Keberhasilan komunitas
mikrobiota oral sebagai alat untuk
Diterima: 8 November 2018
Diterima: 22 Agustus 2019
Dipublikasikan: xx xx
xxxx
RepoRt Ilmiah | (2019) 9: 13063 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-49338-z
memperkirakan interval
postmortem
Kaikai Dong1, Ye Xin1, fangqi cao1,2, Zhiwei Huang3, Jing Sun.4, Min peng4, Wenbin Liu2 &
ping Shi1,4
Penetapan interval postmortem adalah salah satu aspek terpenting dari keahlian forensik.
Pemeriksaan mikroba dapat memberikan cara baru untuk memperkirakan interval postmortem untuk
menghindari banyak dari batasan ini. rongga mulut merupakan salah satu mikrobioma paling
beragam yang memainkan peran kunci dalam pembusukan mayat. dalam studi ini, komunitas bakteri
mulut menunjukkan perubahan yang jelas dalam kelimpahan relatif selama proses pembusukan tikus.
Sementara itu, pada tingkat taksonomi yang berbeda, bakteri spesifik ditemukan berkorelasi
signifikan dengan interval postmortem. Model regresi linier antara kelimpahan relatif dan interval
postmortem dibangun. Di antara spesies ini, Gamma-proteobacteria dan Proteus adalah yang terbaik
yang dapat digunakan untuk menyimpulkan interval postmortem, terutama interval postmortem
akhir.
Kematian diartikan sebagai berhentinya proses fisiologis yang menjaga keutuhan dan fungsi sel. Hampir
setelah kematian, tubuh mulai mengalami urutan perubahan fisik dan kimia yang tidak dapat diubah, tidak
dapat dihindari, dan progresif.1. Memahami perubahan otopsi yang diharapkan sangat penting untuk
interpretasi yang benar dari otopsi kasar dan mikropatologi. Selain itu, estimasi interval postmortem (PMI),
yang merupakan waktu setelah kematian, sebagian besar bergantung pada pemahaman proses postmortem ini.
Sangat penting untuk memperkirakan secara akurat PMI dalam forensik dan penegakan hukum karena
berkontribusi pada identifikasi korban dan tersangka, kepastian atau penghapusan saksi tersangka,
pemberitahuan akta kematian, dan distribusi aset yang tercantum dalam surat wasiat. 2. Namun, metode
inferensi PMI sulit dilakukan karena PMI rentan terhadap banyak faktor eksternal dan lingkungan, seperti
suhu, kelembaban, tekanan oksigen, serangga, dan aktivitas pemakan bangkai. 3.
Metode tradisional untuk memperkirakan PMI meliputi: (1) Perubahan Bruto. Selama proses dekomposisi,
tubuh mengalami beberapa urutan perubahan yang dapat diprediksi, termasuk kekakuan otot sementara,
perubahan warna, ekspansi gas bebas, pembentukan cairan pemulung, selip epidermis, kerusakan jaringan
lunak, dan akhirnya kerusakan tulang 4-6. (2) Perubahan Suhu. Saat ini perkiraan yang paling menjanjikan
didasarkan pada pencatatan beberapa suhu rektal atau pengukuran suhu dari mata atau telinga 7-9. (3)
Entomologi. Entomologi forensik adalah disiplin ilmu yang menerapkan bukti entomologi dan artropoda
terkait lainnya untuk memecahkan masalah pidana dan perdata yang relevan dalam praktik peradilan.
Serangga yang digunakan untuk penelitian adalah serangga yang hidup di bangkai khususnya. Inferensi PMI
adalah salah satu aplikasi entomologi forensik yang paling utama dan penting. PMI terutama disimpulkan dari
ontogenik serangga, suksesi komunitas serangga dan metabolit serangga serta ekspresi gen 10-12. Metode
inferensi PMI baru terutama mencakup kimia postmortem, metode molekuler, uji mikroba, dan sebagainya.
Integritas dan kandungan DNA, RNA, dan protein menurun tergantung waktu. Namun, pengurangan ini
berbeda antara kondisi jaringan dan lingkungan, seperti suhu dan kelembapan 13-15. Munculnya mikrogenomik
telah meningkatkan deteksi mikroba secara signifikan.
1
www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 1.(A) Kelimpahan relatif filum bakteri dengan PMI berbeda. (B) Perubahan kelimpahan relatif dari
Proteobacteria memiliki hubungan linier positif yang tinggi dengan PMI.

Oleh karena itu, nilai mikroba dalam keahlian forensik lebih menarik perhatian. Misalnya, Metcalf et al. 16
menetapkan jam mikroba yang memberikan perkiraan akurat PMI dalam sistem model mouse. Johnson dkk. 17
memilikiberhasil menunjukkan bahwa mikrobiota kulit adalah alat yang menjanjikan dalam penyelidikan
kematian forensik. Selain itu, Debruyn et al. 18 perubahan postmortem yang terdokumentasi dalam komunitas
bakteri usus manusia. Adserias et al. 19 memantau mikrobiota oral dari tubuh yang membusuk setiap hari untuk
mengidentifikasi taksa bakteri yang khas. Secara keseluruhan metode tradisional secara negatif diganggu oleh
lingkungan eksternal atau penilaian subjektif penguji. Karena model matematika tetap, metode mikroba
kurang dipengaruhi oleh penilaian subjektif inspektur dan relatif lebih dapat diandalkan. Dengan demikian,
metode pendugaan PMI oleh mikroorganisme sekarang dapat berfungsi sebagai alat bantu. Menerapkan
perubahan dalam komunitas mikroba untuk menyimpulkan PMI secara bertahap menjadi topik hangat dalam
penelitian forensik.
Rongga mulut adalah salah satu bidang penelitian utama dari rekayasa komunitas mikroba manusia. Ini
adalah salah satu area komunitas mikroba manusia yang paling melimpah dan kompleks manusia terbesar
kedua setelah usus besar20. Sekitar 1000 spesies bakteri telah ditemukan dalam komunitas mikroba mulut,
dengan perwakilan dari filum Actinomycetes, Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Sinergis, Spirochetes
dan Aponeurophytes21. Terlebih lagi, mikrobioma autochthonous oral dan saluran pencernaan memainkan
peran kunci dalam dekomposisi22. Dengan demikian, metode pendugaan PMI oleh mikroorganisme sekarang
dapat berfungsi sebagai alat bantu. Namun, beberapa penelitian telah berfokus pada perubahan ekologi
mikrobioma oral yang berpotensi menjadi salah satu indikator PMI yang disimpulkan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui korelasi mikroba rongga mulut dengan PMI pada model tikus.
Diharapkan untuk menemukan spesies yang berkorelasi signifikan dengan PMI pada tingkat klasifikasi
biologis yang berbeda dan untuk membentuk model regresi linier sederhana yang dapat membantu untuk
memperkirakan PMI secara lebih akurat.

Hasil
Secara total, kami mengumpulkan 24 sampel rongga mulut. Hanya satu sampel tikus jantan dengan PMI 0 jam
tidak berhasil diurutkan, dan sisa 23 sampel berhasil diurutkan. Setelah penyaringan kualitas urutan,
penghapusan sampel yang gagal dan jumlah urutan yang rendah, menggunakan dataset urutan IonS5TM XL
yang mencakup urutan 1722677 16sRNA, diperoleh 1455 OTU. Data sekuensing 16s rRNA telah dikirim ke
database SRA dan nomor aksesinya adalah SRP194019.

Perubahan komunitas bakteri pada tingkat filum selama dekomposisi. Sepuluh bakteri teratas
dengan kelimpahan tertinggi pada setiap kelompok pada tingkat taksonomi yang berbeda dianalisis. Pada
tingkat filum, dalam waktu 240 jam setelah kematian mencit, Proteobacteria dan Firmicutes selalu menempati
posisi dominan. Proteobacteria menunjukkan kecenderungan menurun pertama kemudian meningkat,
sedangkan filum Firmicutes menunjukkan kecenderungan pertama bertambah dan kemudian menurun.
Actinobacteria dan Bacteroidetes adalah filum tertinggi ketiga dan keempat, yang menurun dengan
meningkatnya PMI (Gbr.1A). Ditemukan bahwa perubahan kelimpahan relatif Proteobacteria menunjukkan
korelasi linier positif dengan PMI, (PCCs) koefisien korelasi Pearson = 0,970, p = 0,030 * (Gbr.1B).
Itu Perlu dicatat bahwa pada interval postmortem yang berbeda, mikroba oral mencit pada dasarnya
didominasi oleh filum yang sama, tetapi genus mikroba berbeda (Gambar. 2). Interval postmortem adalah 0
jam yaitu Proteobacteria (Acinetobacter, Pseudomonas, Phyllobacterium, Photobacterium, Vibrio, Arcobacter,
Muribacter), Actinobacteria (Propionibacterium, Rhodococcus), Firmicutes (Ruminococcaceae_UCG-014,
Clostensridiumsridensu_Ractobroupaceae, Pa-7 , Bacteroidetes (Alistipes, Prevotella _9, Marinitilum) dan
Fusobacteria (Fusobacterium, Psychrilyobacter) yang pada dasarnya merupakan mikroba oral tikus. Pada PMI
24 jam, mikroba oral tikus terutama termasuk Firmicutes (Blautia, Enterococcus, Streptococcus,
Faecalbacterium), Proteobacteria (Pasteurella), Bacteroidetes (Bacteroides), Actinobacteria (Bifidobacterium).
Ketika PMI adalah 144 jam, mikroba oral tikus pada prinsipnya terdiri dari Actinobacteria (Staphylococcus,
Subdoligranulum,
Gambar 2.Peta kalor dari 35 genera teratas dari kelimpahan relatif mikroba mulut mencit. Kelimpahan
relatif mikroba oral pada tikus bervariasi dengan PMI.

shigella, Enterobacter). Selain itu, Proteobacteria (Citrobacter, Proteus) yang terutama terdiri dari mikroba oral
pada PMI 240 jam.

Komunitas bakteri di tingkat kelas berubah selama dekomposisi pMi. Di Pada level kelas, saat
PMI 0 jam distribusi mikroba rongga mulut relatif seragam, namun dengan peningkatan PMI maka
kelimpahan relatif Gamma-proteobacteria meningkat, apalagi Alpha-proteobacteria dan Bacteroidia
mengalami penurunan. Bacilli dan Clostridia menunjukkan tren kenaikan pertama dan kemudian menurun
dengan perubahan PMI (Gbr.3A). Kelimpahan relatif Gamma-proteobacteria menunjukkan korelasi linier
positif yang kuat dengan PMI (PCC = 0,998, ** p = 0,002) (Gbr.3B).

Komunitas bakteri pada tingkat ordo berubah selama dekomposisi pMi. Ketika tingkat biologis
diatur, kelimpahan relatif Entero-bakteri meningkat dengan meningkatnya PMI, sedangkan jumlah relatif dari
Pasteurellales, Bacteroidales dan Rhizobiales menurun dengan peningkatan PMI, dan jumlah relatif
Lactobacillales meningkat pertama dan kemudian menurun dengan peningkatan PMI (Gbr. 4A). Hubungan
linier positif antara kelimpahan relatif Enterobacteriales dan PMI adalah yang terkuat pada tingkat orde (PCCs
= 0,979, * p = 0,021) (Gbr.4B).

Perubahan komunitas bakteri di tingkat keluarga selama dekomposisi pMi. Di Pada tingkat
famili, kelimpahan relatif Enterobacteriaceae meningkat dengan meningkatnya PMI meskipun kelimpahan
relatif dari Pasteurellaceaeae dan Phyllobacteriaceae menurun. Sementara itu, kelimpahan relatif
Streptococcaceae, Ruminococcaceae dan Bacteroidaceae menunjukkan kecenderungan meningkat terlebih
dahulu dan kemudian menurun (Gbr.5A). Kami juga menemukan bahwa kelimpahan relatif
Enterobacteriaceae menunjukkan hubungan positif yang tinggi dengan PMI (PCCs = 0,979, * p = 0,021)
(Gbr.5B).
Gambar 3.(A) Kelimpahan relatif kelas bakteri dengan PMI berbeda. (B) Perubahan kelimpahan relatif
Gamma-proteobacteria memiliki hubungan linier kuat positif dengan PMI.

Gambar 4.(A) Kelimpahan relatif ordo bakteri dengan PMI berbeda. (B) Perubahan kelimpahan relatif
Enterobacteriales memiliki hubungan linier positif yang tinggi dengan PMI.

Gambar 5.(A) Kelimpahan relatif famili bakteri dengan PMI berbeda. (B) Perubahan kelimpahan relatif
Enterobacteriaceae memiliki hubungan linier positif yang tinggi dengan PMI.

Perubahan komunitas bakteri pada tingkat genus selama dekomposisi pMi. Di tingkat biologis
genus, dengan meningkatnya PMI, kelimpahan relatif Proteus meningkat, sedangkan kelimpahan relatif
Muribacter dan Phyllobacterium meningkat terlebih dahulu dan kemudian menurun (Gbr.6A). Kelimpahan
relatif Proteus menunjukkan hubungan linier positif yang kuat dengan PMI (PCCs = 0,994, **p = 0,006)
(Gbr.6B).
Gambar 6.(A) Kelimpahan relatif marga bakteri dengan PMI berbeda. (B) Perubahan kelimpahan relatif
Proteus memiliki hubungan linier positif yang kuat dengan PMI.

Gambar 7.Analisis keragaman komunitas mikroba mulut dari PMI yang berbeda. (A) Keragaman alfa jarak
filogenetik (PD) untuk komunitas mikroba pada setiap kelompok. (B) Plot PCoA berdasarkan jarak UniFrac
tidak tertimbang yang menunjukkan perubahan komunitas mikroba selama kematian.

Vs_ grup F. Model R2 Pr (>F)

240 jam-24 jam 7.3247 0,42279 (0,57721) 0,005
240 jam-0 jam 5.7658 0,39048 (0,60952) 0,004
240 jam-144 jam 1.3718 0,12063 (0,87937) 0,265
24 jam-0 jam 2.1598 0,19354 (0,80646) 0,065
24 jam-144 jam 2.9687 0,22891 (0,77109) 0,009
0 jam-144 jam 2.4809 0,21609 (0,78391) 0,012

Meja1.Analisis Perbedaan Kelompok Adonis komposisi komunitas mikroba antar PMI yang berbeda. F. Model
adalah nilai uji F. R2 menunjukkan derajat interpretasi perbedaan sampel dalam kelompok yang berbeda, yaitu
semakin besar rasio varians kelompok terhadap varian total, semakin tinggi derajat interpretasi kelompok
terhadap perbedaan tersebut. Selain itu nilai Pr adalah P, dan kurang dari 0,05 berarti reliabilitas tes ini tinggi.
Nilai residu dalam tanda kurung.

Analisis keragaman suksesi komunitas bakteri. Keragaman alfa komunitas mikroba oral pada tikus
sedikit menurun dengan peningkatan PMI (Gambar. 7A). Komposisi komunitas mikroba mulut pada PMI 144
jam secara dangkal mirip dengan ketika PMI adalah 240 jam (Gbr.7B). Hal ini menunjukkan bahwa dengan
peningkatan PMI, perbedaan individu menurun secara bertahap dan kesamaan komunitas mikroba antara PMI
yang berbeda meningkat. Sementara itu, terdapat perbedaan yang signifikan komposisi komunitas mikroba
antara kedua kelompok selain 240 jam vs 144 jam dan 24 jam vs 0 jam. Ketika waktu kematian relatif
berjauhan, terdapat perbedaan yang signifikan dalam komposisi komunitas (Tabel1).
Kesimpulannya, pada setiap tingkat taksonomi, bakteri dengan korelasi yang signifikan dengan perubahan
PMI ditemukan, dan model regresi linier antara kelimpahan relatif dan PMI dibangun (Tabel2).
 Regresi linier
Jenis Keluarga Memesan Kelas Divisi persamaan R2
Proteobakteri - - - - y = 0,0017x + 0,4547 0.94
Gammaproteobacteria - - - Proteobakteri y = 0,0021x + 0,3558 0,99
Enterobacteriales - - Gammaproteobacteria Proteobakteri y = 0,0035x + 0,0504 0.96
Enterobacteriaceae - Enterobacteriales Gammaproteobacteria Proteobakteri y = 0,0035x + 0,0504 0.96
Proteus Enterobacteriaceae Enterobacteriales Gammaproteobacteria Proteobakteri y = 0,0033x - 0,0444 0,99

Meja2.Klasifikasi dan persamaan regresi linier spesies yang memiliki korelasi signifikan antara kelimpahan
relatif dengan perubahan PMI. Y melambangkan PMI (jam) dan x melambangkan kelimpahan relatif (%)
spesies.

Semakin besar R2, semakin baik derajat kesesuaian persamaan regresi linier tersebut. Oleh karena itu, Gamma-
proteobacteria dan
Proteus adalah kandidat terbaik yang dapat digunakan untuk menyimpulkan PMI, terutama PMI yang
terlambat.

Diskusi
Dalam studi ini, kami menggunakan model tikus, salah satu organisme model terpenting, untuk
mengembangkan alat potensial untuk memperkirakan PMI dengan suksesi komunitas mikroba oral. Jumlah
sampel yang besar memungkinkan kami untuk melakukan percobaan replikasi dengan jumlah sampel yang
banyak untuk meminimalkan kesalahan eksperimental dan menilai sejauh mana variasi intra-individu
mikrobiota yang kita ketahui terdapat pada manusia hidup dan mamalia lain. 23.
Rongga mulut dipilih sebagai titik pengambilan sampel mikroba. Dibandingkan dengan pengambilan
sampel usus yang membutuhkan pembedahan, pengambilan sampel secara oral jauh lebih nyaman. Proyek
Mikrobioma Manusia mengamati bahwa kotoran manusia mengandung mikrobioma yang kaya, sedangkan
rongga mulut relatif terbatas24. Lebih lanjut, Guo et al. mengamati fenomena yang sama pada sampel yang
dikumpulkan dari tikus hidup25. Oleh karena itu, analisis mikroba oral menyederhanakan pekerjaan analisis
kami dan membantu menemukan spesies target yang terkait dengan PMI. Sementara itu, mikroba rongga
mulut merupakan bagian penting dari mikrobiota manusia, hanya sedikit artikel yang fokus pada hubungan
antara suksesi komunitas mikroba rongga mulut dan PMI. Dalam penelitian kami, filum dominan di rongga
mulut mencit adalah Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria dan Bacteroidetes ketika PMI 0 jam, mirip
dengan yang ada di mulut manusia sehat, seperti dilansir HMP 24. Karena rongga mulut bersentuhan langsung
dengan lingkungan luar, maka perubahan mikrobioma mudah dipengaruhi oleh faktor eksternal seperti suhu
dan kelembaban udara, maka kondisi percobaan yang sama dengan pengendalian suhu dan kelembaban serta
pengendalian lainnya dapat dipertahankan. - faktor-faktor tertentu untuk meminimalkan dampak lingkungan
luar. Dalam hal ini, perubahan mikroba rongga mulut dianalisis untuk mendapatkan hasil yang dasar dan
relatif terstandarisasi. Penyelidikan lebih lanjut terkait faktor eksternal perlu dilakukan di masa mendatang.
Dari data saat ini didapatkan satu bakteri pada setiap tingkat taksonomi yang berhubungan dengan
perubahan PMI yaitu, Proteobacteria, Gamma-proteobacteria, Entero-bakteria, Enterobacteriaceae dan
Proteus. Menariknya, semua kandidat ini termasuk dalam Proteobacteria. Proteobacteria adalah filum terbesar
di kerajaan bakteri. Mereka semua adalah bakteri Gram-negatif, yang memiliki bakteri aerob dan anaerob.
Proteobakteri biasanya dikaitkan dengan pembusukan daging dan ditemukan pada kulit hewan yang
disembelih26. Selain itu, mikrobioma oral terutama mencakup bakteri aerob dan bakteri anaerob fakultatif.
Proteus, bakteri dominan, juga anaerob fakultatif, yang mungkin terkait dengan keadaan rongga mulut yang
tertutup saat tikus mati. Oleh karena itu, efek dari keadaan tertutup rongga mulut pada perubahan mikroba
rongga mulut saat mencit mati tidak dapat diabaikan. Di sisi lain, kelimpahan relatif kandidat ini meningkat
dengan peningkatan PMI, tetapi R2 mikroba dengan PMI antara tingkat klasifikasi yang berdekatan tidak
sama, kecuali tingkat ordo dan keluarga. Hal ini mungkin disebabkan oleh keberadaan spesies berpengaruh
lain selain spesies dominan. Perlu dicatat bahwa Enterobacteriales hanya mengandung satu famili
Enterobacteriaceae, sehingga hubungan linier kelimpahan relatifnya dengan PMI adalah sama.
Tidak seperti laporan sebelumnya bahwa kelimpahan relatif Firmicutes menurun terlebih dahulu dan
kemudian meningkat dengan PMI di rongga mulut tikus dan manusia. 19,25, data kami menunjukkan bahwa itu
meningkat terlebih dahulu dan kemudian menurun dengan PMI. Kelimpahan relatif Firmicutes meningkat
pada 24 jam PMI dan kemudian menurun, mirip dengan Bacilli, Lactobacillales, Streptococcaceae dan
Streptococcus. 24 jam adalah titik waktu untuk membedakan PMI awal dari PMI terlambat. Kesimpulannya,
komposisi komunitas mikroba rongga mulut banyak berubah sebelum dan sesudah 24 jam. Sedangkan semua
bakteri yang mengalami perubahan belokan, artinya perubahan kelimpahan relatif spesies dengan
pemanjangan PMI yang pertama menurun kemudian bertambah atau pertama bertambah dan kemudian
menurun, tergolong dalam Firmicutes. Meskipun Firmicutes dilaporkan sebagai salah satu filum utama di usus
manusia (usus, rektum dan sekum) dan sampel tinja. 24,27-30, sayangnya, ini tidak memiliki hubungan linier yang
signifikan dengan PMI. Dalam hasil kami, kelimpahan relatif Actinobacteria telah menurun dengan
peningkatan PMI, yang konsisten dengan laporan sebelumnya pada rongga mulut tikus dan manusia. 19,25.
Actinobacteria tersebar luas di ekosistem darat dan perairan, terutama di tanah, yang berperan penting dalam
daur ulang biomaterial refraktori melalui dekomposisi dan pembentukan humus. 31. Kami juga menemukan
bahwa Gamma-proteobacteria dominan sepanjang interval postmortem pada tikus, yang sesuai dengan laporan
sebelumnya.25. Gamma-proteobacteria menunjukkan kemampuan metabolisme yang berbeda dan terlibat
dalam penguraian molekul yang lebih kompleks 32. Secara keseluruhan, Gamma-proteobacteria mungkin
merupakan kontributor penting untuk proses dekomposisi. Enterobacteriaceae, komponen penting dari
mikroba usus, ditemukan dominan dalam komunitas mikroba mulut di PMI akhir. Ada juga hubungan linier
yang signifikan antara kelimpahan relatifnya dan PMI. Metcalf dkk. 16 juga ditemukan bakteri
Enterobacteriaceae seperti Serratia, Escherichia,
Klebsiella dan Proteus menjadi berlimpah setelah pecah. Mereka secara luas dianggap sebagai patogen
oportunistik yang terkait dengan limbah dan zat hewan. Apakah kombinasi Enterobacteriaceae dalam rongga
mulut dan rongga perut dapat meningkatkan akurasi inferensial PMI perlu dipelajari di masa mendatang.
Kelimpahan relatif dari Proteus sangat rendah pada PMI awal dan lebih tinggi pada mikrobioma dari PMI
akhir, yang mengindikasikan bahwa Proteus lebih cocok untuk prediksi PMI akhir. Kesimpulan yang sama
dicapai pada tikus dan babi25,33. Di sisi lain, Metcalf et al. 34 menemukan bahwa mencit membusuk di tiga jenis
tanah yang berbeda, dan tingkat kesalahan paling rendah + / 2–3 hari dalam 25 hari setelah kematian. Selain
itu, Ismail dkk.35menunjukkan bahwa dalam kondisi yang sama, mikrobioma mati dari berbagai organ dalam
mayat yang sama sangat mirip. Oleh karena itu, keakuratan hasil kami harus serupa dengan laporan
sebelumnya, tetapi keakuratan yang akurat perlu diverifikasi lebih lanjut dengan eksperimen awal.
Singkatnya, Gamma-proteobacteria dan Proteus adalah kandidat potensial terbaik dari komunitas mikroba
mulut untuk estimasi PMI. Karena Enterobacteriaceae juga ada di usus, ia dapat dianggap sebagai kombinasi
dengan perubahannya di usus untuk menyimpulkan PMI.

Bahan dan metode

pengaturan eksperimental dan pengumpulan sampel. Semua prosedur dan protokol eksperimental
hewan dilakukan sesuai dengan undang-undang China tentang Penggunaan dan Perawatan hewan
laboratorium, dan disetujui oleh Komite Etika Hewan (Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan
Institusional dari Universitas Sains dan Teknologi China Timur). Sebanyak 24 tikus dewasa (strain ICR) dibeli
dari Shanghai Slac Laboratory Animal Company (Shanghai, China). Eksperimen laboratorium dilakukan di
Universitas Sains dan Teknologi China Timur di Shanghai, China. Tikus dikorbankan secara manusiawi
dengan menggunakan gas CO2 diikuti dengan dislokasi serviks dan ditempatkan dalam karton bersih dengan
kain kasa kapas steril dan bantalan yang disterilkan dengan UV yang digunakan untuk penyerapan cairan
pembusuk yang dihasilkan oleh mayat dalam percobaan. Temperatur udara selama proses dekomposisi sedikit
berubah dengan temperatur rata-rata 22,4 ° C. Kelembaban relatif berkisar antara 33% sampai 41% (rata-rata
37%).
Kitasecara terpisah mengambil sampel tiga tikus betina dan tiga tikus jantan di empat titik termasuk 0 jam,
24 jam, 144 jam dan 240 jam. Menurut penelitian sebelumnya 16,25,34, 24 jam adalah titik potong antara PMI
awal dan PMI akhir, dan banyak perubahan dalam proses kematian terjadi setelah 24 jam. Kemudian kami
membagi sembilan hari yang tersisa menjadi empat dan lima hari. Jadi PMI yang kami pilih adalah 0 jam, 24
jam, 144 jam dan 240 jam. Penyeka kapas steril suhu tinggi yang dibasahi dengan air aseptik digunakan untuk
menyeka rongga mulut dan dipindahkan ke tabung Eppendorf steril dalam rangkap dua. Empat set sampel
diberi nama sebagai 0 jam, 24 jam, 144 jam dan 240 jam.

Ekstraksi DNA, amplifikasi PCR, dan sekuensing generasi berikutnya. DNA diekstraksi dari
sampel swab yang dikumpulkan menggunakan metode CTAB klasik 36. Elektroforesis gel agarosa digunakan
untuk mendeteksi kemurnian dan konsentrasi DNA. Sampel dengan jumlah yang sesuai dimasukkan ke dalam
tabung Eppendorf, dan sampel diencerkan dengan air aseptik hingga 1 ng / μL.
Untuk sekuensing, DNA genom total menjadi sasaran aplikasi PCR yang menargetkan bagian informatif
dari wilayah variabel 16s rRNA 3 (V3) dan wilayah variabel 4 (V4) menggunakan kumpulan primer bakteri
341F (CCTAYGGGRBGCASCAG) / 806R (GGACTACNNGGGTATCTAAT).
Operasi pengurutan diselesaikan oleh Novegene Co., LTD (Beijing, China). Platform pengurutannya
adalah IonS5TM XL. Metode ujung tunggal digunakan untuk membangun perpustakaan fragmen kecil untuk
pengurutan terminal tunggal.

Pemrosesan data sekuensing rRNA 16s. Pembacaan mentah diperoleh dengan membuang komponen
berkualitas rendah dan memotong barcode dan urutan primer menggunakan Catadapt (Versi 1.9.1) 37. Urutan
chimeric terdeteksi untuk diselaraskan dengan database Gold oleh Algoritma UCHIME dan dihapus untuk
mendapatkan pembacaan yang bersih38,39.

otUpengelompokan dan anotasi spesies. Unit taksonomi operasional (OTU) yang ditentukan oleh 97%
identitas dipilih menggunakan Uparse (Versi 7.0.1001) 40. Sementara itu, urutan representatif, terpilih sebagai
yang paling melimpah di setiap OTU, diserahkan ke Mothur untuk mendapatkan penugasan dan kelimpahan
dari setiap OUT menggunakan database SSUrRNA SILVA pada tingkat taksonomi yang berbeda: filum, ordo,
famili, genus dan spesies (Nilai ambang adalah 0,8-1) 41,42. Terakhir, data dari setiap sampel dihomogenisasi
berdasarkan jumlah minimum data dalam sampel. Analisis keanekaragaman Alpha dan analisis
keanekaragaman Beta selanjutnya didasarkan pada data setelah homogenisasi.

Analisis data 16s rRNA. Berdasarkan hasil anotasi spesies, dipilih sepuluh spesies dengan kelimpahan
tertinggi pada setiap kelompok pada tingkat taksonomi yang berbeda dan dibuat grafik akumulatif kolumnar
sehingga sampel dapat dilihat secara langsung sehingga dapat dilihat secara visual kelimpahan relatifnya.
spesies dan proporsinya pada tingkat klasifikasi yang berbeda. Kami menganalisis apakah ada spesies pada
tingkat taksonomi berbeda yang memiliki hubungan linier langsung dengan PMI dan membuat plot regresi
linier. Selain itu, 35 genera kelimpahan teratas dipilih untuk pengelompokan dan diplot sebagai peta panas.
Ukuran keanekaragaman shannon dan keragaman filogenetik digunakan untuk memperkirakan
keanekaragaman alfa. Model keragaman beta dilakukan dengan melakukan analisis koordinat utama (PCOA)
berdasarkan jarak fraksi tunggal tak tertimbang. Analisis ini dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak
QIIME (Versi 1.9.1) dan perangkat lunak R (Versi 2.15.3). Selain itu, kami menguji perubahan signifikan
pada komunitas mikroba antara PMI yang berbeda dengan analisis Adonis 43,44.
Referensi
1. Brooks, JW & Sutton, L. Dalam Veterinary Forensic Pathology, Volume 1 43–63 (Springer, 2018).
2. Saks, MJ & Koehler, JJ Pergeseran paradigma yang akan datang dalam ilmu identifikasi forensik. Sains 309, 892–895 (2005).
3. Brooks, JW Postmortem Perubahan Karkas Hewan dan Estimasi Interval Postmortem. Patologi Hewan 53, 929 (2016).
4. Saukko, P. & Knight, B. Patologi Forensik Knight. Edisi ke-3. New York: Oxford University Press, 2004.
5. Perper, J. Waktu kematian dan perubahan setelah kematian, Bagian 1. Investigasi Medikolegal Kematian (2006).
6. Dolinak, D., Matshes, E. & Lew, E. Patologi Forensik (2005).
7. Rodrigo, MR A Nonlinear Least Squares Approach to Time of Death Estimation Via Body Cooling. Jurnal Ilmu Forensik 61,
230–233 (2016).
8. Baccino, E. et al. Suhu telinga luar dan waktu kematian. Ilmu Forensik Internasional 83, 133–146 (1996).
9. Eric, B., Cristina, C., Christine, J., Joel, P. & Laurent, M. Tingkat pendinginan telinga dan otak di kepala babi yang terendam
air: implikasi untuk estimasi interval postmortem dari mayat yang ditemukan di air tenang. Am J Forensik Med Pathol 28, 80-85
(2007).
10. Castro, CPE, García, MD, Silva, PMD, Silva, IFE & Serrano, A. Coleoptera minat forensik: Sebuah studi tentang komposisi
komunitas musiman dan suksesi di Lisbon, Portugal. Entomologi Kedokteran & Kedokteran Hewan 232, 73–83 (2013).
11. Villet, MH Entomologi Forensik: Utilitas Arthropoda dalam Investigasi Hukum. African Entomology 18, 387–387 (2010).
12. Tarone,AM & Foran, DR Ekspresi gen selama pengembangan lalat terbang: meningkatkan ketepatan perkiraan usia dalam
entomologi forensik. Jurnal Ilmu Forensik 56, S112-S122 (2011).
13. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, RJ & Silvestre, R. Profiling degradasi RNA untuk estimasi
interval post morterm. PloS one 8, e56507 (2013).
14. Itani, M., Yamamoto, Y., Doi, Y. & Miyaishi, S. Analisis kuantitatif degradasi DNA dalam mayat. Acta Med Okayama 65,
299–306 (2011).
15. Poloz, YO & O'Day, DH Menentukan waktu kematian: perubahan postmortem tergantung suhu pada kalsineurin A, MARCKS,
CaMKII, dan protein fosfatase 2A pada tikus. Jurnal internasional kedokteran hukum 123, 305–314 (2009).
16. Metcalf, JL dkk. Jam mikroba memberikan perkiraan akurat dari interval postmortem dalam sistem model mouse. elife 2,
e01104 (2013).
17. Johnson, HR dkk. Pendekatan pembelajaran mesin untuk menggunakan mikrobioma kulit postmortem untuk memperkirakan
interval postmortem.
PloS satu11, e0167370 (2016).
18. DeBruyn, JM & Hauther, KA Postmortem suksesi komunitas mikroba usus pada subjek manusia yang sudah meninggal. PeerJ 5,
e3437 (2017).
19. Adserias ‐ Garriga, J. et al. Dinamika mikrobiota oral sebagai alat untuk memperkirakan waktu sejak kematian. Mikrobiologi
oral molekuler 32, 511–516 (2017).
20. Wade, W.G. Mikrobioma oral dalam kesehatan dan penyakit. Penelitian farmakologi 69, 137–143 (2013).
21. Dewhirst, FE et al. Mikrobioma mulut manusia. Jurnal bakteriologi 192, 5002-5017 (2010).
22. Janaway,RC, Percival, SL & Wilson, AS Decomposition of Human Remains (2009).
23. Costello, EK et al. Variasi komunitas bakteri di habitat tubuh manusia melintasi ruang dan waktu. Sains 326, 1694–1697 (2009).
24. Huttenhower,C. dkk. Struktur, fungsi dan keragaman mikrobioma manusia yang sehat. alam 486, 207 (2012).
25. Guo, J. et al. Potensi penggunaan suksesi komunitas bakteri untuk memperkirakan interval post-mortem seperti yang
diungkapkan oleh sekuensing throughput yang tinggi. Laporan Ilmiah 6, 24197 (2016).
26. Gill, C. & Newton, K. Ekologi pembusukan bakteri dari daging segar pada suhu dingin. Ilmu daging 2, 207–217 (1978).
27. Eckburg, PB dkk. Keragaman flora mikroba usus manusia. sains 308, 1635–1638 (2005).
28. Bäckhed, F., Ley, RE, Sonnenburg, JL, Peterson, DA & Gordon, JI Host-bakterial mutualisme dalam usus manusia. ilmu
307, 1915–1920 (2005).
29. Turnbaugh, PJ dkk. Mikrobioma usus terkait obesitas dengan peningkatan kapasitas untuk pemanenan energi. alam 444, 1027
(2006).
30. Li, M. et al. Mikroba usus simbiosis memodulasi fenotipe metabolisme manusia. Prosiding National Academy of Sciences 105,
2117–2122 (2008).
31. Tuomisto,S., Karhunen, PJ & Pessi, T. Perubahan post mortem tergantung waktu dalam komposisi bakteri usus menggunakan
PCR kuantitatif real-time. Patogen usus 5, 35 (2013).
32. Dickson, GC, Poulter, RT, Maas, EW, Probert, PK & Kieser, suksesi bakteri JA Marine sebagai indikator potensial interval
perendaman postmortem. Ilmu forensik internasional 209, 1–10 (2011).
33. Pechal, JL dkk. Potensi penggunaan suksesi komunitas bakteri dalam forensik seperti yang dijelaskan oleh sekuensing
metagenomik throughput yang tinggi. Jurnal Internasional Kedokteran Hukum 128, 193-205 (2014).
34. Metcalf, JL dkk. Perakitan komunitas mikroba dan fungsi metabolisme selama dekomposisi mayat mamalia. Ilmu 351,
158–162 (2016).
35. Can, I., Javan, GT, Pozhitkov, AE & Noble, PA Tanda tangan thanatomicrobiome khas yang ditemukan dalam darah dan organ
dalam manusia. Jurnal metode mikrobiologi 106, 1-7 (2014).
36. Porebski, S., Bailey, LG & Baum, BR Modifikasi protokol ekstraksi DNA CTAB untuk tanaman yang mengandung komponen
polisakarida dan polifenol tinggi. Reporter biologi molekuler tumbuhan 15, 8-15 (1997).
37. Martin, M. Cutadapt menghapus urutan adaptor dari pembacaan urutan throughput tinggi. EMBnet. jurnal 17, 10-12 (2011).
38. Edgar, RC, Haas, BJ, Clemente, JC, Quince, C. & Knight, R. UCHIME meningkatkan sensitivitas dan kecepatan deteksi chimera.
Bioinformatika 27, 2194–2200 (2011).
39. Haas, BJ dkk. Pembentukan dan deteksi sekuens rRNA 16S Chimeric dalam Sanger dan amplikon PCR 454-pyrosequenced.
Penelitian genom 21, 494-504 (2011).
40. Edgar, RC UPARSE: urutan OTU yang sangat akurat dari amplikon mikroba membaca. Metode alam 10, 996 (2013).
41. Wang,Q., Garrity, GM, Tiedje, JM & Cole, JR Naive Bayesian classifier untuk penugasan cepat urutan rRNA ke dalam
taksonomi bakteri baru. Appl. Mengepung. Mikrobiol. 73, 5261–5267 (2007).
42. Quast, C. et al. Proyek database gen RNA ribosom SILVA: pemrosesan data yang lebih baik dan alat berbasis web. Penelitian
asam nukleat 41, D590 – D596 (2012).
43. Anderson, MJ Sebuah metode baru untuk analisis varians multivariat non-parametrik. Ekologi Austral 26, 32-46 (2001).
44. McArdle, BH & Anderson, MJ Menyesuaikan model multivariat dengan data komunitas: komentar tentang analisis redundansi
berbasis jarak. Ekologi 82, 290–297 (2001).

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini disponsori oleh dana dari National Natural Science Foundation of China (31671309), dan Proyek
Pembukaan Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence (2018XCWZK13), dan Proyek
Pengembangan Laboratorium Kunci Qinghai (2017-ZJ-Y10).
Kontribusi penulis
KD dan PS menulis teks munuskrip utama dan menyiapkan semua gambar. WL mengawasi proyek dan
membantu penulisan naskah. PS, MP, ZH dan JS merancang percobaan dan berpartisipasi dalam penulisan
naskah. KD, YX dan FC melakukan percobaan. Semua penulis meninjau naskah.
Informasi tambahan
Minat Bersaing: Penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.
Catatan penerbit:Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang
diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.
Akses terbukaArtikel inidilisensikan di bawah Lisensi Internasional Creative Commons
Attribution 4.0, yang mengizinkan penggunaan, berbagi, adaptasi, distribusi, dan reproduksi
dalam media apa pun atau
format, selama Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, berikan tautan ke
lisensi Cre- ative Commons, dan tunjukkan jika ada perubahan. Gambar atau materi pihak ketiga lainnya
dalam artikel ini termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel, kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit
untuk materi tersebut. Jika materi tidak termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel dan penggunaan
yang Anda maksudkan tidak diizinkan oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang
diizinkan, Anda perlu mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi ini,
kunjungihttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

© Penulis 2019