Praktikum Pemeriksaan kadar Malondialdehid (MDA)

Pengukuran kadar MDA dilakukan dengan metode Wills. Prinsipnya adalah mereaksikan

MDA dengan asam tiobarbiturat sehingga terbentuk senyawa berwarna yang memberikan

serapan maksimal pada panjang gelombang 530 nm. Bahan yang digunakan dapat berupa:

plasma darah, homogenat jaringan, larutan asam trikloroasetat (TCA) 20%, larutan asam

tiobarbiturat (TBA) 0,67% dan larutan standar tetraetoksipropan. Pemeriksaan kadar MDA dapat

dilakukan dengan menggunakan sampel bahan dari plasma darah dan atau homogenat hati tikus

puasa dan tikus tidak puasa

Tujuan Parktikum Pemeriksaan kadar Malondialdehid (MDA)

Tujuan praktikum ini adalah untuk menetapkan kadar peroksida lipid dengan mengukur

kadar MDA dalam plasma darah dan homogenat hati tikus puasa dan tikus tidak puasa.

Dasar Teori Pemeriksaan kadar Malondialdehid (MDA)

Hasil peroksidasi lipid (MDA) bila direaksikan dengan asam tiobarbiturat (TBA) akan

membentuk senyawa berwarna merah muda yang menyerap cahaya pada panjang gelombang

530 nm.

Bahan untuk Pemeriksaan kadar Malondialdehid (MDA)

1. Plasma darah dan homogenat hati tikus puasa dan tidak puasa

2. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 20%

3. Larutan tiobarbiturat (TBA) 0,67% (dibuat baru)

4. Larutan tetraetoksipropan 1,5 nmol/60 µl (pengenceran 1/80.000 kali) untuk standar

MDA. Kadar MDA setelah pengenceran adalah 0.0003125 nmol/ml

5. Akuades
Alat untuk Pemeriksaan kadar Malondialdehid (MDA)

1. Microtube 1,5mL dan 2mL

2. Micropipet

3. Whitetips, bluetips, yellowtips

4. Vorteks

5. Spektrofotometer

6. Kuvets

7. Sentrifuge

8. Penanggas air

9. Boks es

Cara Kerja Pemeriksaan Kadar Malondialdehid (MDA)

Memipetkan ke dalam tabung reaksi:

Uji (duplo)
Konsentrasi standar
Plasma darah Homogenat hati
Bahan Blanko (duplo) (10-3 nmol/mL)
Tikus Tikus
0.625 1.25 2.5 5 Puasa Tidak puasa Puasa Tidak puasa

Akuades (L) 400 399 395 390 380 - - - -

Standar (L) - 1 5 10 20 - - - -

Plasma (L) - - - - - 400 400 - -

Homogenat (L) - - - - - - - 400 400

TCA 20% (L) 200 200 200 200 200 200 200 200 200

Vorteks
Sentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit, ambil supernatant

TBA 0.67% (L) 400 400 400 400 400 400 400 400 400

Masukkan ke dalam penangas air 95o - 100o C selama 10 menit. Kemudian dinginkan.
Setelah itu dibaca serapannya pada panjang gelombang 530 nm.

Terhadap masing-masing standar Tetra Etoksi Propan (TEP) yang diencerkan 1:80.000

sebanyak 400µL ditambahkan 200 µL TCA 20% lalu divortex sehingga terlihat campuran

menjadi keruh. Campuran kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.

Supernatan dipisahkan untuk pemeriksaan selanjutnya dan ampasnya dibuang. Sebanyak 400 µL

TBA 0,67% ditambahkan terhadap supernatan dan dilanjutkan dengan pemanasan di atas

penangas air 960C selama 10 menit. Setelah itu larutan disentrifugasi kembali pada 5000 rpm

selama 5 menit dan dibaca serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 530

nm.

Sampel plasma/homogenat jaringan dipipet ke dalam tabung ependorf (microtube) 1,5mL

sebanyak 50 µL dan diencerkan dengan air sebanyak 350 µL. Larutan ini ditambahnan 200 µL

TCA 20% lalu divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.

Supernatan diambil dan ditambahkan 400 µL TBA 0,67%, kemudian dipanaskan di atas

penangas air 960C selama 10 menit. Setelah itu larutan disentrifugasi kembali pada 5000 rpm

selama 5 menit dan dibaca serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 530

nm.

Hasil dan Pembahasan Pemeriksaan Kadar Malondialdehid (MDA)

Malondialdehid tidak stabil pada suhu ruang sehingga dilakukan dengan pembuatan

kurva standar MDA menggunakan tetraetoksipropan (TEP), yaitu senyawa yang bila terhidrolisis
oleh air akan menghasilkan MDA dan alkohol. Kurva standar TEP dibuat dengan mereaksikan

berbagai macam konsentrasi mulai dari kadar 0.625 nmol/mL sampai 5 nmol/mL. Salah satu

kurva standar MDA dapat dilihat pada Gambar 8.

0.3
0.25
Kurva standar MDA
f(x) = 0.07 x + 0.06
0.2 R² = 1
seraoan

0.15
0.1
0.05
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
kadar (nmol/mL)

Gambar 8. Kurva standar pengukuran MDA menggunakan tetraetoksipropan

Hasil pengukuran kadar Malondialdehid (MDA) plasma darah dan homogenat hati tikus dapat

dituliskan pada Tabel 1.