam butirat tergantung pada jenis

tioesterase yang digunakan. E. coli saring dimana

tesBF diekspresikan secara berlebihan, produksi asam butirat meningkat secara bertahap hingga 0,4 μ g / ml cerulenin ditambahkan,

mencapai titer 1,46 g L- 1, yang 1,72 kali lipat lebih tinggi dari kontrol yang tidak menambahkan cerulenin. Titer asam butirat menurun

lebih dari 0,4 μ g / ml penambahan cerulenin, mencapai kurang dari 1/4 th dari regangan kontrol ketika 1 μ g / ml cerulenin

ditambahkan. Di samping itu,

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 12/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

penambahan cerulenin menyebabkan penurunan titer asam butirat sejak awal saat TesBT digunakan sebagai tioesterase ( Gambar 6 ).

Khususnya, konsentrasi asam asetat dalam medium menunjukkan peningkatan tajam pada

Gambar 6. Dampak cerulenin pada produksi asam butirat yang dimediasi tioesterase. E. coli MG1655 ditransformasikan dengan (A) pQE-tesBF untuk
ekspresi pada TesBF tioesterase atau (B) pZA-tesBT untuk ekspresi tioesterase TesBT ditanam dengan adanya perbedaan konsentrasi cerulenin dan
metabolit ekstraseluler dianalisis menggunakan HPLC.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g006

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 13/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Tabel 3. Pengaruh cerulenin pada in vitro aktivitas enzim tioesterase.

Cerulenin conc. ( μ g ml- 1) Aktivitas TesBF (nmol min- 1 mg- 1) Aktivitas TesBT (nmol min- 1 mg- 1)

0 1.28 2.91

0.2 1.19 0,99

0.4 1.05 0.46

0.6 0.67 0

0.8 0,56 0

1 0.49 0

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.t003

konsentrasi yang lebih tinggi dari cerulenin yang dilengkapi dengan konsentrasi asam butirat yang lebih rendah ( Gambar 6 ). Dari

pengamatan ini tampak bahwa cerulenin juga menghambat thioesterase spesifik rantai pendek dengan menempati kantong pengikatnya

seperti yang terjadi pada enzim siklus pemanjangan asam lemak. Namun, konsentrasi penghambatan cerulenin tampaknya berbeda untuk

tioesterase yang berbeda. Untuk menguji hipotesis ini, kami melakukan in vitro uji enzim TesBF dan TesBT dengan adanya konsentrasi

serulenin yang berbeda. Kami menemukan penghambatan aktivitas enzim setelah penambahan cerulenin untuk TesBF dan TesBT ( Tabel 3 ),

dengan berbagai tingkat dampak. TesBF tampaknya lebih dapat ditoleransi terhadap cerulenin, sementara penurunan aktivitas secara

bertahap diamati dalam kasus TesBT pada peningkatan konsentrasi cerulenin, dengan kehilangan aktivitas total melebihi 0,6 μ g / mL

konsentrasi ( Tabel 3 ). Namun demikian, TesBT menunjukkan aktivitas spesifik yang lebih tinggi daripada TesBF dan mencapai titer asam

butirat tertinggi sebesar 1,46 g L- 1 tanpa harus menambahkan cerulenin ( Gambar 6 ). Dengan demikian kami mempertimbangkan TesBT

untuk studi lebih lanjut kami untuk meningkatkan titer asam butirat.

Menyeimbangkan pertumbuhan sel dan produksi asam butirat

Setelah menilai peran mesin seluler inang pada produksi asam butirat, kami berfokus pada pengoptimalan media karena media

memainkan peran kunci dalam metabolisme energi suatu organisme. Kami membayangkan produksi asam butirat secara terus-menerus

dengan menjaga sel-sel tetap aktif secara metabolik tetapi dalam keadaan tidak tumbuh sehingga substrat dapat disalurkan ke arah

pembentukan produk alih-alih biomassa. Percobaan awal dilakukan di M9 dan menggunakan media minimal berbasis MOPS tesBT menyembunyikan

E. coli strain menyarankan MOPS menjadi media yang lebih baik untuk produksi asam butirat ( Tabel 4 ). Percobaan lebih lanjut dalam

media berbasis MOPS menunjukkan bahwa hasil spesifik asam butirat meningkat 2 kali lipat dalam media terbatas nitrogen, tetapi titer

asam butirat tertinggi tercatat dalam kondisi terbatas fosfor ( Tabel 4 ). Pembudidayaan sel pada medium kompleks yaitu Terrific Broth

menghasilkan rendemen spesifik yang lebih rendah, tetapi titer asam butirat lebih tinggi daripada medium minimal berbasis MOPS.

Ketersediaan oksigen merupakan parameter penting untuk pertumbuhan sel dan produksi metabolit. Kami kemudian menguji titer

asam butirat dengan menumbuhkan volume yang berbeda dari media kultur dalam labu 100 ml yang mewakili kisaran 50 - 90% ruang

kepala tersedia untuk pertukaran oksigen dari udara. Kami juga menginkubasi sel dalam labu tutup tertutup untuk mencapai pertumbuhan

anaerobik. Titer maksimum 1,55

Tabel 4. Dampak komposisi media dan batasan nutrisi pada produksi asam butirat.

Media Pertumbuhan sel (OD600) Asam butirat (g L- 1) Hasil (g g- 1 glukosa) Speci fi c hasil (g g- 1 sel)

M9 6.43 ± 0.14 0,02 ± 0,0006 0,003 ± 0,0001 0,006 ± 0,0003

MOPS 4.21 ± 0.14 0.65 ± 0,01 0,081 ± 0,001 0.31 ± 0,014

M9-MOPS 4.38 ± 0.14 0.34 ± 0,01 0,043 ± 0,002 0.16 ± 0,015

MOPS nitrogen terbatas 1.96 ± 0,01 0.61 ± 0,08 0,085 ± 0,001 0.63 ± 0,083

MOPS fosfor Terbatas 3.07 ± 0.48 0.77 ± 0.19 0.114 ± 0,002 0,50 ± 0,047

TB 9.89 ± 0,09 1.45 ± 0,03 0.182 ± 0,003 0.29 ± 0,01

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.t004

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 14/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

g L- 1 asam butirat dicapai ketika rasio cairan terhadap ruang kepala adalah 3: 7 ( Gambar 7A ). Profil bentuk lonceng dari titer asam butirat

pada headspace yang berbeda menunjukkan kompetisi prekursor asam lemak untuk pembentukan biomassa dan asam butirat. Dengan

ketersediaan oksigen tingkat tinggi pada rasio cairan terhadap ruang kepala yang rendah, aliran siklus FASII lebih banyak dialihkan ke arah

pembentukan biomassa yang lebih tinggi ( Gambar 7A ) karena fosforilasi oksidatif aktif yang menimbulkan ATP tinggi. Pada rasio cairan

terhadap headspace yang lebih tinggi, di mana kondisi pertumbuhan mencapai anaerobiosis, kita kembali melihat penurunan titer asam

butirat karena tingkat pertumbuhan yang buruk ( Gambar 7A ). Jadi, keseimbangan ketersediaan oksigen tampaknya penting untuk produksi

asam butirat.

Kami selanjutnya menguji ketersediaan oksigen pada produksi asam butirat dalam bioreaktor dalam budidaya batch. Kami

menemukan bahwa tidak banyak perbedaan dalam titer asam butirat (~ 1,1 g L- 1)

antara 5% dan 40% tingkat saturasi, tetapi titer asam butirat turun menjadi 0,88 g L- 1 pada tingkat saturasi 60% dengan peningkatan

kerapatan sel secara bersamaan ( Gambar 7B ). Oleh karena itu kami memilih 40% saturasi tingkat oksigen untuk studi lebih lanjut pada

tingkat fermentasi batch-umpan.

Budidaya fed-batch untuk produksi asam butirat titer tinggi

Kami melakukan budidaya fed-batch untuk meningkatkan titer penggunaan asam butirat E. coli MG1655 menyimpan plasmid untuk

produksi TesBT. Penggunaan Terrific Broth (TB) pada kultur volume kecil pada level tabung kultur menghasilkan titer asam butirat

tertinggi. Jadi kami berusaha untuk menumbuhkan sel di TB yang mengandung 10 g L- 1 glukosa dan kemudian memberi makan glukosa

untuk menjaga konsentrasi glukosa

tration sekitar 5 g L- 1 di bioreaktor. Sel tumbuh sampai 24 jam menjadi OD 600 dari 35 setelah itu memasuki fase diam.
Titer asam butirat yang dicapai adalah 4,77 g L- 1 dan produknya-
pertumbuhan tampaknya terkait dengan pertumbuhan karena tidak ada peningkatan signifikan dalam titer yang diamati melebihi 24 jam

pertumbuhan ( Gambar 8A ). Kami lebih suka mengamati akumulasi asam asetat yang signifikan selama fase selanjutnya dari budidaya

batch-makan ( Tabel S1 ). Kami selanjutnya mencoba menggunakan media yang ditentukan untuk produksi asam butirat di bioreaktor.

Karena media MOPS dengan batasan fosfor memberikan hasil terbaik dalam tabung kultur untuk media tertentu ( Tabel 4 ), kami

menggunakan media ini untuk membudidayakan sel di bioreaktor. Konsentrasi glukosa awal dalam media batch disimpan pada 10 g L- 1 dan

pemberian makan glukosa pekat dimulai segera setelah konsentrasi glukosa turun di bawah 2,5 g L- 1. Sisa glukosa dipantau pada

berbagai interval waktu dan disimpan di bawah 5 g L- 1 dalam media kultur dengan menyesuaikan laju pakan. Titer asam butirat yang

dicapai dengan menggunakan strategi ini adalah 4,6 g L- 1 di akhir 120 jam ( Gambar 8B ). Untuk meningkatkan produktivitas dan

Titer asam butirat, bioreaktor diinokulasi dengan OD awal lebih tinggi 600 dari ~ 30. Sebagian besar asam butirat diproduksi
dalam 12 jam pertama dengan produktivitas maksimum 1,29 g L- 1 h- 1 ( Ara
8C , Tabel 5 ). Titer maksimum asam butirat yang tercatat adalah 14,3 g L- 1 setelah 18 jam budidaya di bioreaktor pada 22%
dari hasil teoritis maksimum ( Tabel 5 ). Total asam lemak bebas yang terdeteksi di media adalah 17,5 g L- 1 diproduksi pada
produktivitas maksimum 1,51 g L- 1 h- 1 dan hasil produk 0,13 g g- 1 glukosa, yang 28% dari maksimum teoritis ( Gambar 8 , Tabel
5 ).

Diskusi
Dalam studi ini, kami menetapkan jalur biosintetik untuk produksi asam butirat yang efisien di
E. coli, yang berpotensi dapat digunakan untuk menggantikan metode kimia tradisional untuk produksi asam butirat. Kami

menggunakan jalur sintesis asam lemak inang (FASII) untuk produksi asam butirat dengan bantuan tiga tioesterase spesifik SCFA,

yaitu TesAT, TesBF dan TesBT, dan menemukan bahwa ekspresi berlebih TesBF dan TesBT menghasilkan konsentrasi asam

butirat 7 hingga 12 kali lipat lebih tinggi daripada TesAT. Genotipe dari E. coli strain telah terbukti memiliki dampak pada tingkat

produksi metabolit [ 19 ]. Hasil kami dikuatkan dengan temuan ini karena kami mengamati sebagian besar dari tujuh E. coli strain dari

berbagai genotipe yang diuji menunjukkan hasil yang berbeda, dengan MG1655 menghasilkan titer asam butirat tertinggi.

Sebelumnya, upaya telah dilakukan untuk memproduksi

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 15/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Gambar 7. Pengaruh ketersediaan oksigen pada produksi asam butirat. ( SEBUAH) E. coli MG1655 ditransformasikan dengan pZAtesBT plasmid ditanam dalam labu
100 ml yang berisi volume media kultur yang berbeda untuk memvariasikan ketersediaan oksigen dan diperiksa untuk produksi asam butirat. (B) E. coli MG1655
ditransformasikan dengan plasmid pZA-tesBT ditumbuhkan dalam bioreaktor yang mengandung 350 ml media kultur dengan tingkat saturasi oksigen yang berbeda
dan diperiksa untuk produksi asam butirat.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g007

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 16/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Gambar 8. Produksi mikroba asam butirat dalam budidaya batch-makan. ( A) Budidaya Fed-batch dilakukan dalam Kaldu Hebat, (B) budidaya
Fed-batch dilakukan di MOPS media di bawah batasan fosfor, dan (C) budidaya Fed-batch dilakukan di media terbatas fosfor MOPS dengan
kepadatan sel awal yang lebih tinggi.

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.g008

asam butirat dalam E. coli melalui jalur sintesis asam lemak (FASII) dengan mengekspresikan tioesterase spesifik secara

heterologis untuk asam lemak rantai pendek (SCFA) [ 15 , 16 , 18 ]. Namun, ini

Tabel 5. Hasil dan produktivitas asam butirat selama budidaya batch-pakan rekombinan E. coli di bawah kondisi pembatas fosfor.

Senyawa Titer (g L- 1) Hasil (g g- 1 glukosa) Hasil molar (mMmM- 1 glukosa)% dari produktivitas volumetrik maksima maks. teoretis
(g L- 1 h- 1)

Asam butirat 14.3 0.11 0.22 22% 1.29

Total asam lemak bebas 17.5 0.13 0.26 28% 1.51

doi: 10.1371 / journal.pone.0160035.t005

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 17/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

percobaan menghasilkan titer asam butirat yang rendah, mungkin karena penggunaan satu jenis regangan, yaitu BL21 (DE3).

Nomor salinan plasmid juga membuat perbedaan. Strain MG1655 yang mengandung pZA31-tesBT, suatu plasmid nomor salinan

sedang dengan promotor PLtetO-1, mencapai akumulasi asam butirat maksimum 1,5 g L- 1 di tingkat tabung kultur.

Berbagai laporan menunjukkan peningkatan asam lemak rantai menengah dan panjang setelah mencegah degradasi FFA
melalui β- siklus oksidasi dan dengan memodulasi regulasi dan perpanjangan jalur FASII inang. Misalnya, melumpuhkan enzim
awal dari β- siklus oksidasi yang dikodekan oleh
iseng dan luntur terbukti meningkatkan akumulasi asam lemak rantai menengah dan panjang [ 16 , 23 ,

30 ]. Sebaliknya, kami menemukan penurunan titer asam butirat, menunjukkan peran positif dari β- siklus oksidasi dengan memberikan

prekursor asil CoA lemak rantai pendek ke TesBF dan TesBT, yang dapat mengenali ACP dan CoA sebagai pembawa asam lemak

rantai pendek ( Gambar 1 ). Demikian pula penghapusan repressor transkripsional fabR dan ekspresi berlebih fabZ dan accABCD jalur

sintesis asam lemak ditemukan lebih awal untuk mengatur siklus pemanjangan [ 29 , 35 ]. Namun, di sini juga kami kebanyakan

mengamati peningkatan titer asam lemak rantai sedang dan panjang. Oleh karena itu, tampaknya percepatan siklus sintesis asam

lemak mungkin bermanfaat untuk produksi asam lemak rantai menengah dan panjang, tetapi tidak untuk asam lemak rantai pendek.

Karena percepatan sintesis asam lemak rantai panjang sebagian besar menyebabkan penurunan titer asam butirat, kami mengambil

strategi untuk menghambat siklus pemanjangan asam lemak dengan menambahkan penghambat kimiawi cerulenin [ 15 , 36 ]. Telah

terbukti sebelumnya dapat meningkatkan akumulasi asam lemak rantai pendek [ 15 ]. Kami memang melihat peningkatan titer asam butirat

ke tingkat tertentu dalam kasus TesBF, namun peningkatan ini gagal menghasilkan asam butirat melebihi 1,46 g L- 1 yang diproduksi oleh

TesBT tanpa penambahan cerulenin. Penambahan cerulenin tidak berdampak pada titer asam butirat dalam kasus TesBT, mungkin

karena dampak penghambatannya pada tioesterase karena tioesterase berbagi kantong pengikat umum untuk substrat dengan enzim

yang terlibat dalam siklus pemanjangan asam lemak. Ini dibuktikan lebih lanjut dengan pertunjukan in vitro uji enzim dengan adanya

cerulenin.

Perbaikan lebih lanjut dalam asam butirat dicapai dengan optimasi proses. Karena jalur yang sama untuk pertumbuhan
sel dan produksi asam butirat, keseimbangan dicapai antara keduanya dengan menumbuhkan sel dalam kondisi nutrisi
dan oksigen terbatas. Dengan memperhatikan faktor-faktor ini, strategi budidaya kelompok pakan dirancang untuk
produksi asam butirat dalam kondisi fosfor dan karbon terbatas. Akhirnya, kami memperoleh 14,3 g L- 1 asam butirat dan

17,5 g L- 1 dari total asam lemak bebas, kedua nilai tertinggi yang dilaporkan sejauh ini dalam rekayasa E. coli

sistem [ 3 , 8 , 10 , 15 , 37 ].

informasi pendukung
S1 Gambar. Pengaruh konsentrasi induser yang berbeda pada produksi asam butirat. ( SEBUAH) E. coli MG1655
menyimpan pQE-tesBF dan (B) E. coli MG1655 menyimpan pZA-tesBT. (PDF)

Tabel S1. Profil metabolit dari E. coli MG1655 (pZA-tesBT) dalam media TB selama budidaya pakan ternak.

(PDF)

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini didukung oleh Departemen Bioteknologi (DBT), Pemerintah India melalui hibah Pusat Bioenergi no. BT / PB / Center

/ 03/2011. Kami berterima kasih kepada Girish HR karena telah menganalisis sampel asam lemak di GC-MS. Kamran Jawed

didukung oleh beasiswa dari Council of Scientific and Industrial Research.

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 18/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

Kontribusi Penulis
Merancang dan merancang percobaan: KJ SWMZA SSY. Melakukan percobaan: KJ AJMZF. Menganalisis data: KJ
SSY. Reagen / bahan / alat analisis yang disumbangkan: SSY. Penulis makalah: KJ SSY.

Referensi
1. Saini M, Hong Chen M, Chiang CJ, Chao YP. Platform produksi potensial n-butanol di Escherichia coli. Rekayasa Metabolik. 2015; 27:76 - 82.
doi: 10.1016 / j.ymben. 2014.11.001 PMID: 25461833 .

2. Pásztor A, Kallio P, Malatinszky D, Akhtar MK, Jones PR. O2 sintetis - jalur butanol toleran memanfaatkan biosintesis asam lemak asli di
Escherichia coli. Bioteknologi dan Bioengineering. 2015; 112 (1): 120 - 8. doi: 10.1002 / bit. 25324 PMID: 24981220 .

3. Kallio P, Pasztor A, Thiel K, Akhtar MK, Jones PR. Jalur yang direkayasa untuk biosintesis propana terbarukan. Komunikasi Alam.
2014; 5: 4731. doi: 10.1038 / ncomms5731 PMID:
25181600 ; PMCID Pusat PubMed: PMC4164768.

4. Menon N, Pasztor A, Menon BR, Kallio P, Fisher K, Akhtar MK, dkk. Platform amikroba untuk sintesis propana terbarukan berdasarkan jalur
butanol fermentatif. Bioteknologi untuk Biofuel. 2015; 8:61. doi: 10.1186 / s13068-015-0231-1 PMID: 25866563 ; PMCID Pusat PubMed:
PMC4392459.

5. Volker AR, Gogerty DS, Bartholomay C, Hennen-Bierwagen T, Zhu H, Bobik TA. Produksi fermentasi asam lemak rantai pendek di Escherichia
coli. Mikrobiologi. 2014; 160 (Pn 7): 1513 - 22. doi: 10.1099 / mic.0.078329 - 0 PMID: 24722906 .

6. Liu Y, Xu H, Yan Q, Yang S, Duan X, Jiang Z. Karakterisasi biokimia dari esterase jamur pertama dari Rizomucor miehei menunjukkan
efisiensi tinggi sintesis ester. PLOSONE. 2013; 8 (10): e77856. doi: 10.1371 / journal.pone.0077856 PMID: 24204998

7. Rodriguez GM, Tashiro Y, Atsumi S. Memperluas biosintesis ester di Escherichia coli. Biologi Kimia Alam. 2014; 10 (4): 259 - 65. doi: 10.1038 /
nchembio.1476 PMID: 24609358 ; PMCID Pusat PubMed: PMC4411949.

8. Baek JM, Mazumdar S, Lee SW, Jung MY, Lim JH, Seo SW, dkk. Produksi butirat di Escherichia coli yang direkayasa dengan perancah
sintetis. Bioteknologi dan Bioengineering. 2013; 110 (10): 2790 - 4. doi: 10,1002 / bit. 24925 PMID: 23568786 .

9. Dwidar M, Park JY, Mitchell RJ, Sang BI. Masa depan asam butirat dalam industri. TheScientificWorldJournal. 2012; 2012: 471417. doi: 10.1100
/ 2012/471417 PMID: 22593687 ; PMCID Pusat PubMed: PMC3349206.

10. Saini M, Wang ZW, Chiang CJ, Chao YP. Rekayasa metabolik Escherichia coli untuk produksi asam butirat. Jurnal Kimia Pertanian dan
Pangan. 2014; 62 (19): 4342 - 8. doi: 10.1021 / jf500355p
PMID: 24773075 .

11. Jha AK, Li J, Yuan Y, Baral N, Ai B. Review Produksi Asam Butirat dan Optimisasinya. Jurnal Internasional Pertanian & Biologi. 2014; 16 (5).

12. Zhang X, Li M, Agrawal A, San KY. Produksi asam lemak bebas yang efisien di Escherichia coli menggunakan tioesterase asil-ACP
tanaman. Rekayasa Metabolik. 2011; 13 (6): 713 - 22. doi: 10.1016 / j.ymben.2011.09. 007 PMID: 22001432 .

13. Voelker TA, Davies HM. Perubahan spesifisitas dan regulasi sintesis asam lemak Escherichia coli dengan ekspresi thioesterase protein
pembawa asil-asil rantai-menengah tanaman. Jurnal Bakteriologi. 1994; 176 (23): 7320 - 7. PMID: 7961504 ; PMCID Pusat PubMed:
PMC197121

14. Youngquist JT, Schumacher MH, Rose JP, Raines TC, Politz MC, Copeland MF, dkk. Produksi alkohol lemak panjang rantai sedang dari
glukosa di Escherichia coli. Rekayasa Metabolik. 2013; 20: 177 - 86. doi: 10.1016 / j.ymben. 2013.10.006 PMID: 24141053 ; PMCID Pusat
PubMed: PMC3866921.

15. Torella JP, Ford TJ, KimSN, Chen AM, Way JC, Silver PA. Sintesis asam lemak yang disesuaikan melalui kontrol dinamis pemanjangan
asam lemak. Prosiding National Academy of Sciences. 2013; 110 (28): 11290 - 5. doi: 10.1073 / pnas.1307129110 PMID: 23798438 .

16. Liu X, Yu H, Jiang X, Ai G, Yu B, Zhu K. Biosintesis asam butenoat melalui jalur biosintesis asam lemak di Escherichia coli. Mikrobiologi dan
Bioteknologi Terapan. 2015; 99 (4): 1795 - 804. doi: 10. 1007 / s00253-014-6233-2 PMID: 25472435 .

17. Dellomonaco C, Clomburg JM, Miller EN, Gonzalez R. Direkayasa pembalikan siklus beta-oksidasi untuk sintesis bahan bakar dan bahan
kimia. Alam. 2011; 476 (7360): 355 - 9. doi: 10.1038 / nature10333
PMID: 21832992 .

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 19/20

 Produksi Asam Lemak Rantai Pendek di PT Escherichia coli

18. Jing F, Cantu DC, Tvaruzkova J, Chipman JP, Nikolau BJ, Yandeau-Nelson MD, dkk. Karakterisasi filogenetik dan eksperimental dari
famili asil-ACP thioesterase menunjukkan keragaman yang signifikan dalam spesifisitas dan aktivitas enzimatik. Biokimia BMC. 2011;
12:44. doi: 10.1186 / 1471-2091-12-44
PMID: 21831316 ; PMCID Pusat PubMed: PMC3176148.

19. MattamAJ, Yazdani SS. Rekayasa strain E. coli untuk konversi asam lemak rantai pendek menjadi bioalkohol. Bioteknologi untuk Biofuel.
2013; 6 (1): 128. doi: 10.1186 / 1754-6834-6-128 PMID: 24020887 .

20. Munjal N, MattamAJ, Pramanik D, Srivastava PS, Yazdani SS. Modulasi jalur endogen meningkatkan hasil dan produktivitas bioetanol di
Escherichia coli. Pabrik Sel Mikroba. 2012; 11 (1): 1. doi: 10.1186 / 1475-2859-11-145 PMID: 23122330 .

21. Neidhardt FC, Bloch PL, Smith DF. Media kultur untuk enterobakteri. Jurnal Bakteriologi. 1974; 119 (3): 736 - 47. PMID: 4604283 .

22. Youngquist JT, Rose JP, Pfleger BF. Produksi asam lemak bebas di Escherichia coli dalam kondisi terbatas fosfat. Mikrobiologi dan
Bioteknologi Terapan. 2013; 97 (11): 5149 - 59. doi: 10.1007 / s00253-013-4911-0 PMID: 23619909 .

23. Zhang F, Ouellet M, Batth TS, Adams PD, Petzold CJ, Mukhopadhyay A, dkk. Meningkatkan produksi asam lemak dengan ekspresi faktor
transkripsi regulasi FadR. Rekayasa Metabolik. 2012; 14 (6): 653 - 60. doi: 10.1016 / j.ymben.2012.08.009 PMID: 23026122 .

24. Schirmer A, MA Kasar, Li X, Popova E, Del Cardayre SB. Biosintesis mikroba alkana. Ilmu. 2010; 329 (5991): 559 - 62. doi: 10.1126 /
science.1187936 PMID: 20671186 .

25. Barnes EM, Wakil SJ. Studi tentang mekanisme sintesis asam lemak XIX. persiapan dan sifat umum palmityl thioesterase. Jurnal Kimia
Biologi. 1968; 243 (11): 2955 - 62. PMID:
4871199 .

26. Lennen RM, Braden DJ, West RA, Dumesic JA, Pfleger BF. Proses sintesis hidrokarbon mikroba: Produksi berlebih asam lemak di Escherichia
coli dan konversi katalitik menjadi alkana. Bioteknologi dan Bioengineering. 2010; 106 (2): 193 - 202. doi: 10.1002 / bit.22660 PMID: 20073090 ;
PMCID Pusat PubMed: PMC3833807.

27. Ranganathan S, Tee TW, Chowdhury A, Zomorrodi AR, Yoon JM, Fu Y, dkk. Studi komputasi dan eksperimental terintegrasi untuk produksi
berlebih asam lemak di Escherichia coli. Rekayasa Metabolik. 2012; 14 (6): 687 - 704. doi: 10.1016 / j.ymben.2012.08.008 PMID: 23036703 .

28. Lee S, Jeon E, Yun HS, Lee J. Peningkatan biosintesis asam lemak dengan rekombinan rekombinan Escherichia coli. Bioteknologi dan
Rekayasa Bioproses. 2011; 16 (4): 706 - 13. doi: 10.1007 / s12257-011-0034-6

29. Tee TW, Chowdhury A, CD Maranas, Shanks JV. Desain rekayasa sistem metabolik: Produksi asam lemak sebagai studi kasus yang
muncul. Bioteknologi dan Bioengineering. 2014; 111 (5): 849 - 57. doi:
10,1002 / bit. 25205 PMID: 24481660

30. Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, dkk. Produksi mikroba bahan bakar yang berasal dari asam lemak dan bahan
kimia dari biomassa tanaman. Alam. 2010; 463 (7280): 559 - 62. doi: 10.1038 / nature08721 PMID: 20111002 .

31. Liu R, Zhu F, Lu L, Fu A, Lu J, Deng Z, dkk. Rekayasa metabolik jalur yang bergantung pada fatty acyl-ACP reduktase untuk meningkatkan
produksi alkohol berlemak di Escherichia coli. Rekayasa Metabolik. 2014; 22:10 - 21. doi: 10.1016 / j.ymben. 2013.12.004 PMID: 24333607 .

32. Zhang H, Wang P, Qi Q. Efek molekuler dari FadD pada regulasi dan metabolisme asam lemak di Escherichia coli. Surat
FEMSMicrobiology. 2006; 259 (2): 249 - 53. doi: 10.1111 / j.1574-6968.2006.
00277.x PMID: 16734787 .

33. San KY, Li M, Zhang X. Bakteri dan metode untuk mensintesis asam lemak. Paten Google; 2011.

34. Feng Y, Cronan JE. Pengikatan kompleks penekan FabR dari biosintesis asam lemak tak jenuh bakteri ke promotor serumpunnya.
Mikrobiologi Molekuler. 2011; 80 (1): 195 - 218. doi: 10.1111 / j.1365-
2958.2011.07564.x PMID: 21276098 ; PMCID Pusat PubMed: PMC4072462.

35. Davis MS, Solbiati J, Cronan JE Jr. Overproduksi aktivitas karboksilase asetil-KoA meningkatkan laju biosintesis asam lemak di
Escherichia coli. Jurnal Kimia Biologi. 2000; 275 (37): 28593 - 8. doi: 10.1074 / jbc.M004756200 PMID: 10893421 .

36. Jackowski S, Batu C. Sintase protein pembawa asetoasetil-asil, pengatur potensial biosintesis asam lemak pada bakteri. Jurnal Kimia
Biologi. 1987; 262 (16): 7927 - 31. PMID: 3294837

37. Xu P, Gu Q, WangW, Wong L, Bower AG, Collins CH, dkk. Optimalisasi modular jalur multi-gen untuk produksi asam lemak di E. coli.
Komunikasi Alam. 2013; 4: 1409. doi: 10.1038 / ncomms2425 PMID: 23361000 .

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0160035 28 Juli 2016 20/20